GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究
甲状腺转录因子-1融合表达载体的构建及体外活性鉴定
Ｃ Ｈ Ｅ Ｎ Ｇ Ｆ ｅ ｎ ｇ ＇ ｚ ＇ Ｓ Ｈ Ｅ Ｎ Ｇ Ｙ ａ ｎ ２ ， Ｐ Ａ Ｎ Ｃ ｈ ｕ ｎ － ｍ ｉ ｎ ｆ ，Ｃ Ｈ Ｅ Ｎ ｙ
获 得 的体 外翻 译 蛋 白 Ｔ Ｆ Ｆ １是 否具 有 与下 游 靶 基 因 Ｕ Ｇ Ｒ Ｐ １启 动 子结 合 的能 力 。结 果 ： 成 功构 建 了含 １ Ｔ ｒ Ｆ １编码 基 因 的真 核
表达 载体 ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ ／ ｍ ｙ ｃ — Ｈ ｉ ｓ （ 一 ） Ｃ ～ ｒ ｒ Ｆ １， 并 能在 体 外表 达 １ Ｔ Ｆ １蛋 白。 结 论 ： 能方 便 地 获 得 １ Ｔ ｒ Ｆ １ 体外翻译蛋 白， 为 进 一步 研究１ ｒ ｒ Ｆ ｌ 蛋 白 与相 应 的 Ｄ Ｎ Ａ 反 应元 件 及 其他 转 录 因子 的相 互 作 用 莫定 了基 础 。 ［ 关键 词 ］ 甲状腺 转录 因子一 １ ； 真核表达 ； 转录 翻 译 ； 电泳 迁 移 率 变 动分 析
Ｓ ＨＩ Ｊ ｉ ｎ ｇ － ｙ ｉ ２ ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｚ ｈ ｉ ￣ ，Ｂ Ａ１ Ｘｕ ｅ － ｔ ａ ｏ ２ ，Ｓ ＯＮＧ Ｈｕ ａ ｉ － ｄ ｏ ｎ ｇ ：
１ ． Ｐ Ｌ Ａ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ，Ｆ ｕ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ，Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ Ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｙ Ｃ ｏ ｍ ｍａ ｎ ｄ ，Ｆ ｕ ｚ ｈ ｏ ｕ ３ ５ ０ ０ ２ ５ ；２ ． Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋ ｅ ｙ
基因工程-简界
研究目的决定
载体选择后，对基因克隆方法具有一定的 指导作用。
2. 选择、构建合适的载体
（1）载体的分类
根据宿主的对象
原核
真核
根据载体的性质
质粒 病毒
根据功能
克隆 表达
2. 选择、构建合适的载体
（2）质粒（plasmid）
独立于染色体外的能够进行自我复制的共价、 闭环、双链的DNA分子 严紧型质粒
主要内容
基因工程的发展史简介
基因工程的基本原理
基因工程的应用
基因工程发展简史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验
1822-1884
基因工程发展简史
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验
1877-1955
基因工程发展简史
1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶
15K左右
真核复制起始点
若真核载体？
原核表达载体---Pharmacia
Tac Promoter GST-融合蛋白 GST标签
原核表达载体---Promega
T7启动子控制
体外转录 SP6 T3
原核表达载体---Merck
T7启动子控制 TrxA标签 His标签
Smith HO, Wilcox KW.
A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol. 1970;51(2):379-91
Hamilton O. Smith 美國 霍普金斯大 學醫學院 1931年--
表达可控性 加入药物后不表达
酵母单杂交技术
酵母单杂交技术1．酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
酵母单杂交原理示意图2．酵母单杂交技术的特点酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。
应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。
近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。
随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。
采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
热—酵母双杂交
酵母双杂交酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i 。
典型的真核生长转录因子，如GAL4 GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
基本原理二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白—蛋白的相互作用。
主要有二类载体：a 含DNA -binding domain 的载体；b 含DNA-activating domain 的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenee)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用bin di ng-doma in 基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli 转录抑制因子)的DNA-bd 编码序列。
常用的activating-domain 基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
酵母双杂交
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain 的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核诓拍芮 ǜ婊 虻淖 肌＠ 鏕AL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad 没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交技术
在生命活动中， DNA的复制、转录、RNA的剪接、蛋白质的翻译和分泌以及细胞周期的调节、信号传导和诸多代谢过程都是各种相关蛋白质有机相互作用的结果。
细胞或组织中的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。
随着分子生物学实验技术的飞速发展，近10年来，发展了一些研究蛋白--蛋白相互作用的方法，其中以Fields和Song创立的酵母双杂交技术为最佳。
该方法利用酵母生长速度快，且容易操作的特点，在其体系中研究哺乳动物细胞的蛋白--蛋白间的相互作用，通过筛选cDNA文库，找到与感兴趣蛋白相互作用的蛋白。
1．原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA 结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
水稻TOS17突变体库的创建与应用
⽔稻TOS17突变体库的创建与应⽤1⽂献综述1.1⽔稻基因组学研究现状⽔稻全基因组测序⽔稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮⾷作物之⼀，全世界有⼀半的⼈⼝⾷⽤它，⽔稻年总产量占世界粮⾷作物产量第三位，维持较多⼈⼝的⽣活。
亚洲是世界⽔稻主产区，近年稻⽶产量占世界的90%以上，年产量占亚洲的38%。
⼤⽶作为我国主要粮⾷种类，在养活我国13亿⼈⼝和改善我国居民营养结构中具有举⾜轻重的影响。
同时，⽔稻⼜以其基因组相对较⼩(～430Mbp)，⾼效的遗传转化体系，与⽟⽶、⼤麦和⼩麦等其它⽲本科作物在基因组上存在明显的共线性，⽽成为研究单⼦叶植物的模式植物。
国际⽔稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)⽇本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、⽇本、美国等是⼗个国家参与，所采⽤的⽅法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由⽇本和中国科学家率先公布了第1、4染⾊体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9⽉第10条染⾊体的全长序列由美国Clemson⼤学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。
2005年8⽉⽔稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。
IRGSP公布的⽔稻“⽇本晴”精确序列经过分析表明：(1) ⽔稻“⽇本晴”基因组⼤⼩为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染⾊质和两个完整的着丝粒；(2)整个基因组中包含⼤约37544个⾮转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对⽐分析发现，拟南芥90%的基因在⽔稻中可能存在同源物；(4) ⽔稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) ⽔稻基因组中转座元件的数⽬和种类与⽟⽶和⾼粱基因组共线性区段的扩张是⼀致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。
酵母双杂交
• 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白 质之间相互作用的影响 • 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之 间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采 取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病 的目的。 • 例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发 现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5） 与拓扑异构酶 NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin 的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这 些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基 因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病 毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
• 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map） • 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是 彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基 因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序 和序列分析发现了很多新的基因和EST序列， HUA等人利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立 基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活 动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
• 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高 度敏感性。主要是由于： ①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。 ②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉 淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号 强度。 ③ 杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合 形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。 ④ 通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母 表型、X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
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GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究 张 萍1，应 磊1，钱关祥1，徐 让2 【摘 要】［摘要］目的 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有上游激活序列(UAS)启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体组成的GAL4/VP16-UAS系统，观察融合转录因子GAL4/VP16的活性。方法 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA3-GAL4/VP16，含有5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因核心启动子的人工杂合启动子驱动报告基因EGFP的表达载体pGL3-G5E1b-TATA-EGFP，利用脂质体将两种载体瞬时转染Hep3B和HEK293细胞，48h后采用RT-PCR和流式细胞术检测EGFP的表达，观察GAL4/VP16融合转录因子对G5E1B-TATA的转录调节作用。结果 在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下，G5E1b-TATA启动子活性明显上调，甚至可以达到巨细胞病毒(CMV)启动子的活性程度。结论 GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用，并且该转录活性足以达到驱动下游目的基因高效表达的水平，在基因治疗和基因功能的研究中具有一定的应用潜力。 【期刊名称】上海交通大学学报（医学版） 【年(卷),期】2013(033)004 【总页数】5 【关键词】［关键词］GAL4/VP16;人工转录因子;增强型绿色荧光蛋白 人工转录因子是人为构建的，在自然界中并不存在，具有新的序列特异性和作用效果。它可以将2种天然转录因子的DNA结合结构域和效应结构域进行组合得到新的融合蛋白，亦可模拟天然转录因子的DNA结合结构域和效应结构 域设计合成新的转录因子。人工转录因子通过识别DNA上的结合位点在转录水平调控目的基因的表达，可通过少量的人工转录因子起到良好的调控效果，在基因功能的基础研究、药物设计以及基因治疗等领域均有广泛应用［1－3］。 酵母转录调节蛋白GAL4是一种调控真核细胞内基因表达的工具，与上游激活序列(up-stream activating sequence，UAS)结合后激活靶基因的转录，GAL4-UAS系统已被广泛应用于基因表达调控的研究［4，5］。人工合成的融合转录因子 GAL4/VP16是对酵母转录因子GAL4蛋白改造后的产物，用VP16的激活结构域替换GAL4的激活部位，含有GAL4蛋白的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域具有更强的调节功能［6］。 本研究构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有UAS序列启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表达载体，组成GAL4/VP16-UAS系统，转染细胞后观察融合转录因子GAL4/VP16的活性，为该系统进一步在基因功能研究、基因治疗等领域中的应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞 肝癌细胞株Hep3B、人胚肾细胞株HEK293来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。 1.1.2 菌种和质粒 DH5α和pcDNA3购自Invitrogen公司。质粒 pcDNA3-EGFP、pGL3-G5E1b、pGL3-Basic-EGFP和pcmv-GAL4/VP16由应磊博士馈赠。 1.1.3 主要试剂和仪器 T4DNA连接酶、限制性内切酶、Klenow酶、100bp DNA Marker购自NEB公司;λDNA/HindⅢ DNA Marker购自 MBI Fermentas公司;DNA MarkerⅣ购自东盛科技公司;质粒DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自QIAgene公司;dNTP和Taq DNA聚合酶购自Promega公司;TRIzol试剂、RNasin RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶、随机引物、Opti-MEM和Lipofectamine2000脂质体均购自Invitrogen公司;DMEM培养液购自Gibco公司，小牛血清购自Hyclone公司;其余试剂均为进口分装或国产分析纯。FACS Calibur流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。 1.2 方法 1.2.1 pcDNA3-GAL4/VP16表达载体的构建 pcDNA3经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后，琼脂糖电泳回收约5.4 kb的载体片段。pcmv-GAL4/VP16(应磊博士提供)经BglⅡ和 XbaⅠ双酶切后，琼脂糖电泳回收772 bp的GAL4/VP16融合基因片段。将两片段T4 DNA连接酶连接，构建含GAL4/VP16融合基因的表达载体，称为pcDNA3-GAL4/VP16。转化、扩增重组质粒，少量抽提质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确后大量扩增重组质粒。 1.2.2 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP 表达载体的构建质粒 pGL3-Basic-EGFP经 SacⅠ和HindⅢ双酶切后，琼脂糖电泳回收约4.0kb的载体片段。pGL3-G5E1b经SacⅠ和HindⅢ双酶切后，回收164 bp的G5E1b-TATA片段。将两片段T4DNA连接酶连接，构建pGL3-G5E1b-TATA-EGFP表达载体。转化、扩增重组质粒，少量抽提质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确后大量扩增重组质粒。 1.2.3 细胞培养和质粒转染 用含10%小牛血清的DMEM培养液，在37℃、 5%CO2的条件下培养Hep3B和HEK293细胞。每孔接种2×105～5×105个细胞于6孔板中，培养24h后(细胞生长至80%～90%融合度)进行Lipofectamine2000脂质体介导的DNA转染，按照操作说明进行转染。将待转染细胞分成3组。实验组:共转染质粒pcDNA3-GAL4/VP16和pGL3-G5E1b-TATA-EGFP;阳性对照组:仅转染质粒pcDNA3-EGFP;阴性对照组:仅转染质粒 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP。转染48h后裂解收获细胞，每组至少重复3次转染实验。 1.2.4 RT-PCR检测EGFP mRNA的转录 6孔板中的细胞转染48h后，按照说明书使用TRIzol试剂提取细胞总RNA。RNA反转录得到cDNA作为模板进行PCR扩增。扩增EGFP的引物序列:5'-CCATG GTGAGCAAGGGC-3'(上游);5'-CGCCGCTTTACTTG TAC-3'(下游);产物长度729 bp;扩增GAPDH的引物序列:5'-TGGGGAAGGTGAAGTCGG-3'(上游);5'-CTGGAAGATGGTGATGGGA-3'(下游);产物长度233 bp。反应体系50μL，扩增条件:95℃ 3min;96 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90s，共 27 个循环;最后，72℃延伸10min。在进行 RT-PCR时，设置以mRNA为模板的空白对照组。 1.2.5 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测 EGFP基因的表达 6孔板中的细胞转染48h后，经胰酶消化，用1×PBS洗涤细胞2次，含1%甲醛的PBS固定细胞后，流式细胞仪检测Hep3B和HEK293细胞株中EGFP表达阳性的细胞数和平均荧光强度。实验重复3次，选择3次实验中最典型的一次。 2 结果 2.1 重组质粒的鉴定 质粒pcDNA3-GAL4/VP16和pGL3-G5E1b-TATAEGFP通过酶切后电泳，酶 切图谱证明质粒构建成功。pcDNA3-GAL4/VP16质粒经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后得到5.4 kb的载体片段与788 bp的 GAL4/VP16片段(图1);pGL3-G5E1b-TATA-EGFP质粒经XbaⅠ单酶切后得到825 bp左右的TATA-EGFP片段，经XbaⅠ和NcoⅠ酶切后得到759 bp左右的EGFP片段，经SacⅠ和 NcoⅠ酶切后，得到197 bp左右的G5E1b-TATA片段(图2)。对质粒pcDNA3-GAL4/VP16和 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP进行测序，证实GAL4/VP16融合基因、G5E1b-TATA-EGFP的序列正确。 2.2 Hep3B和HEK293细胞中EGFP基因的转录 2.2.1 RT-PCR法检测 在Hep3B和HEK293细胞中，共转染 pcDNA3-GAL4/VP16和 pGL3-G5E1b-TATA-EGFP质粒的细胞EGFP基因转录生成的mRNA表达量明显高于单独转染pGL3-G5E1b-TATAEGFP质粒的细胞，转录活性与巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子接近，提示GAL4/VP16融合人工转录因子能够高效地与G5E1b-TATA启动子作用，增强EGFP基因转录(图3)。 2.2.2 FCM检测 在Hep3B和HEK293细胞系中，实验组G5E1b-TATA启动子在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下，转录活性明显高于阴性对照组，甚至达到CMV启动子(阳性对照组)的活性(图4)。 3 讨论 人工转录因子可以进行模块化设计，通过改变DNA结合结构域灵活选择其作用靶点，改变功能结构域对靶基因进行激活、抑制等产生不同的调控作用，具有简便、灵活的优点，广泛应用于基因功能研究、药物设计以及基因治疗等领域［1－3］。 酵母GAL4基因表达系统是目前了解最透彻的真核细胞转录调节系统之一，已经被广泛应用于基因工程的许多领域。在酵母中，GAL4基因的上游有一段上游激活序列(up-stream activating sequence，UAS)，UAS属于启动子近侧元件，其下游附近有一段类似于TATA盒的“AT”丰富区。酵母调节蛋白GAL4特异结合于UAS，然后使GAL1和GAL10基因特异转录［7，8］。在 UAS中，真正与 GAL4蛋白结合的核心部位是一段4个拷贝串联排列的重复序列，其中单个拷贝包括17个碱基对，序列为5'-CGGAG TACTGTCCTCCG-3'［9］。GAL4 蛋白通过 DNA 结合结构域(GAL4 DNA binding domain，GAL4 BD)特异地与这段序列结合进一步调节下游基因的表达。GAL4不存在于哺乳动物细胞内，并且只有在识别UAS时才能激活目标基因，使启动子下游基因转录，具有良好的特异性与可诱导性。这一系统在控制目的基因在培养的哺乳动物细胞中有序表达方面得到广泛应用，如在疱疹病毒介导的转基因实验中，用于控制不利的病毒基因的表达［10］;在动物实验水平，已成功应用于果蝇和转基因小鼠的基因靶向表达［11］。 为了将这一基因转录调节系统更好地应用于基因工程，人们对此作了一系列改造。首先，人工合成一段G5E1b-TATA启动子，包含了5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因上游的核心启动子5'-TATATAA-3'。其中，核心启动子5'-TATATAA-3'能招募RNA聚合酶启动转录，但其活性较低;UAS序列能够与GAL4蛋白(反式作用因子)的DNA结合结构域结合，进一步通过该反式作用因子的转录激活结构域增强启动子的活性。我们采用5个拷贝的串联排列序列，比原始序列多了一个拷贝以增加转录因子与其结合的概率［12］。其次，融合转录因子GAL4/VP16，即将GAL4蛋白的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒