蛋白激酶检测方法
激酶活性测定方法
激酶活性测定方法
激酶活性测定方法是用来测量生物体内激酶酶活性的实验方法。
激酶是一种能够催化底物分子转化为产物的酶，通常通过磷酸化底物来进行催化反应。
常见的激酶活性测定方法包括：
1. 放射性测定：将激酶反应体系中的底物标记上放射性同位素，通过测量反应产生的放射性底物酶解产物，来确定激酶的活性。
2. 荧光测定：利用荧光标记的底物，通过测量反应产生的荧光强度变化来测定激酶的活性。
常见的方法有荧光共振能量转移（FRET）和荧光极化。
3. 酶促颜色反应：将激酶反应体系中的底物溶液与某种荧光标记的酶结合，通过测量荧光强度的变化来测定激酶活性。
4. 无标记测定：利用质谱等无标记技术，通过测量激酶反应产物与底物的质量比，来确定激酶的活性。
需要注意的是，选择合适的激酶活性测定方法需要考虑到底物特性、实验操作的可行性和灵敏度等因素，并且需要与其他实验数据进行比较与分析，从而得出准确可靠的结果。
小鼠蛋白激酶 G（PKG）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
小鼠蛋白激酶G（PKG）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆、组织等样本中蛋白激酶G（PKG）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠蛋白激酶G（PKG）水平。
用纯化的小鼠蛋白激酶G（PKG）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入小鼠蛋白激酶G（PKG），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的小鼠蛋白激酶G（PKG）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠蛋白激酶G（PKG）含量。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。
酪氨酸蛋白激酶活性的检查
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人 工 血 管 研 制 概 况
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新 技术
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酪氨酸 蛋 白激酶活性的检 查
北 京 医 院 老 年 医 学研 究 所
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蛋白激酶检测方法
1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′- TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAAG2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
激酶抑制剂测试-检测方法详细介绍
4E-BP1可被专一性的抗磷酸化4E-BP1的抗体识别，并结合标记了辣根过氧化素酶的抗抗
汉 体，随后加入化学发光试剂并检测发光强度，以发光强度的大小反映酶活的高低。 ELISA法的优点是定量准确，信号值可以通过二级抗体或者亲和素-生物素系统放大，
Adapta™。其中ADP Hunter™可以利用激酶反应中产生的ADP，将烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate, PEP)转化为丙酮酸(pyruvate)，并最终转化为荧光信号。该方法可以 实时监测激酶的活性变化。而Transcreener™和Adapta™则是在ADP的特异性单克隆抗体上 标记铕(Eu)原子，同时再使用d2或者AlexaFluour647等荧光分子标记的ADP来竞争激酶反应 的产物ADP，用于检测ADP的生成量。 3.2.3 检测ADP生成量的方法的优缺点
2.4 核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
NMR的原理是用无线电波(60 cm~300 m)照射分子时，原子核自旋能级的跃迁，由于局 部抗磁屏蔽效应的存在，不同化学环境的原子核所吸收的频率不同，从而产生不同的化学
武 位移。常见的NMR有氢谱、碳谱、氮谱等等。氢谱主要研究氢分布，碳谱研究碳骨架的信
两类。
汉 1.1 膜过滤方法 在该方法中，激酶反应使得多肽产物被32P -ATP或者33P -ATP标记。该产物会结合在过
合 滤膜上，而其他游离的放射性同位素则会被磷酸盐洗脱，从而不会干扰实际检测。其主要
优势在于可以应用于激酶和多肽底物的检测上而不受其他条件的限制。该方法不需要对多
蛋白酶活性测定方法
2.0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。
4.L—酪氨酸。
5.缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。
A：0.2mol/L KH2PO4 (ml): 50;
1.5操作步骤
将酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试管中，按以下程序操作。
酶液1ml——————————————在30℃恒温水浴中预热1—2min
+
2%酪蛋白1ml——————————加入时立即记时，精确反应10min
+
0.4MTCA 2ml—————————立即摇匀，终止反应。
将各管剧烈混合并在30℃保持30min，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。
从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸）
+
滤液1ml
+
0.4Байду номын сангаасNa2CO35ml
+
稀释福林试剂1ml
摇匀，30℃恒温水浴显色20分钟
测定OD值————————用720型分光光
度计测定（波长680nm）
空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。
B：0.2mol/L NaOH(ml) 29.63
C：水（ml）120.37
PH（20℃）：7.0
6．酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使用。
热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。
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1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达
用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′-
TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAA
G2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃ 5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达
（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
采用图像分析仪分析蛋白条带灰度。
参考文献：孔垂泽，张哲，杨琦，孙丹，苗淼.蛋白激酶Cα在肾癌组织中的表达及临床意义
1.信号通路阻断剂法
阻断剂法是应用信号通路阻断剂( inhibitor) ,阻断其相对应的信号通路,再设立对照组或空白组,分别检测其相关生物学性状的变化,从而研究该信号通路的生物学作用。
2.蛋白质印迹分析(Western Blot)
利用Western B lot可以检测变化的蛋白质,进而推断出信号通路的变化及作用。
主要原理是:采用聚丙烯酰胺凝胶对被检测的蛋白质进行电泳,利用特异性抗体(一抗)与它所对应的抗原结合后,再用二抗使其显色。
通过分析着色的位置和
着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
阻断剂法需要的是特异性的阻断剂,Western blot需要的则是特异性的抗体(一抗) 。
3.聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reac2tion, PCR)
RT - PCR技术的基本原理是:首先经反转录酶的作用由RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。
RT - PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中的基因表达水平、细胞中RNA的含量和直接克隆特定基因的cDNA 序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
Real - time PCR技术引入了一种荧光化学物质,其荧光强度会随着PCR产物的量变化而变化,可通过监测荧光来测定PCR 产物的量。
在PCR扩增期间,通过监测每一个循环荧光信号的强弱变化来即时测定特异性产物的量,从而实现对起始模板定性及定量的分析。
而且在整个过程中不需要取出PCR 产物进行电泳。
RT - PCR技术可用于半定量表达的检测,对基因的表达量进行比较,但不能检测PCR 信号放大之前的起始模板量; 而Real - time PCR技术则可以更精确的定量,在具体实验中可以根据需要来选择合适的方法。
4.RNA干涉(RNAi)
RNAi的作用机制可能是细胞内的双链RNA 在Dicer酶的作用下,形成小干扰RNA ( small interfering RNAs, siRNAs) ,siRNAs可进一步结合到核酸酶上并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制该基因在细胞内的翻译和表达。
5.荧光共振能量转移技术( Fluorescence rc-sonance energy transfer, FRET)
其主要原理是:应用荧光蛋白作为供体分子和受体分子,受到激发的荧光团可将能量通过偶极子- 偶极子作用将能量转移到另外一个受体,引起第二个荧光团的激发。
一旦发生了能量的转移,供体和受体之间必然存在供体荧光的淬灭和受体荧光活化的相关性。
而一些细胞因子在激活p38MAPK的过程中就有这种受体与配体之间的相互作用,就可以观察这个被激活受体和p38MAPK信号通路的相关性。
外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为是通过胞膜上的受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰,介导信号传递. 而FRET就可以用来研究受体和配体之间的相互作用。
基因芯片(Gene chip)
参考文献：解文博，叶玲.p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路的部分研究方法
免疫胶体金技术检测蛋白激酶定位
参考文献：张琳, 张璐, 朴英杰.应用改良的免疫胶体金包埋方法检测p38 蛋白激酶在Raw 细胞中的定位。