余姚市鼠伤寒沙门菌耐药性分析

·疾病控制·余姚市鼠伤寒沙门菌耐药性分析罗学辉1，黄邵军1，张建群1，杨元斌21.余姚市疾病预防控制中心，浙江余姚315400；2.宁波市疾病预防控制中心摘要：目的了解余姚市鼠伤寒沙门菌耐药性和相关耐药基因特征，为鼠伤寒沙门菌的流行研究和防控提供依据。

方法于2015—2017年采集余姚市主城区河水、食品、食源性疾病患者粪便标本，分离、鉴定鼠伤寒沙门菌，选用9类21种抗生素进行药敏试验及相关耐药基因检测；选取2016年食源性疾病患者粪便分离株进行脉冲场凝胶电泳分型。

结果2015—2017年检测标本1594份，检出沙门菌277株；其中鼠伤寒沙门菌118株，占42.60%。

118株鼠伤寒沙门菌对利福平、四环素、氨苄西林和哌拉西林的耐药率较高，分别为98.31%、94.07%、87.29%和61.02%；对诺氟沙星均敏感；对哌拉西林/他唑巴坦、氧氟沙星、环丙沙星和亚胺培南均有1株耐药；耐多药89株，占75.42%，以青霉素、四环素、利福平三重耐药的最多，有34株。

OXA 基因的检出率为17.80%，TEM 基因检出率为44.07%，CTX-M 基因检出率为27.12%，Ⅰ类整合子基因检出率为57.63%。

结论余姚市流行的沙门菌优势血清型以鼠伤寒为主，有较高的耐药率，携带多种耐药基因。

关键词：鼠伤寒沙门菌；耐药；基因中图分类号：R331文献标识码：A文章编号：2096-5087（2019）05-0484-04DOI ：10.19485/ki.issn2096-5087.2019.05.013基金项目：余姚市科技项目（2016YZD02）；宁波市医学科技项目（2018A24）作者简介：罗学辉，本科，主任技师，主要从事微生物检验工作通信作者：罗学辉，E-mail ：zjyylxh@沙门菌是引起食源性疾病的主要病原体［1-2］。

目前已确认的2500余种沙门菌血清型中，鼠伤寒沙门菌为常见血清型。

近年来，鼠伤寒沙门菌为余姚市食源性疾病病原菌的优势菌型，在主城区河水和食品中检出率也高居第一位［3-4］。

于2015—2017年对余姚市主城区的河道、农贸市场以及食源性疾病哨点医院鼠伤寒沙门菌进行监测，对检测和收集的鼠伤寒沙门菌菌株进行耐药性分析，并对部分菌株进行耐药基因和脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis ，PFGE ）分析，为余姚市鼠伤寒沙门菌的流行和防控研究提供依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1标本来源2015—2017年标本采集自余姚市主城区河水、农贸市场食品和食源性疾病患者粪便。

1.1.2试剂和仪器亚硒酸盐胱氨酸增菌液（selenitecystine borth ，SC ）、亚硒酸盐煌绿增菌液（selenite brilliant green broth ，SBG ）、SS 琼脂（Salmonel-la-Shigella agar ，S S ）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（xylose lysine deoxycholate agar ，XLD ）、三糖铁琼脂（triple-sugar iron agar ，TSI ）和水解酪蛋白琼脂（M-H ，青岛海博生物技术有限公司），科玛嘉沙门菌显色培养基（郑州博赛生物技术有限公司），沙门菌诊断血清（宁波天润生物药业有限公司、丹麦国立血清研究院），21种抗生素纸片（英国Oxoid 公司），GN 细菌生化鉴定条和VITEK 2compact 30细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司），0.45μm 滤膜和MILI-PORE 3702液体微生物过滤系统（法国密理博公司），PFGE 仪、VersaDoc3000凝胶成像仪（中国Bio-Rad 公司）。

所有材料、试剂均在有效期内使用。

1.2方法1.2.1菌株分离参照GB 4789.4—2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》［5］、《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》和《浙江省食品微生物及其致病因子监测工作手册》进行食品检验。

参照《浙江省食源性疾病监测工作手册》对食源性疾病患者粪便标本进行检验。

通过0.45μm 滤膜抽滤500mL 水样后，将滤膜置于50mL SBG 增菌液中，摇匀，36℃增菌18h 后，划线接种SS 、XLD 和科玛嘉沙门菌显色培养基，同时将SBG 增菌液继续培养18h 后再用上述选择性培养基分离。

1.2.2菌株鉴定及分型从SS 、XLD 和科玛嘉沙门菌显色培养基挑取可疑菌落接种于克氏双糖铁琼脂，36℃培养24h，结果为K/A，产气＋/－，H2S＋/－的菌株用GN细菌生化鉴定条，经VITEK2compact 30细菌鉴定仪做系统生化鉴定，符合沙门菌生化的菌株以血清学试验确定血清型，用宁波天润生物药业有限公司的沙门菌诊断血清做初筛，用丹麦国立血清研究院的沙门菌诊断血清复核，并根据《沙门菌属血清型诊断》［6］确定沙门菌血清型。

1.2.3药敏试验按纸片法抗菌药物敏感试验标准（CLSI）［7］进行，以标准菌株大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株，选用9类共21种抗生素，对3类或以上耐药判定为耐多药（multidrug resistance，MDR）。

1.2.4耐药基因检测挑取适量菌落，煮沸法制备细菌基因组模板。

采用引物序列［8］进行耐药基因检测，包括β-内酰胺类抗生素相关耐药基因：CTX-M、OXA、TEM以及Ⅰ类整合子基因（int）。

采用rTaq2X预混试剂为PCR反应液，反应体系20μL，模版2μL，30个循环。

PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，观察预期条带。

引物序列见表1。

表1相关耐药基因引物情况引物序列目标基因产物大小（bp）CTX-M-F F：5'-AAA ACT TGC CGA ATT AGA GCβ-lactamase711 CTX-M-R R：5'-TTA GGT TGA GGC TGG GTG AA711 OXA-F F：5’-AATGGCACCAGATTCAACTTβ-lactamase593 OXA-R R：5’-TGGCTTTTATGCTTGATGTT593 TEM-F F：5'-TGTCGCCCTTATTCC CTTTTβ-lactamase783 TEM-R R：5'-ATAGTTGCCTGACTCCCCGT783int-F F：GCGTTCGGTCAAGGTTCTGGⅠ类整合子287int-R R：ACCGCCAACTTTCAGCACAT2871.2.5PFGE试验参照中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络（PulseNet China网络实验室）的沙门菌PFGE标准实验步骤［9］，选择XbaⅠ内切酶进行酶切并采用PFGE仪进行PFGE，采用VersaDoc 3000凝胶成像仪进行读胶分析。

电泳图谱采用BioNumerics6.6软件进行聚类分析，采用PulseNet China网络实验室提供的ChinaMasterScripts v5.01插件的标准脚本建立数据库，并以H9812酶切片段作为分子量标准。

1.3统计分析采用SPSS18.0软件统计分析，率的组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果2.1鼠伤寒沙门菌检出情况2015—2017年共检测标本1594份，检出沙门菌277株，检出率为17.38%。

2015年主城区河水沙门菌检出率为75.00%（63/84），2016年为80.77%（21/26），2015—2016年总检出率为76.36%（84/110）。

食源性疾病患者粪便沙门菌2015年检出率为13.95%（68/491），2016年为14.56%（76/522），2017年为10.28%（33/321），2015—2017年总检出率为13.29%（177/1334）。

2016年食品沙门菌检出率为10.67%（16/150）。

277株沙门菌中鼠伤寒沙门菌118株，占42.60%，其中河水检出30株，检出率为27.27%；粪便检出82株，检出率为6.15%；食品检出6株，检出率为4.00%。

2.2药敏试验结果118株鼠伤寒沙门菌菌株中，对9类21种抗生素均不同程度耐药，其中对利福平、四环素、氨苄西林和哌拉西林的耐药率最高，分别为98.31%、94.07%、87.29%和61.02%；对诺氟沙星均敏感；对哌拉西林/他唑巴坦、氧氟沙星、环丙沙星和亚胺培南均有1株耐药，占0.85%。

见表2。

MDR 89株，占75.42%，其中以耐3类和耐4类为主，分别为36株和26株。

常见MDR谱为青霉素、四环素和利福平，有34株；其次为青霉素、四环素、利福平和磺胺类，有22株。

食源性疾病患者粪便分离株与食品和河水分离株对4种高耐药率抗生素利福平、四环素、氨苄西林和哌拉西林的耐药率比较差异均无统计学意义（χ2=0.040、0.016、0.050和0.038，P=0.841、0.898、0.823和0.845）。

2.3耐药基因检测结果对118株鼠伤寒沙门菌作β-内酰胺酶类抗生素相关耐药基因检测，其中OXA 基因检出率为17.80%，包括食源性疾病患者粪便中检出的15株和环境中检出的6株；TEM 基因检出率为44.07%，包括食源性疾病患者粪便中检出的35株和环境中检出的17株；CTX -M 基因检出率为27.12%，包括食源性疾病患者粪便中检出的7株和环境中检出的25株；int 基因检出率为57.63%，包括食源性疾病患者粪便中检出的44株和环境中检出的24株。

2.4PFGE 分型鼠伤寒沙门菌的PFGE 指纹图聚类分析显示，各菌株间差异较大，26株菌株均选取2016年食源性疾病患者粪便分离株，分属19种PFGE 基因型；余姚市分离的鼠伤寒沙门菌存在多样性，呈多克隆散发状态。

见图1。

3讨论余姚市自2013年发生大面积洪水后，食源性疾病患者粪便和环境中沙门菌的检出率居高不下，2015—2017年为沙门菌检出率的高峰，食源性疾病患者沙门菌检出率为13.29%，而河水中检出率高达76.36%，远高于余姚市以往沙门菌的检出率（3%左右）［10］，也高于其他地区的相关报道［11］。

鼠伤寒沙门菌占42.60%，和相关的报道结果［4，10］相近。

本研究选择2015—2017年检出的鼠伤寒沙门菌进行耐药性分析，结果显示，余姚市鼠伤寒沙门菌有较高的耐表2不同来源的鼠伤寒沙门菌菌株对21种抗生素药敏的试验结果［n （%）]抗生素类别抗生素名称患者粪便分离株（n =82）食品和河水分离株（n =36）敏感中敏耐药敏感中敏耐药青霉素氨苄西林9（10.98）0（0）73（89.02）6（16.67）0（0）30（83.33）哌拉西林26（31.71）5（6.10）51（62.19）10（27.78）5（13.89）21（58.33）β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制阿莫西林/克拉维酸78（95.12）0（0）4（4.88）31（86.11）3（8.33）2（5.56）哌拉西林/他唑巴坦81（98.78）0（0）1（1.22）36（100.00）0（0）0（0）氨曲南73（89.02）3（3.66）6（7.12）35（97.22）1（2.78）0（0）头孢类头孢唑啉71（86.59）0（0）11（13.41）35（97.22）0（0）1（2.78）头孢呋辛66（80.49）5（6.10）11（13.41）31（86.11）4（11.11）1（2.78）头孢塞吩70（85.37）1（1.22）11（13.41）35（97.22）0（0）1（2.78）头孢曲松71（86.58）1（1.22）10（12.20）35（97.22）0（0）1（2.78）头孢塞肟64（70.05）0（0）18（21.95）35（97.22）1（2.78）0（0）氨基糖苷类庆大霉素68（82.93）1（1.22）13（15.85）31（86.11）2（5.56）3（8.33）奈替米星68（82.93）5（6.10）9（10.97）34（94.44）1（2.78）1（2.78）妥布霉素66（80.49）0（0）16（19.51）31（86.11）1（2.78）4（11.11）喹诺酮类诺氟沙星80（97.56）2（2.44）0（0）36（100.00）0（0）0（0）氧氟沙星82（100.00）0（0）0（0）35（97.22）0（0）1（2.78）环丙沙星78（95.12）3（3.66）1（1.22）36（100.00）0（0）0（0）萘啶酸59（71.95）0（0）23（28.05）32（88.89）0（0）4（11.11）碳青霉烯类亚胺培南81（98.78）0（0）1（1.22）36（100.00）0（0）0（0）磺胺类复方新诺明59（71.95）1（1.22）22（26.83）25（69.44）0（0）11（30.56）四环素类四环素4（4.88）0（0）78（95.12）3（8.33）0（0）33（91.77）利福霉素类利福平0（0）0（0）82（100.00）2（5.56）0（0）34（94.44）图126株鼠伤寒沙门菌的PFGE 指纹图聚类分析ZJ_NB_SMJ1075ZJ_NB_SMJ1081ZJ_NB_SMJ1111ZJ_NB_SMJ1164ZJ_NB_SMJ1167ZJ_NB_SMJ1170ZJ_NB_SMJ1038ZJ_NB_SMJ1211ZJ_NB_SMJ1119ZJ_NB_SMJ1114ZJ_NB_SMJ1123ZJ_NB_SMJ987ZJ_NB_SMJ1045ZJ_NB_SMJ1077ZJ_NB_SMJ1163ZJ_NB_SMJ1166ZJ_NB_SMJ1172ZJ_NB_SMJ1122ZJ_NB_SMJ1039ZJ_NB_SMJ1162ZJ_NB_SMJ1213ZJ_NB_SMJ1047ZJ_NB_SMJ1175ZJ_NB_SMJ1043ZJ_NB_SMJ1215ZJ_NB_SMJ986PFGE-XbaItomatic infection of severe fever with thrombocytopenia syndromevirus through blood contact［J］.Intern Med，2014，53（8）：903-906.［5］张磊，张严峻，丁刚强，等.浙江省首次发现新型布尼亚病毒感染病例及分离病毒分子鉴定［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2011，31（12）：1107-1111.［6］易波，高丽，孔志芳，等.宁波发热伴血小板减少综合征流行病学监测结果分析［J］.浙江预防医学，2015，27（2）：127-130.［7］胡艳，岑章建.2011—2015年信阳市发热伴血小板减少综合征监测结果分析［J］.现代预防医学，2016，43（19）：3601-3603.［8］吕勇，徐鹏鹏，孙婕，等.六安市2011—2015年发热伴血小板减少综合征监测结果［J］.中国热带医学，2017，17（8）：809-812.［9］王永梅，曲熙波.一起家庭聚集性发热伴血小板减少综合征疫情的调查分析［J］.国际流行病学传染病学杂志，2016，43（1）：62-64.［10］刑学森，聂绍发，占发先，等.发热伴血小板减少综合征流行特征和传播途径研究［D］.武汉：华中科技大学，2016.［11］雷志华，冯文清，潘声旺，等.信阳地区发热伴血小板减少综合征病例临床及流行病学特征［J］.长治医学院学报，2014，28（1）：35-39.［12］王庆奎，葛恒明，胡建利，等.发热伴血小板减少综合征病毒在鼠体内携带情况的调查［J］.现代预防医学，2013，40（15）：2902-2904.收稿日期：2018-12-06修回日期：2019-02-21本文编辑：徐文璐药性，对利福平耐药率最高（98.33%）、其次为四环素（94.07%）、氨苄西林（87.29%）和哌拉西林（61.02%），高于深圳市［12］的报道，且耐多药现象较为严重，75.42%的菌株至少3类以上的抗生素耐药，患者和环境中检出的鼠伤寒沙门菌对上述4种抗生素耐药性结果均相近，提示余姚市沙门菌严峻的耐药状况。