茶树RAPD分析体系的优化

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平邑甜茶发根农杆菌介导转化体系构建与优化

平邑甜茶发根农杆菌介导转化体系构建与优化周雪婷;武凯凯;崔蓝芳;张坤玺;白团辉;史江莉;焦健;王苗苗;刘昱;赵玉洁;万然;郝鹏博;郑先波【期刊名称】《果树学报》【年(卷),期】2024(41)5【摘要】【目的】建立并优化平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)幼苗简单、高效、快速的发根农杆菌转化体系。

【方法】以不同苗龄的平邑甜茶幼苗为材料,使用携带GFP及GUS过表达质粒的发根农杆菌K599,通过注射法、活化菌液浸染及菌株涂抹方法侵染平邑甜茶根颈部诱导毛状根,利用GFP荧光检测、GFP蛋白印迹检测、DNA检测和GUS染色方法进行转基因株系验证,同时对成功转化株系根、茎、叶组织的表达量进行分析,检测发根农杆菌在转化平邑甜茶株系中的迁移性。

【结果】不同苗龄平邑甜茶幼苗诱导毛状根能力具有较大差异,其中三叶龄幼苗诱导毛状根率最高,为96%,五叶龄幼苗最高的毛状根诱导率为65%,以使用菌株涂抹方式转化植株的毛状根分布为最佳、毛状根诱导率为最高。

发根农杆菌在成功转化株系中存在随机向地上部迁移的现象,并能够整合目的基因至叶片叶柄及部分主叶脉基因组中,但在培养30 d时无法通过蛋白印迹方式在蛋白水平上检测到蛋白信号。

【结论】建立并优化了简单、高效的发根农杆菌介导的平邑甜茶转化体系,鉴定了发根农杆菌在转化株系中随机向地上部迁移规律,为发根农杆菌技术的进一步利用提供理论依据。

【总页数】10页(P999-1008)【作者】周雪婷;武凯凯;崔蓝芳;张坤玺;白团辉;史江莉;焦健;王苗苗;刘昱;赵玉洁;万然;郝鹏博;郑先波【作者单位】河南农业大学园艺学院;河南省园艺植物生物学国际联合实验室【正文语种】中文【中图分类】S661.1【相关文献】1.农杆菌介导转化平邑甜茶子叶外植体的研究2.非组培依赖的发根农杆菌介导的薄壳山核桃转化体系构建3.发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立4.发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化5.发根农杆菌介导的甘薯遗传转化体系优化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

7个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建

２０２０年５月第３５卷第３期ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＧＨＴＩＮＤＵＳＴＲＹ　Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．３Ｍａｙ２０２０收稿日期：２０２０－０２－０７基金项目：人社部留学回国人员科技活动项目（豫留学函［２０１６］１号）作者简介：张俊杰（１９８４—），男，河南省汝州市人，郑州轻工业大学副教授，博士，主要研究方向为功能微生物生态与应用．引用格式：：张俊杰，郭晨，彭姗姗，等．７个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建［Ｊ］．轻工学报，２０２０，３５（３）：１９－２７．中图分类号：Ｓ５７１．１；ＴＳ２７２文献标识码：ＡＤＯＩ：１０．１２１８７／２０２０．０３．００３文章编号：２０９６－１５５３（２０２０）０３－００１９－０９７个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ７ｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｆｒｏｍＦｕｊｉａｎａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ关键词：茶树；遗传多样性：分子标记技术；分子指纹图谱Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｅａｐｌａｎｔ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ张俊杰１，郭晨１，彭姗姗１，宋玉婷１，尚益民１，李硕１，饶耿慧２，傅天龙２ＺＨＡＮＧＪｕｎｊｉｅ１，ＧＵＯＣｈｅｎ１，ＰＥＮＧＳｈａｎｓｈａｎ１，ＳＯＮＧＹｕｔｉｎｇ１，ＳＨＡＮＧＹｉｍｉｎ１，ＬＩＳｈｕｏ１，ＲＡＯＧｅｎｇｈｕｉ２，ＦＵＴｉａｎｌｏｎｇ２１．郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州４５０００１；２．福建春伦集团科研与技术创新中心，福建福州３５００１８１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００１，Ｃｈｉｎａ；２．ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，ＦｕｊｉａｎＣｈｕｎｌｕｎＧｒｏｕｐ，Ｆｕｚｈｏｕ３５００１８，Ｃｈｉｎａ摘要：基于ＳＳＲ分子标记技术，对来自福建省的７个供试茶树品种的遗传多样性水平进行分析，并构建其分子指纹图谱．结果表明：初步筛选的１４个ＳＳＲ分子标记均为多态性标记，其多态性信息含量较丰富，可以较好地区分７个供试茶树品种；福云六号与福云七号供试茶树品种之间的遗传相似性系数最高，为８．０６，亲缘关系最近；以扩增条带较少、多态性较高的３个ＳＳＲ分子标记引物（ＰＳ３，ＰＳ１５，ＰＳ１９）相组合而构建的分子指纹图谱，可有效鉴别７个供试茶树品种，实现以最少的分子标记引物鉴定所有品种的目的．·９１·　２０２０年５月第３５卷第３期Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｔａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｆｒｏｍＦｕｊｉａｎｐｒｏｖｉｎｃｅａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｏｆｔｈｅｍ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｌｏｆｔｈｅ１４ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｐｒｉｍａｒｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｍａｒｋｅｒｓｗｉｔｈｒｉｃｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＧｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎＦｕｙｕｎＮｏ．６ａｎｄＦｕｙｕｎＮｏ．７ｗａｓｈｉｇｈｅｓｔ（８．０６）ｗｈｉｃｈｈａｄａｃｌｏｓｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．３ＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ（ＰＳ３，ＰＳ１５，ＰＳ１９）ｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｂｅｃａｕｓｅｏｆｌｅｓｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂａｎｄｓａｎｄｈｉｇｈｅｒＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ａｎｄｔｈｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｃｏｕｌｄｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ７ｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｃｈｉｅｖｅｄｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇａｌｌｖａｒｉｅｔｉｅｓｗｉｔｈｔｈｅｌｅａｓｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ．０　引言茶树（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ．）Ｏ．Ｋｕｎｔｚｅ）属于山茶目，山茶科，山茶属，茶种．作为目前世界上重要的经济作物之一［１］，茶树在世界范围内被广泛种植，现已成为最受欢迎的非酒精类饮料作物之一［２］．中国是茶树的起源地，茶树资源丰富，数千年来培育出了众多优良的茶树品种［３］．茶树的育种周期较长，但极易进行无性繁殖，因而茶树品种侵权现象普遍存在［４］．分子标记技术是一种以个体间核苷酸序列在遗传物质内的变异为基础发展起来的遗传标记技术，可直接反映不同个体在ＤＮＡ水平上的遗传差异性及其多态性［５］．与其他遗传标记技术相比，分子标记技术具有多态性良好、共显性和重复性显著、不干扰目标性状表现等优势［６］．常用的分子标记技术主要有限制性片段长度多态性ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分子标记技术、随机扩增多态性ＤＮＡＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＤＮＡ）分子标记技术、简单重复区间序列ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）分子标记技术、简单重复序列ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）分子标记技术、相关序列扩增多态性ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分子标记技术、单核苷酸多态性ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分子标记技术等［７］．其中，ＳＳＲ分子标记技术是一种以特定引物的ＰＣＲ扩增为基础发展起来的第二代分子标记技术，现已被广泛应用于植物学研究［８］．大量的研究表明［９－１２］，ＳＳＲ分子标记技术已经非常成熟，利用该技术可以对不同茶树品种予以标记，进行区分．作为影响ＳＳＲ分子标记技术的关键因素，ＳＳＲ引物的开发至关重要［１３］．随着茶树分子生物学研究工作的不断深入，在茶树中已开发了一些稳定的ＳＳＲ分子标记，并已应用于亲缘关系、遗传多样性分析等方面的研究［１４］．在利用ＳＳＲ分子标记技术研究分析样品的遗传多样性时，需要有足够多的位点信息以保证实验结果的准确性和可靠性，因此，ＳＳＲ分子标记技术需要做大量的重复性实验，故选择高效精准的检测方法非常重要．常用的检测方法主要有３种，即琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳［１５］．分子指纹图谱是一种以分子标记技术（包括ＲＦＬＰ，ＲＡＰＤ，ＩＳＳＲ，ＳＳＲ，ＳＲＡＰ，ＳＮＰ等）为基础，在ＤＮＡ水平上直接呈现个体特异性的电泳图谱［１６］．分子指纹图谱应用于植物新品种的保护和测试、植物品种或杂交种纯度的鉴定等方面，具有很大的潜力［１７］．ＳＳＲ分子标记技术是建立茶树品种分子指纹图谱的常用技术．郭燕等［１８］基于表达序列标签（ＥＳＴ）的ＳＳＲ分子标记技术，分析了４０份贵州古茶树资源的遗传多样性，鉴定了其分子指纹图谱，并从ＳＳＲ标记中筛选出４个核心标记，构建了１８位分子指纹图谱号码，且每个品种都有唯一的分子指纹图谱号码．金基强等［１９］研究分析了４２份茶树品种资源，并从１６对引物中筛选出１３对引物·０２·张俊杰，等：７个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建进行遗传多样性分析，证实了利用ＥＳＴＳＳＲ标记进行茶树资源评价是有效的．乔婷婷等［２０］研究分析了浙江省５９个茶树品种的遗传多样性和群体结构，基于６４对ＥＳＴＳＳＲ分子标记的供试茶树品种的多态性信息量平均值为０．４４，相较于育成品种，地方品种的遗传多样性水平略高．陈志辉等［２１］分析了福建的４３个茶树品种，基于２３对ＳＳＲ分子标记对其进行遗传多样性分析，并从中筛选出７对ＳＳＲ引物组合构建指纹图谱．王让剑等［２２］筛选得到６对ＳＳＲ分子标记，并用于福建１０个自育品种和５个参照品种的遗传差异分析，利用３对引物建立了其指纹图谱．我国福建省茶树品种很多，而茶树品种的鉴别和保护对于发展茶业既是一项至关重要的技术工作，又是一项长期性的茶种保持和传承工作．鉴于此，本文拟采用ＳＳＲ分子标记技术研究分析７个福建供试茶树品种的遗传多样性，构建其分子指纹图谱，旨在为福建茶树品种的鉴别、分子标记辅助育种等提供参考．１　材料与方法１．１　材料本研究的供试材料为７个福建茶树品种，均采自恩顶茶园，由福建春伦集团提供，其相关信息见表１．表１　７个供试茶树品种的相关信息Ｔａｂｌｅ１　Ｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ名称审（认、鉴）定年份／级别原遗传背景或来源福安大白１９８５／Ｇ安市康厝乡上高山村白茶１９８５／Ｇ闽北政和县、闽东福鼎县菜茶—武夷山区梅占１９８５／Ｇ安溪县芦田镇三洋村金观音２００２／Ｇ铁观音茶与黄金桂茶自然杂交福云六号１９８７／Ｇ福鼎大白茶与云南大叶茶自然杂交福云七号１９８７／Ｇ福鼎大白茶与云南大叶茶自然杂交１．２　主要试剂过硫酸铵、硼酸、丙烯酰胺，上海麦克林生化科技有限公司产；乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、三羟甲基氨基甲烷硼酸（ＴＢＥ）、溴代十六烷基三甲胺（ＣＴＡＢ），北京索莱宝生科技有限公司产；Ｎ，Ｎ－二甲叉双丙烯酰胺，山东开普勒生物试剂公司产；ＡｇＮＯ３，ＮａＯＨ，氯仿，异戊醇，异丙醇，甲醇，乙醇，醋酸钠，天津市永大化学试剂公司产．以上试剂均为分析纯．琼脂糖，赛默飞世尔科技公司产．１．３　仪器与设备ＡＥ２２４型分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产；ＴＧＬ－１６Ｇ型离心机，上海安亭科学仪器厂产；ＳＣ－１５型恒温水浴锅，宁波新芝生物科技有限公司产；ＨＳ－ＱＧＴＦＧ－１２００型通风橱，安徽徽试实验设备有限公司产；ＪＹ－ＣＸ２Ｂ型测序电泳槽，郑州博邦科贸有限公司产；Ｃ１０００ＴｏｕｃｈＴＭ型ＰＣＲ仪，美国ＢｉｏＲａｄ公司产；Ｂ－５００型超微量紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产．１．４　实验用溶液配方质量分数为４０％的聚丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺３８ｇ，Ｎ，Ｎ－二甲叉双丙烯酰胺２ｇ，去离子水１００ｍＬ．质量分数为１０％的过硫酸铵溶液：过硫酸铵１０ｇ，去离子水１００ｍＬ．１０×ＴＢＥ溶液：Ｔｒｉｓ５．４ｇ，硼酸２．７５ｇ，ＥＤＴＡ０．３７２ｇ，去离子水１００ｍＬ．０．５×ＴＢＥ溶液：Ｔｒｉｓ２．７ｇ，硼酸１．３７５ｇ，ＥＤＴＡ０．１８６ｇ，去离子水１０００ｍＬ．２×ＣＴＡＢ缓冲液：ＣＴＡＢ２ｇ，１０ｍｍｏｌＴｒｉｓ（ｐＨ值为８．０），２ｍｍｏｌＥＤＴＡ（ｐＨ值为８．０），０．１４ｍｏｌＮａＣｌ，去离子水１００ｍＬ．高盐缓冲液（质量分数为１０％的ＡｇＮＯ３溶液）：ＡｇＮＯ３１０ｇ，去离子水１００ｍＬ．染色液：高盐缓冲液１ｍＬ，去离子水·１２·　２０２０年５月第３５卷第３期１００ｍＬ．显影液：ＮａＯＨ１．５ｇ，甲醛０．５ｍＬ，去离子水１００ｍＬ．１．５　茶树叶片ＤＮＡ的提取和检测用改进的ＣＴＡＢ法［２，２３］分别提取供试茶树叶片的ＤＮＡ，具体步骤如下：１）准确称取０．１ｇ新鲜供试茶树叶片置于１．５ｍＬ的离心管中，将其粉碎成匀浆状；２）向离心管中加入６００μＬ（已于６５℃水浴锅中预热）２×ＣＴＡＢ缓冲液后，将其置于６５℃恒温水浴锅中水浴１ｈ；３）冷却至室温后，加入等体积的氯仿／异戊醇（Ｖ（氯仿）Ｖ（异戊醇）＝２４１）混合液，颠倒混匀，于１００００ｒ／ｍｉｎ条件下离心１０ｍｉｎ；４）收集上清液，加入等体积的氯仿／异戊醇（Ｖ（氯仿）Ｖ（异戊醇）＝２４１）混合液，颠倒混匀，于１００００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ；５）收集上清液，加入等体积的异戊醇，轻轻混匀；６）于－２０℃条件下静置１０ｈ，于７０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，弃上清液，用１０μＬ枪头吸出剩余液体；７）在剩余液体中加入８００μＬ高盐缓冲液，于６５℃恒温水浴锅中水浴３０ｍｉｎ，于１００００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，收集上清液；８）向上清液中加入上清液体积１／１０的醋酸钠溶液（３ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值为５．２）、上清液体积２／３的异丙醇，轻轻混匀；９）于－２０℃条件下静置１ｈ，于７０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，弃上清液；１０）重复步骤６）—９）；１１）加入质量分数为７０％的乙醇，于７０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，弃上清液，重复３次，将离心管于通风橱中静置４～５ｍｉｎ，根据沉淀量的不同加入２０～４０μＬｄｄＨ２Ｏ；１２）将提取出来的ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳检测（琼脂糖质量分数为１％），采用超微量紫外分光光度计及其软件ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００对ＤＮＡ纯度和质量进行检测．１．６　ＳＳＲ分子标记方法本研究所用的６８个ＳＳＲ分子标记来自不同的参考文献［２４－２５］，其引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成．１．６．１　ＰＣＲ扩增　根据退火温度设定ＰＣＲ反应程序，以目标条带清晰、杂带少为原则．ＰＣＲ反应体系的总体积为２０μＬ，其中，ＤＮＡ模板２μＬ，２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ的上、下游引物各１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ６μＬ．ＰＣＲ扩增程序的循环条件是：９４℃预变性５ｍｉｎ，循环１次；然后９４℃变性３０ｓ，循环３５次，最适退火温度复性３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ；最后于７２℃延伸１０ｍｉｎ，循环１次．１．６．２　ＰＣＲ扩增产物检测　将ＰＣＲ扩增产物置于电泳槽里，采用质量分数为８％的聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳，再结合银染方法进行检测．本研究采用的银染方法在常规方法的基础上进行了改进：凝胶电泳结束后取下夹子，将玻璃胶板从电泳槽上取下来，从玻璃板中剥离出凝胶，用蒸馏水漂洗１次；将凝胶转入染色液中，轻摇２ｍｉｎ后，用蒸馏水漂洗１次，最后转入显影液中进行显色，边摇边观察显色结果，直至条带清晰后，将电泳结果拍照记录．１．６．３　数据处理　采用人工读带的方法记录电泳结果（只针对目标条带附近的扩增位点），统计ＳＳＲ扩增条带，在相同扩增位点上，有条带记为“１”，无条带记为“０”，利用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１０软件中的ＮＴｅｄｉｔ数据编辑器，直接录入读带结果数据．通过ＰｏｐＧｅｎｅ分析软件统计每对引物在７个供试茶树品种的有效等位基因Ｎｅ（反映群体遗传变异大小的指标）、观测杂合度Ｈｏ（随机抽取样本的２个等位基因不相同的概率）、期望杂合度Ｈｅ（根据理论公式计算所得，·２２·张俊杰，等：７个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建其范围从０到１：当Ｈｅ＝０时，说明该引物无多态性；当Ｈｅ＝１时，说明该引物的无限多个等位基因具有相同的频率）和Ｓｈａｎｎｏｎ指数（Ｉ）．采用ＰｏｗｅｒＭａｒｋｅｒ软件计算主要等位基因频率、基因多样性指数，并根据Ｎｅｉｌ’ｓ方法计算每对引物扩增位点的多态性信息量（ＰＩＣ）．根据这些指标的差异，可从不同角度分析ＳＳＲ分子标记引物在遗传多样性方面存在的差异．利用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１０软件中的Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ模块，通过非加权平均法（ＵＰＭＧＡ）对７个供试茶树品种的遗传相似系数方阵进行聚类分析．筛选出扩增条带清晰、各茶树品种间电泳结果有差异的ＳＳＲ分子标记引物，用于供试茶树分子指纹图谱的构建．２　结果与讨论２．１　供试茶树品种的ＳＳＲ多态性本研究从６８个ＳＳＲ分子标记中初步筛选出１４个扩增条带稳定清晰并表现出多态性的ＳＳＲ分子标记，其引物信息见表２．１４个ＳＳＲ分子标记引物在７个供试茶树品种中的扩增结果见表３．由表３可知：Ｎｅ的群体遗传变异范围为３．３７９３～６．５３３３，平均值为５．２２６９；Ｈｏ变化范围为０．５７１４～０．８５７１，平均值为０．７３４７；Ｈｅ变化范围为０．７５８２～０．９１２１，平均值为０．８６１９；Ｉ变化范围不大，为１．５６７０～１．９０８５，平均值为１．７８１１；主要等位基因频率变化范围为０．２１４３～０．５０００，平均值为０．３１１２；基因多样性指数变化范围为０．７０４１～０．８４６９，平均值为０．８００３；ＰＩＣ变化范围为０．６７９６～０．８２７７，平均值为０．７７７１，均大于０．５０００．该扩增结果表明，初步筛选的１４个ＳＳＲ分子标记均为多态性标记，其多态性信息含量较丰富．２．２　供试茶树品种的遗传相似性遗传相似系数越高，表明供试茶树品种间遗传距离越近、亲缘关系越近．７个供试茶树品种的遗传相似系数方阵见表４．由表４可知，７个供试茶树品种的遗传相似系数变化幅度较大，为４．８４～８．０６．其中，同父母本的福云六号与福云七号间的遗传相似系数最高，为８．０６，表明这２个供试茶树品种之间具有较近的亲缘关系；金观音与福云六号间的遗传相似系数次之，为７．９０；福云六号与菜茶间的遗传相似系表２　１４个ＳＳＲ分子标记引物信息Ｔａｂｌｅ２　Ｔｈｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ１４ＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｐｒｉｍｅｒｓ引物编码正向引物序列反向引物序列退火温度／℃ＰＳ２ＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴ５４．０ＰＳ３ＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧ５４．０ＰＳ４ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＴＡＡＴ５４．０ＰＳ５ＧＴＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＴＡ５５．０ＰＳ１３ＣＡＴＴＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴ５７．５ＰＳ１５ＴＣＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＣＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＧＧ６１．０ＰＳ１９ＡＣＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＡ６０．０ＰＳ２５ＴＧＧＴＡＡＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣ６０．８ＰＳ２６ＣＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＣＣ５７．０ＰＳ４１ＧＧＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＴＡＴＡＧＴ６０．８ＰＳ４２ＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣＴＧＴＡＡＡＡＴＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＡＡＣ６０．８ＰＳ５６ＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧ６０．０ＰＳ６１ＴＴＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＣＧＣＧＣＴＡＡＡＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴ４８．０ＰＳ６５ＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴ５９．０·３２·　２０２０年５月第３５卷第３期数最低，为４．８４．２．３　供试茶树品种的聚类分析结果７个供试茶树品种的聚类分析树状图如图１所示．由图１可以看出，在相似系数约为０．６９时，可将７个供试茶树品种分为４类，第１类为福安大白、白茶和金观音，第２类为福云六号和福云七号，第３类为菜茶，第４类为梅占；在相似系数约为０．７４时，可将７个供试茶树品种分为５类，第１类为福安大白，第２类为白茶和金观音，第３类为福云六号和福云七号，第４类为菜茶，第５类为梅占．以上遗传相似系数分析和聚类分析表明，这１４个ＳＳＲ分子标记可以较好地区分７个供试茶树品种．２．４　供试茶树品种分子指纹图谱的构建结果对扩增条带清晰、多态性良好的１４个ＳＳＲ分子标记引物进行图形化处理：黑色方块表示有条带，白色方块表示无条带，按照此规则构建了一个较为全面的７个供试茶树品种的分子指纹图谱，如图２所示．该图谱中，从左到右依次为福安大白、白茶、菜茶、梅占、金观音、福云六号和福云七号．由图２可以看出，７个供试茶树品种扩增条带大小在１３５ｂｐ与３００ｂｐ之间，表明该指纹图谱可以将７个供试茶树品种逐一鉴别并区分开，且效果较好．然而根据表３的扩增结果可知，任何一个ＳＳＲ分子标记引物都不能单独将这７个供试茶树品种区分开来，只有采表３　１４个ＳＳＲ标记引物在７个供试茶树品种中的扩增结果Ｔａｂｌｅ３　Ｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆ１４ＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｉｎ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ引物编码ＮｅＨｏＨｅＩ主要等位基因频率基因多样性指数ＰＩＣＰＳ２６．５３３３０．５７１４０．９１２１１．９０８５０．２１４３０．８４６９０．８２７７ＰＳ３４．９００００．８５７１０．８５７１１．７６７２０．３５７１０．７９５９０．７７１９ＰＳ４５．４４４４０．８５７１０．８７９１１．８０９５０．２８５７０．８１６３０．７９２３ＰＳ５３．３７９３０．８５７１０．７５８２１．５６７１０．５００００．７０４１０．６７９６ＰＳ１３５．４４４４０．８５７１０．８７９１１．８０９５０．２８５７０．８１６３０．７９２３ＰＳ１５５．４４４４０．８５７１０．８７９１１．８０９５０．２８５７０．８１６３０．７９２３ＰＳ１９５．７６４７０．７１４３０．８９０１１．８３３８０．２１４３０．８２６５０．８０３３ＰＳ２５６．５３３３０．７１４３０．９１２１１．９０８５０．２１４３０．８４６９０．８２７７ＰＳ２６４．０８３３０．５７１４０．８１３２１．６７３１０．４２８６０．７５５１０．７２９８ＰＳ４１５．１５７９０．７１４３０．８６８１１．７７２１０．２８５７０．８０６１０．７７９５ＰＳ４２４．９００００．５７１４０．８５７１１．７６７２０．３５７１０．７９５９０．７７１９ＰＳ５６６．１２５００．７１４３０．９０１１１．８７１２０．２１４３０．８３６７０．８１５６ＰＳ６１６．１２５００．５７１４０．９０１１１．８７１２０．２１４３０．８３６７０．８１５６ＰＳ６５３．３７９３０．８５７１０．７５８２１．５６７１０．５００００．７０４１０．６７９６平均值５．２２６９０．７３４７０．８６１９１．７８１１０．３１１２０．８００３０．７７７１表４　供试茶树品种的遗传相似系数方阵Ｔａｂｌｅ４　Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍａｔｒｉｘｏｆ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ名称福安大白白茶菜茶梅占金观音福云六号福云七号福安大白１．００——————白茶６．９４１．００—————菜茶６．１３６．２９１．００————梅占５．８１７．２６６．４５１．００———金观音６．９４７．４２５．３２６．２９１．００——福云六号５．８１６．９４４．８４５．８１７．９０１．００—福云七号５．４８５．９７５．８１６．１３６．２９８．０６１．００·４２·张俊杰，等：７个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建图１　７个供试茶树品种的聚类分析树状图Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｔｒｅｅｏｆ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ图２　７个供试茶树品种的分子指纹图谱Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｏｆ７ｔｅｓｔｅｄｔｅａｐｌａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ用引物组合的方式才有可能将这７个供试茶树品种完全区分开［２６］．遵循以最少的ＳＳＲ分子标记引物鉴定所有品种的原则，最终选取扩增条带较少、多态性较高的３个ＳＳＲ分子标记引物（ＰＳ３，ＰＳ１５，ＰＳ１９）相组合，用于构建区分７个供试茶树品种的分子指纹图谱，结果如图３所示，从左到右图３　由３个ＳＳＲ分子标记引物组合构建的分子指纹图谱Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇ３ＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ依次为福安大白、白茶、菜茶、梅占、金观音、福云六号、福云七号．由图３可以看出，通过３个ＳＳＲ分子标记引物的扩增，７个供试茶树品种均呈现出独特的综合图谱类型，可将其有效地区分开来．ＳＳＲ分子标记引物的多态性越高，越容易区分不同供试茶树品种，同时，遗传相似系数越低的品种越容易被区分开．因此，ＳＳＲ分子标记引物的多态性越高，茶树品种间的扩增条带的差异就越明显；不同供试茶树品种之间遗传相似系数越低，使用同一对ＳＳＲ分子标记引物进·５２·　２０２０年５月第３５卷第３期行扩增时，其扩增条带差异越明显．ＳＳＲ多态性分析体现了ＳＳＲ分子标记引物之间的差异，而遗传相似系数和分子指纹图谱则共同体现了供试茶树品种间的差异．３　结论本研究基于ＳＳＲ分子标记技术，对采自福建省的７个供试茶树品种的遗传多样性水平进行了分析，并构建了其分子指纹图谱．结果表明：初步筛选出的１４个ＳＳＲ分子标记均为多态性标记，且其多态性信息含量均较丰富，可以较好地区分７个供试茶树品种；福云六号与福云七号供试茶树品种之间的遗传相似性系数最高，为８．０６，亲缘关系最近；选取由扩增条带较少、多态性较高的３个ＳＳＲ分子标记（ＰＳ３，ＰＳ１５，ＰＳ１９）组合构建的分子指纹图谱，可有效鉴别７个供试茶树品种，实现了以最少的分子标记引物鉴定尽可能多品种的目的．今后将在本研究的基础上，不断丰富和扩充ＤＮＡ指纹库的数据量，继续开发新的ＳＳＲ分子标记，以适应茶树待测品系数量不断增加的现状，更好地鉴别和保护茶树品种，减少茶树品种的侵权现象．参考文献：［１］　ＫＡＭＵＮＹＡＳＭ，ＷＡＣＨＩＲＡＦＮ，ＰＡＴＨＡＫＲＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｍａｐｐｉｎｇａｎｄｔｅｓｔｉｎｇｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉｉｎｔｅａ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ．）Ｏ．Ｋｕｎｔｚｅ）［Ｊ］．ＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ，２０１０，６（６）：９１５．［２］　黄丹娟．我国优良茶树品种遗传多样性分析及指纹图谱构建［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２０１６．［３］　ＣＨＥＮＬ，ＺＨＯＵＺＸ，ＹＡＮＧＹＪ．Ｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｔｅａｐｌａｎｔ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）ｉｎＣｈｉｎａ：Ｆｒｏｍｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｔｏｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００７，１５４（１／２）：２３９．［４］　陈亮，虞富莲，姚明哲，等．国际植物新品种保护联盟茶树新品种特异性、一致性、稳定性测试指南的制订［Ｊ］．中国农业科学，２００８，４１（８）：２４００．［５］　魏倩倩．分子标记技术在家禽育种中的应用［Ｊ］．农民致富之友，２０１７（１７）：７１．［６］　李冰敏．分子标记在园林植物育种中的应用［Ｊ］．现代园艺，２０１９（１５）：１４８．［７］　冯英娜．茄子遗传多样性与主要农艺性状标记关联分析［Ｄ］．南京：南京农业大学，２０１４．［８］　鲁亚静，陈庭，李建友，等．叶子花ＳＳＲＰＣＲ体系的优化［Ｊ］．安徽农业科学，２０１５（１７）：５７．［９］　ＤＥＴＴＯＲＩＭＴ，ＭＩＣＡＬＩＳ，ＧＩＯＶＩＮＡＺＺＩＪ，ｅｔａｌ．Ｍｉｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｉｎｔｈｅｐｅａｃｈｇｅｎｏｍｅ：ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｅｗｌｏｎｇｃｏｒｅＳＳＲｍａｒｋｅｒｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｅｓｉｎｆｉｖｅＰｒｕｎｕｓｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｓｐｒｉｎｇｅｒｐｌｕｓ，２０１５，４（１）：３３７．［１０］刘本英，孙雪梅，李友勇，等．基于ＥＳＴＳＳＲ标记的云南无性系茶树良种遗传多样性分析及指纹图谱构建［Ｊ］．茶叶科学，２０１２（３）：７７．［１１］余继忠，黄海涛，姚明哲，等．基于ＥＳＴＳＳＲ的福云（半）同胞系茶树品种（系）遗传多样性和亲缘关系分析［Ｊ］．茶叶科学，２０１０（３）：３２．［１２］章志芳，马建强．基于ＳＳＲ标记的茶树新品种遗传多样性分析及指纹图谱构建［Ｊ］．湖南农业科学，２０１２（１９）：９．［１３］孟清照，李仕金，董转年，等．ＳＳＲ引物开发方法概述［Ｊ］．大众科技，２００７（６）：１１６．［１４］杨阳，刘振，赵洋，等．湖南省主要茶树品种分子指纹图谱的构建［Ｊ］．茶叶科学，２０１０，３０（５）：３６７．［１５］朱岩芳．作物品种分子标记鉴定及指纹图谱构建研究［Ｄ］．杭州：浙江大学，２０１３．［１６］徐丽芳，陈吉炎，罗光明．分子标记技术及其在植物育种中的应用［Ｊ］．食品与药品，２００７，·６２·张俊杰，等：７个福建茶树品种的遗传多样性分析及其分子指纹图谱构建９（１０）：４３．［１７］刘洪伟．茶树ｇＳＳＲ分子指纹开发及其在商品茶品种鉴别中的应用［Ｄ］．合肥：安徽农业大学，２０１６．［１８］郭燕，刘声传，曹雨，等．基于ＳＳＲ标记贵州古茶树资源的遗传多样性分析及指纹图谱构建［Ｊ］．西南农业学报，２０１６，２９（３）：４９１．［１９］金基强，崔海瑞，龚晓春，等．用ＥＳＴＳＳＲ标记对茶树种质资源的研究［Ｊ］．遗传，２００７，２９（１）：１０３．［２０］乔婷婷，马春雷，周炎花，等．浙江省茶树地方品种与选育品种遗传多样性和群体结构的ＥＳＴＳＳＲ分析［Ｊ］．作物学报，２０１０，３６（５）：７４４．［２１］陈志辉，单睿阳，游小妹，等．４３个福建省茶树品种指纹图谱构建及遗传多样性分析［Ｊ］．热带植物学报，２０１７（６）：５７９．［２２］王让剑，杨军，孔祥瑞，等．福建１５个茶树品种ＳＳＲ遗传差异分析与指纹图谱建立［Ｊ］．福建农业学报，２０１４（１０）：９７０．［２３］ＤＯＹＬＥＪＪ．ＤＮＡｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＴａｘｏｎｏｍｙ，１９９１（５７）：２８３．［２４］ＵＪＩＨＡＲＡＴ，ＯＨＴＡＲ，ＨＡＹＡＳＨＩＮ，ｅｔａｌ．ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＪａｐａｎｅｓｅａｎｄＣｈｉｎｅｓｅｇｒｅｅｎｔｅａｃｕｌｔｉｖａｒｓｂｙｕｓｉｎｇｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｍａｒｋｅｒｓｔｏｅｎｃｏｕｒａｇｅｐｒｏｐｅｒｌａｂｅｌｉｎｇ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，７３（１）：１５．［２５］吴晓梅，姚明哲，马春雷，等．利用ＥＳＴＳＳＲ标记研究适制绿茶与乌龙茶品种的遗传多样性与遗传结构［Ｊ］．茶叶科学，２０１０，３０（３）：１９５．［２６］ＬＩＵＱＷ，ＳＯＮＧＹ，ＬＩＵＬ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｅａｒ（Ｐｙｒｕｓｓｐｐ．）ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙａｓｅｔｏｆｃｏｒｅｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ，２０１５，１１（６）：１２８．本刊数字网络传播声明本刊已许可中国知网，万方数据资源系统，维普网，国家科技学术期刊开放平台，博看网，超星，中国科技论文在线，中教数据库，ＥＢＳＣＯｈｏｓｔ，ＣＡ，Ｕｌｒｉｃｈｓ，ＦＳＴＡ等在其系列数据库产品中以数字化方式复制、汇编、发行、信息网络传播本刊全文．其相关著作权使用费与本刊稿酬一并支付．作者向本刊提交文章发表的行为即视为同意我刊上述声明．·７２·。

茶树品质性状及优良品种的遗传改良研究

茶树品质性状及优良品种的遗传改良研究茶叶是我国传统的特色农产品之一，而茶树是茶叶产生的源头。

为了提高茶叶的品质和产量，茶树的遗传改良是必不可少的一环。

本文将探讨茶树品质性状的遗传及优良品种的遗传改良研究。

一、茶树品质性状的遗传1.茶树品种的形态特征茶树是多年生木本植物，树高约10米。

不同品种的茶树形态差异很大，比如叶子的大小和形状、树干和枝条的强度等。

这些形态特征对茶树的适应性、生长速度以及茶叶品质都有影响，而这些特征的遗传基础主要是掌控茶树的染色体。

2.茶树品种的生物学特性茶树是同源多倍体，不同品种的茶树染色体数量和形态差异很大。

因此，茶树品种之间的杂交并不容易成功，而且其杂交后代的表现也很难预测。

但是，通过分析茶树基因组序列，人们可以更好地了解茶树品种之间的遗传关系，为育种提供更多的信息。

3.茶叶药理成分的遗传控制茶叶中含有许多药理成分，如茶多酚、咖啡因、氨基酸等。

这些成分对茶的品味和功效都有重要影响。

茶叶药理成分的遗传控制是通过基因调控来实现的。

许多研究表明，茶树不同品种药理成分的含量差异很大，其中一些品种的含量更高，因此更受欢迎。

二、优良品种的遗传改良研究1.传统育种方法传统的育种方法是通过选择和杂交，筛选出表现优良的杂交后代。

但是这种方法效率低且耗时较长，很难直接得到理想的品种。

因此，学者们将注意力转向分子生物学和基因工程领域。

2.基因编辑技术的应用近年来，新兴的基因编辑技术能够实现对基因组的高度定向和精准编辑，这为茶树基因组的优化和改良带来了新的机遇。

目前，研究人员已经成功地利用CRISPR/Cas9技术对茶树基因组进行了编辑，实现了茶叶中皂苷酯代谢途径的调控，进一步提高了茶叶的品质和抗病能力。

3.基因组学的应用基因组学是研究基因组中基因和DNA序列的一门学科。

茶树基因组的测序揭示了茶树天然变异性状的遗传基础，发现茶树品种之间的遗传关系以及茶树基因组的功能基因，进一步推动了茶树的遗传改良。

茶树优质高效栽培技术要点

茶树优质高效栽培技术要点茶叶的种植历史非常悠久且市场前景非常广阔，越来越多的茶农认识到茶树种植的经济优势，若想提高茶树种植效益，需要根据茶树不同生长时期情况，不断优化茶树种植技术，了解茶树生长规律，提高茶树质量及茶叶产量，实现茶树种植的科学管理。

茶树生长发育时间较长，不同生长时期的生长规律及特性也有明显的差别，茶树幼年时期的抗旱能力比较弱，对于外界条件的适应能力也比较差，需要通过人工干预的方式，为茶树的生长提供优质的条件，在种植之前需要挖掘种植槽，种植槽内需要施入有机肥料，为茶树的生长提供肥力。

1掌握茶树生长规律幼龄茶树的生命力较为旺盛，生长速度比较快，对于各类营养物质的需求量也比较大，此时需培养茶树优质树冠及根系，加强肥水管理，同时配合相应的采摘及修剪工作，避免影响顶端优势，保证茶树侧枝的全面生长，提升茶树整体覆盖率，为茶叶生长打下良好的基础。

茶树种植管理时需要以早发、早采、早开园为主，在冬季和早春季节需要提高茶树种植地区的地温及气温，同时实施深耕及施肥措施，调整土壤结构，可以通过培土覆草的方式来提高茶树种植地区的土地温度，减少地表冰冻情况的发生，避免茶树根系受到冻害影响。

除了调整土壤结构外，还需要适当增加土壤肥力，施加速效肥促进茶树的发芽及生长。

在促进茶树新梢生长方面，首先需提高土壤肥力，可以通过生长素追肥及微量元素配合的方式来加快茶树的萌芽发育。

其次，可以在茶树生长过程中及时进行水分及施肥管理，加快茶树生长效果及生长速度。

2调节茶叶量质关系2.1缩小地块差距要想实现茶叶大面积生产，仅仅依靠小规模茶园管理是难以达到相应效果的，只有70%的茶树产量达到较高水准，才能够实现大面积的增产增收。

因此，需要优化不同种植地块的管理措施，尽可能缩短不同地块之间的生产效益差，地块间的平衡点则为该茶园的中心点。

因此，需要加强整体产业环境的建设，选择高产优质的品种进行种植，根据不同品种的生长时期进行合理的搭配，尽可能发挥出各类茶树品种的生长优势，合理处理种植地区生长条件，协调好土壤环境及外部生态环境对于茶树生长产生的影响，适当对茶树进行密植处理，以提升茶树整体生产能力，在茶树管理过程中需要适当提高土壤肥力，为其生长提供充足的营养供应，另外需适当进行科学的剪裁及采收工作，为实现茶树高产奠定基础。

梓树属植物基因组DNA提取及RAPD体系优化

１０ｍｏｌ０ｕ／Ｌ、１０５ｕｍｏ／、２ｕｍｏ／、２５ｌＬ００ｌＬ０
ｕｌ；ａ酶浓度梯度ＯｍｏＬＴｑ／．ｕ、１５．Ｕ、１０．Ｕ、２５．０ｕ、２．ｕ，通过对比试验找出最佳反应体系，并利５用４种不同引物进行优化条件的检验。２１３ＤＮ扩增反应程序．Ａ根据树种的不同和引物合成的退火温度，程序设置如下：首先进行预变性９ ℃ ５ｍｉ，预变性５ｎ之后进入循环体系：变性：９ｏ０Ｓ４３；退火：３Ｃ６ ℃ ３；０延伸：２４，共４个循环，最后７Ｓ７℃ ５Ｓ５２ ℃再延伸１ｎ０ｍｉ，反应结束后４ ℃保存。
４０４，ｈａ５０５Ｃｉ）ｎ
ＡｂＩｃｈｅｈｏｆｅｍｉｓ瓢ＩｔＴｅｍｔｄｏｎｏｃＤＮＡｘｒｃｏｒｍｅｌａｅｎｄｔｅｏｔｍｉａｉｎｏｇｅｔａｔｎｆｏｎｗｅｖｓａｐｉｚｔｏｆＲＡＰａａｙｉｉｈＤｎｔｃｌ
Ｏ６ｍ／８ｍ的值，按ｌ２０５ｇＤ２０ｎＯＤ２０ｎＯＤ６＝０ｎ／
度较高，品色泽白色透明，ＤｍＯ。１３样Ｏｚ／Ｄｓ为．，ｏｎ７接近１，表明ＤＡ浓度符合ＲＰ．８ＮＡＤ分析要求。通过０％琼脂糖凝胶电泳分离检测．溴化乙．８锭染色，观察ＤＡ分子的完整性，Ｎ结果见图ｌ基。因组ＤＡ在凝胶上表现为一条规则的带，基本无Ｎ降解现象，有少量的ＲＡ，但不影响ＲＰ分析。ＮＡＤ

枣树RAPD分析体系优化研究

摘要：用随机引物扩增多态性（ＡＤ分子标记技术研究不同枣树品系之间遗传多态性，立起一个基于ＰＲ利ＲＰ）建Ｃ技术的分子遗传标记ＲＰＡＤ分析的优化体系。设置不同的浓度梯度，ｄＴｓ、机引物、ａ从ＮＰ随Ｔｑ酶、：、冲液ＢｆｒＭｓ缓ｕｅ的浓度及模板ＤＡ的质量和用量方面考察，立了枣树ＲＰＮ建ＡＤ技术最优体系。结果表明：０２反应体系组分含量为
ＰｌｍｒｈｃＤｏｙｏｐｉＮＡ（ＡＰｍ０ｅｕａｒｅｅｈｏｏｙＴｅｏｔｚｄＲＤａａｙｉｓｓｍｆｅｅｉｍｏｅｕａｒｅＲＤ）ｌｃ１ｒｍａｋｒｔｃｎｌｇ．ｈｐｉｅＡＰｎｓｓｙｔｏｎｔｌｃｌｒｋｒｉｍｌｅｇｃｍａ
１ ×Ｔｑ酶Ｂｆｒｘ，：０ａｕｅ２／ＭｓＬ浓度２０ｍｏＬｄＴｓ浓度２０￣ｏＬ引物浓度０２ｔｏＬＴｑＮ聚合酶浓度．ｍｌ，ＮＰ／０ｍｌ，／．ｍｌ，ａＤＡ￣／００／￣，Ｎ．ＵｔＤＡ模板浓度１５ｎ／Ｌ最佳扩增程序为９ ℃ 预变性４ｍｎ９ ℃ 变性３，６退火４，２延伸１６Ｌ．ｇｔ。￣４ｉ，４０ｓ３ ℃ Ｊｓ７ ℃ ０
３ＡｆｒｓａｉｎＣｍｓｉｎＯｆｅｉｎｑａｉＹａｇｕｎ０５０，ｈｎ）．ｆｅｔｔｏｍｉｓｆｃｎＹａｇｕｎＣｔｏｏｏｉｙ，ｎｑａ４００Ｃｉａ

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 579–587, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.007——————————————————收稿日期: 2009-12-08; 接受日期: 2010-03-30基金项目: 973计划前期项目(No.2007CB116211)、国家自然科学基金(No.30771755和No.30972401)和安徽省自然科学基金(No.09041- 1006)* 通讯作者。

E-mail: xiatao62@; gaolp62@茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择孙美莲1, 王云生2, 杨冬青1, 韦朝领1, 高丽萍2*, 夏涛1*, 单育1, 骆洋21安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室, 合肥 2300362安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036摘要选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR 分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。

该文以茶树(Camellia sinensis )芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR 技术, 分析了18S rRNA 、GAPDH 、β-actin 和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。

经GeNorm 和NormFinder 软件分析发现, 当利用荧光定量PCR 分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin 作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH 作为校正内参基因。

关键词茶树, 实时荧光定量PCR, 内参基因孙美莲, 王云生, 杨冬青, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 单育, 骆洋 (2010). 茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择. 植物学报 45, 579–587.实时荧光定量PCR(real time fluorescence qua- ntitative PCR, qRT-PCR)实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达的重要工具(Heid et al., 1996; Haller et al., 2004; Ransbotyn and Reusch, 2006; Yoo et al., 2009)。

茶树育种学

《茶树育种学》习题及答案一、填空题1．茶树染色体以x=（15）为基数，在体细胞中为（30）条，在性细胞中为（15）条。

2．作为核型分析的染色体，一般以体细胞有丝分裂（中期）的染色体为基本形态。

3．茶树有丝分裂标本常以种子用沙培1周长出的（幼根）为材料。

4．茶树树型分为（乔木）、（小乔木）和（灌木）三种。

5．茶树学名是用（属名）、（种加词）和（命名人姓名的缩写）组成。

茶树品种福鼎大白茶的植物学拉丁文全名是（Camellia sinensis cv. Fuding-dabaicha）6．茶树的表现型是（基因型）与环境共同作用的结果。

7．以无性繁殖方法生产树苗，其后代个体基因是杂合的，品种内个体之间基因型是（相同的）。

8．气温（低）的地区向气温（高）的地区引种茶树，一般能够适应。

9．云南等省的一些大叶种引种到安徽北部等地区，难以种植成功，主要是（冬季极限最低气温）比原产地低得多。

10．南方茶树品种北引后，其最低分枝部位（降低）。

11．南方茶树品种北引后，新梢茶多酚含量（减少）。

12．茶苗移栽通常在（春初）或（秋末冬初）进行。

13．选择的实质就是造成有（差别）的生殖率和成活率，从而定向地改变群体的遗传组成。

14．（基因重组）是茶树有性群体中造成不同个体遗传组成差别的主要来源。

15．（基因突变）是茶树无性系品种产生变异的主要因素。

16．（自然选择）是按茶树适应自然环境条件的方向进行的，选择的结果使茶树更适应自然环境条件。

17．（人工选择）是根据社会的经济要求或人类的喜好，从自然界混杂的茶树群体中或人工创造的原始材料中，选择需要的类型和个体。

18．表型方差可以分为遗传方差和（环境）方差两部分。

19．遗传力是介于（0～1）之间的数值。

20．通过与产量因子密切相关地一些性状，如（树高）、（树幅）、（叶片光合强度）、（幼年茶树定型修剪枝叶重量）、（单株芽叶数）、（新梢着叶数）、（百芽重）、（发芽密度）、（扦插苗发根数）、（根干重）和（抽梢率）等，可间接判断某品种的产量。

茶树根原花青素提取工艺及检测方法的优化

茶树根原花青素提取工艺及检测方法的优化
蒋晓岚;孟菲;刘亚军;万根文;吴珂;夏涛;高丽萍
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2013(40)6
【摘要】茶树（Camellia sinensis（L．）O．Kuntze）中含有丰富的多酚类化
合物，统称为荼多酚，包括黄烷醇、黄酮、黄酮醇、花青素、原花青素和酚酸类等。

对茶树根中原花青素的提取工艺进行优化，筛选出最佳的提取工艺条件：丙酮浓度80％、提取时间35min、提取温度50℃、加酸量0．25％。

对多酚的检测方法-
香草醛法、对二甲氨基肉桂醛（DMACA）法进行了系统性的优化，结果表明香草醛法最优条件：0～25℃、反应时间15min、硫酸体积分数为50％、香草醛浓度
为10g·L^-1。

对二甲氨基肉桂醛（DMAcA）法最优条件：0℃、5min内、盐酸
浓度1．2mol·L^-1、DMACA浓度2g·L^-1。

【总页数】8页(P891-898)
【作者】蒋晓岚;孟菲;刘亚军;万根文;吴珂;夏涛;高丽萍
【作者单位】安徽农业大学教育部/农业部茶叶生物化学与生物技术重点开放实验室;安徽农业大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S571.1;TS272
【相关文献】
1.茶籽壳原花青素提取参数优化
2.响应面法优化“紫娟”茶中花青素提取工艺的研究
3.超声波结合酶法提取葡萄皮渣原花青素工艺优化及其抗氧化活性
4.响应面试验优化蓝靛果籽原花青素提取纯化工艺及其抗肺癌细胞A549活性
5.微波辅助低共熔溶剂高效提取油茶壳原花青素的工艺优化
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牛皮杜鹃RAPD反应体系的优化

牛皮杜鹃RAPD反应体系的优化宫宇;刘宪虎;李美善;许明子;张春影;吴琼【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2010(038)012【摘要】[目的]建立牛皮杜鹃RAPD反应体系.[方法]以野生牛皮杜鹃的叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,并对影响RAPD扩增反应的各因素进行优化.[结果]适合牛皮杜鹃的RAPD反应体系为:在20 μl PCR反应体积中加模板DNA 10 ng,Mg2+ 浓度1.5 mmol/L,引物OPC05 15 pmol/μl,dNTP 0.15mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U.[结论]该研究为牛皮杜鹃的遗传多样性分析提供了有益的参考.【总页数】3页(P6134-6135,6196)【作者】宫宇;刘宪虎;李美善;许明子;张春影;吴琼【作者单位】延边大学农学院农学系,吉林龙井,133400;延边大学农学院农学系,吉林龙井,133400;延边大学农学院农学系,吉林龙井,133400;延边大学农学院农学系,吉林龙井,133400;延边大学农学院农学系,吉林龙井,133400;延边大学农学院农学系,吉林龙井,133400【正文语种】中文【中图分类】S685.21【相关文献】1.杜鹃花属植物基因组DNA RAPD-PCR反应体系的优化 [J], 段国峰;肖千文2.大字杜鹃RAPD反应体系的优化 [J], 姬文秀;金东淳;李虎林;鲁艺3.基于均匀设计优化牛皮杜鹃嫩叶直接再生芽苗及植株再生体系 [J], 李玉梅;姜云天;孙智慧4.均匀设计法优化牛皮杜鹃腋芽丛生芽苗及高频植株再生体系研究 [J], 王艳萍;顾地周;卢存福5.正交试验设计在建立杜鹃花RAPD-PCR反应体系中的应用 [J], 张丽;周兰英;肖千文;吴开志因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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３０ｓ０
关键词：ＡＤ茶树；化ＲＰ；优
中田分类号：３ｌｌｓ２蛳
文献标识码：Ａ
文章编号：ＧＴ７４｛０２０－１９Ｍ／Ｏ－８７２０）２７４０
ＳｕｙｏｔｄｎＲＡＰＡｎｌｓｓＳｓｅｎＴｅａｔＤａｙｉｙｔｍｉａＰｌｎｓ
要因素进行了研究，定了茶树ＲＰ确ＡＤ的最适反应维系和扩增程序，即在３反应体系中，４ｇ板，Ｏ台０ｎ模
２ｎａｌＭｇｍｏ／ＬＯ
，，
＿
９４℃，８；２步变性９ ℃ ，；３步退戈３Ｉｓ第ｏ２５ｓ第Ｏ５℃，０；５第４步链延伸７ ℃ ，ｅ；ｓ２ｌｓ循环４次，ｏ１后延伸７ ℃ ，２
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第６卷第２期２０年６月０２
生命科学研究
ＬｉＳｉห้องสมุดไป่ตู้ ｅＲｅｅｒｈｃｅｃｓａｃ
ｖ１６Ｎｏ２（．Ｉ
ＪｎＯ２ｕｅ２Ｏ
茶树ＲＰ分析体系的优化ＡＤ
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ＡｓａｔｈｐｉａｒｃｏｉｕｅｎｐｉｃｔｎｐｏｅｕｅｆＡＤｉＦｄｎａａＣａＣｍｌａｓｅ— ｂｔｃ：ＴｅｏｔｌｅｔｎｍｘｒａｄａｌａｏｒｄｒｏＰｕｉＤｂｉｈ【ａｅｉｉｎｒｍａｉｔｍｆｉｉｃＲｎｇｌｎｓ（．Ｏ．ｕｔｗｓｓｄｄｗｔＡｒａｅｏｌｎｃｉ（ｅｅ一Ｃ１ｏ．１ｅｒｓｌｈｗｄｔｔｉＬ）ＫｎｅａｔｉｉｍｅｃｎｔｍｔｅｍｈｅＭｌｓｚｕｅｈｉｈ￣ｃｎｄ．０）１ｕｓｓｏｅａ１ｅｔｈｅｃ０ａｐｉｃｔｎｅｃｉＯｔｎｗｓｏｓｔｆ０ｉ）ｔＤＡ，ｍｌｃ０２ｎｌＮＰａｈ３ｍｌａｏａｔｎＳｌｉａｎｉｅｏ４ｇｔｌｌｅＮ２ｏＬＭｇｋ，．ｍ／ｄＴｉｆｉｒｏｕｏｃｓｄｅｌａ［ｍ／ｍＬ
Ｋｅｒｓ：ＲＤ；ｍｅｌｉｅ￣；ＯｐｉｚｎｙｗｏｄＡＰＣａｌａｓｎｍｉｔｍｉｉｇ
（ｉｃｅｃｅｅｒ２０６２：７ＬｆＳｉｒｅＲｓａｃ０２、（）１９～１２ｅｔｈ，８）
ＲＰＡＤ技术是现代分子生物学研究的重要手段之一，它能在ＤＡ分子水平上反映样品问的差Ｎ异．由于用量少、结果不受采样部位和时间的影且响，ＡＤ技术已广泛应用于种质遗传多样性分ＲＰ析、种鉴定、传图谱构建和分子标记辅助选品遗
ｏａｈ．１ｎｌＬｐｉｒａｄ１．Ｔａｆｅｃ０．５ｍｏ／ｒｍｅｎ５ＵｑＤＮＡｐｌａｒｓｏｙｅａｅ．１１ｍｐｉｃｔｎｐｏｅｕｅｃｎｉｉｎｒｒｄｎ — ￣１ｅａｌａｉｒｃｄｒｏｄｔｓｗｅｐｅｅａｉｆｏｏｅ
２ＣｏｅｅｎｉｅｎｒＣｎＥｇｅｉｐｎｒｇ嘶Ｌｂｒｏ＂ａｏｌｏ￣Ｐｏｉｅｔｍ．ｎｔｕｅｎｅｉ，‰ ｒ：ｃ，Ｈｍ４￣ｄｒＵｉｒｔｌｎｘｇｔａｓｙ
，ＨｎｎＡｄｕｕｎｅ，Ｃａｇｈ１１８Ｈｎｎ－ｈａ；ｕｖｇｃｋｒＵｉｒ．ｅｔｓｈｎｓ４０２，ｕａＣｉａｎ４０２，Ｈｔ ‰ １１８￣ａｎ，
沈程文罗军武刘春林。唐和平，，，，黄意欢
（湖南农业大学食品科学技术学院，１中国湖南长沙４０２；１１８
２湖南农业大学作物基固工程湖南省重点实验室，中国湖南长沙４０２）１１８
摘
要：以福鼎戈白茶为材料，用美国的ＰＣｌ０、采Ｔ —０热循环仪，对茶树ＲＰＡＤ分析中影响ＰＲ扩增结果的主ｃ各０２ｄＬｌｓ０１ａｏＬ引物和ｌａＮｍｍ／ｄ￣Ｐ、５ｌ￣ｎ５ＵＴｑＤＡ聚合酶：扩增程序为：１步预变性第
ＳＮＣｅｇｗｒ．Ｌｕ．。Ｉｈｎ１ＨＥｈｎ — ｅｌＵＯＪｎｗｕ，ＬＵＣｕ．ｉ，ｎ
ＴＡＮＧ — ｉｇ，ＨＵＡＮＧ．ｕｎＨｅｐｎ。Ｙｉｈａ
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ｔｒｔ４ ℃ １０Ｓｌｗｙｄｎｔｒｔ２ ℃ ５．ａｎａｉｇ３ｕｅａ９８ｆｌｅｂｅａｕｅａ９ｏｏｄ０Ｓｎｅｌ５℃ ｆｒＯｓｘｅｓｎ７ｎｎ＿５．ｅｔｎｉ２℃ ｆｒ１０Ｓｙｌｇｏｏ（，ｃｃｉ３ｎ４ｉｓａｔｅｔｎｉｎ３０ｓａｄｔｅｌｈｐｉｌｒｃｄｒｏａｐａｔＮＡａｈｅｆｌｗｓｏｔｉｅ．１ｔｍｅ．１ｘｅｓ０ｎｈｌｔｅｏｔｓｏｍｕ１ｏｅｕｅｆｒｔｌｎｌｐｅＤｍｐｆａｏａｂａｎｉｉｄ