实验24 黑曲霉发酵生产柠檬酸
解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺
解析玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺摘要：本文通过试验探究的方式，以玉米清液为原料，以黑曲霉作为发酵菌株。
通过单因素筛选的方式优化清液培养基，并根据产酸量、菌丝球形态等，对各项指标进行明确，实现柠檬酸产量最大化目标。
根据试验结果可知，将初糖浓度设定为18%、采用分段通风转速控制方式，在发酵超过48h后可使柠檬酸产量达到最大值，即18.33g/100mL，糖酸转化率达到101.8%。
与传统带渣发酵相比，产酸量与转化率得到显著提升。
关键词：玉米清液；柠檬酸；发酵生产引言：粗玉米中蕴含着丰富的蛋白质，直接用其生产柠檬酸会使菌体飞速生长，对产酸造成严重阻碍。
为避免这一情况，可将玉米粉液化后清楚残渣，液内蛋白质含量较低，利用清液发酵柠檬酸，不但可缩短发酵周期，还可提高转化率。
当前，国内许多工厂已经陆续普及此种工艺，为提高玉米资源利用率，应对发酵生产工艺进行细致分析。
1试验材料与方法1.1材料与仪器本试验的菌株为黑曲霉；主要试剂为酵母粉、无水葡萄糖、FeSO4、玉米浆、a-淀粉酶，剂量为40000U/mL，肌醇；培养基为马铃薯葡萄糖琼脂、种子基础与发酵基础培养基；主要仪器设备为光学显微镜，型号为OLYMPU719068；电子天平，型号为FA2004N；总糖计，型号为WYT-J；恒温振荡器，型号为HZQ-QX；发酵罐，剂量为30L。
1.2试验方法1.2.1初糖含量与柠檬酸产量关系将清液中初糖浓度分别设定为16%、18%和20%，按10%接种量，在36.5℃、转速为400r/min、罐压为0.1MPa、通风为400L/h环境下发酵。
在初始发酵时，每间隔8h分别从不同浓度罐体内取样，对液体PH值与柠檬酸产量进行测定，在放罐完毕后称取菌丝体净重，检测净重变化情况，并检测残还原糖值[1]。
1.2.2还原糖测定通过费林试剂热滴定方式，以亚甲基蓝作为指示剂进行测定。
在空白滴定方面，分别吸取甲乙液体各5ml，放入250ml的锥形瓶内，滴入19ml左右的葡萄糖标准液，加热至沸腾，沸腾时间为30s，每2s滴入1滴，直至溶液蓝色消失，测定葡萄糖溶液的总体积，反复操作3次，记录平均值。
柠檬酸发酵机制
dS dt
1
dX dt
2
dCO2 dt
3
dP dt
4
若定义：
1 X
dS dt
（微生物的基质消耗比速）
1 X
dX dt
（微生物的生长比速）
Q CO2 1 dCO2 （微生物的CO2生成比速）
X dt
QP
1 X
dP dt
（微生物的产物生成比速）
则，上式可简化为：
❖ 二、M生长代谢过程中的ATP循环与氧平衡 ❖ 1、ATP循环
合成代谢
繁殖
AT
分解代谢
AD
P
P
维持代谢
❖ 2、ATP的产生——生物氧化 ❖ 复习： ❖ 底物水平磷酸化(获得能量少) ❖ 电子传递水平磷酸化(获得能量多)
生物氧化
有氧氧化
氧化酶 无传递体系
需氧脱氢酶
NAD传递 电子传递体系
FAD传递
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的 抑制，使EMP畅通无阻。
（2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水 合酶失活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：
1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好
③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。
④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢 酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
7 黑曲霉发酵柠檬酸
实验目的
了解产物发酵生产的机理； 了解产物发酵生产的机理； 柠檬酸发酵的发酵条件 掌握发酵过程步骤
实验原理
柠檬酸的发酵
80%的糖代谢走EMP途径
生产菌中存在TCA的酶系
草酰乙酸的来源不是由TCA 供应，而是由2个CO2固定 提供，故C0mL三角瓶） 每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠 其他灭菌物品 （每组1套） 小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干， 培 养皿每组1包（每包不少于6个）
问题与思考 影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因 素有哪些？ 素有哪些？ 试设计分离筛选酵母菌发酵生产 酒精实验并阐述酒精产生机理
实验步骤
菌种获得（纯种） 种子液制备 无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上， 用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制 成孢子悬液。 液体深层发酵 无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇 瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇 床上，30℃培养5～6天。
后续实验准备 黑根霉的分离培养 制作马铃薯培养基平板2块 单号组用接种环无菌操作，从酒酿样品中挑取 1环，在1块马铃薯培养基平板上进行划线分离。 双号组取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻珠的无 菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL， 在1块马铃薯培养基平板上进行均匀涂布。 另外一块平板置于冷藏柜备用。 将划好的培养基平板置于517房间30℃培养箱 内正置培养3天，至周一进行结果观察和转接。
柠檬酸发酵的条件： 柠檬酸发酵的条件：
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖 等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源 （铵盐）； 3、合适的pH值； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速 250r/m）； 5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含 量。
黑曲霉产柠檬酸菌种最优发酵条件探究_胡恺夫
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ｋ1 Ｋ
2
Ｋ3 ｋ1 ｋ2 ｋ3 Ｒ
表 3 第 1次正交实验结果分析
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ 2112产酸量 /( )
1
1
1
1
1.5 6
1
2
2
2
0.8 7
1
3
3
3
3.8 0
2
1
2
3
2
2
3
1
0.7 6 0.7 6
2
3
1
2
0.9 9
3
1
3
2
1.2 9
3
2
1
3
1.0 1
3
3
表 4 第 2次正交实验 2112培养基 Ｌ9(34)的因素水平表
Ａ淀粉 水平
Ｂ(ＮＨ4 )2ＳＯ4
ｐＨ
/( )
/( )
麸皮 /( )
1
22
0.3
3.5
0.6
2
19
0.2
4.0
0.4
3
16
0.1
4.5
0.2
第 7卷 第 6期
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
· 149·
表 5 第 2次正交实验 2112结果及极差分析
择各因素的相应水平 , 设计正交实验表 , 进行多次 出 , 实验室保藏的 11株产柠檬酸菌种在玉米淀粉
正交实验以探索菌种产酸的最优条件 。
水解糖培养基中的产酸量均高于葡萄糖和蔗糖的 ,
3.3.3 发酵稳定性实验
选取产酸率较高的 2112菌株为正交实验用菌种 。
对获得的菌种及其最优发酵条件进行多次发酵 3.2 正交实验
两阶段搅拌转速控制策略发酵生产柠檬酸
两阶段搅拌转速控制策略发酵生产柠檬酸
作者：李佳伟， 刘龙， 李江华， 堵国成， 陈坚， 孙福新， LI Jiawei， LIU Long， LI Jianghua， DU Guocheng， CHEN Jian， SUN Fuxin
作者单位：李佳伟,刘龙,李江华,LI Jiawei,LIU Long,LI Jianghua(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122)， 堵国成,陈坚,DU Guocheng,CHEN Jian(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室
,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)， 孙福新,SUN Fuxin(宜兴
协联生物化学有限公司,江苏宜兴,214203)
刊名：
食品与生物技术学报
英文刊名：Journal of Food Science and Biotechnology
年，卷(期)：2014,33(2)
本文链接：/Periodical_wxqgdxxb201402004.aspx。
7 麦明谦 柠檬酸的发酵
柠檬酸的发酵一．实验简介柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸或2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是水果中含量极为丰富的一种有机酸。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸，黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径为：首先将玉米中的淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸再由氧化酶氧化成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰CoA,然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰离子等金属离子的条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受到阻遏，TCA循环变成“马蹄形”代谢汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累，达到生产的目的。
二．实验的试剂和材料玉米淀粉、黑曲霉、a-淀粉酶、水、碳酸钙、无菌水、0.1429mol/LNaoH、酚酞指示剂三．实验仪器及设备三角瓶300ml 、玻璃棒、电子称、摇床、水浴锅、高压灭菌移液管、带塞的三角、接种环四．实验步骤1.黑曲霉孢子悬液的制备:(1)培养基的配制①配方：硝酸钠1.5g 磷酸氢钾0.5g 硫酸镁0.25g 氯化钾0.25g 硫酸亚铁0.005g 蔗糖15g 琼脂10g 蒸馏水500ml PH 5.0-6.0②称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入烧杯中。
③熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述烧杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。
④定容：将加热后的培养基倒入量筒中，用自来水进行定容，至500ml。
⑤调PH：待培养基稍冷却后，用精密的PH试纸测量培养基的原始PH，若偏酸，用1mol/LnaoH边滴边加边搅拌，使之达到PH5.0-6.0；若偏碱，则用1mol/L调节。
⑥分装：用分装装置将培养基装入培养皿中，高度在培养皿高度的三分之一左右。
⑦灭菌：将培养皿用牛皮纸包扎好，放在0.1Mpa，121℃，20min 高压蒸汽灭菌。
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取
综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。
6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
_柠檬酸发酵工艺
送带 8一鼓风机 9一空调室 10一循环风道 11-室闸门
b 厚层通风发酵
与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚 层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的 15~20cm要大出许多。
为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械 通风。
培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似， 但最高品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风 来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻 料。
b 厚层通风发酵
厚层发酵与空气的接触面小，所以需要在容器底部 设置空气通道，以利于通氧，这种发酵设备又称发 酵箱，这种发酵箱为厚层通风制曲箱，简称曲箱。 大型的曲箱可以配置翻曲机，这样曲层可以加厚。
机械通风固体曲发酵设备
1一输送带 2一高位料斗 3一送料小车 4一曲料室 5一进出料机 6一料斗 7一输
c 一般发酵法影响表面发酵的因素
a) 培养液层厚度 b) 糖浓度 c) 温度 d) pH值 e) 通风
③ 固体发酵
分为浅盘发酵和厚层通风发酵，统称曲法发酵。 固体发酵工艺具有的优点： （1）设备简单，投资少； （2）操作简单，能耗低，适应性强； （3）原料粗放，来源广泛，培养基简单； （4）发酵时间短 缺点是设备占地面积大、劳动强度大，传质传热 困难，产品回收率低，副产物多等。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求 以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培 养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（1）发酵温度 黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在28~30℃，柠檬酸 产率最高，发酵速度较快，超过35℃时，虽然初 期产酸较快，但最终的发酵产率降低15%以上。 为了节约降温能耗，我国成功培育出高温发酵的 产酸微生物，可以在37℃发酵。 （2）pH
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黑曲霉发酵生产柠檬酸
柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。
另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。
柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。
1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。
至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。
5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的
了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。
2、实验原理
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为:
O H O H C O O H C 27862612625.1+→+
柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。
3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料
① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。
② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。
③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。
④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。
⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。
（2） 试剂
0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲和乙溶液、0,01%标准葡萄糖溶液、淀粉酶（中
温酶和高温酶）
（3）实验流程
保藏菌株→活化菌株（斜面培养）→200mL三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。
（4）斜面培养基:
①马铃薯琼脂培养基去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g，溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20min，取出摆成斜面备用。
②麦芽汁琼脂培养基2/3大麦芽加1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉:水＝1:4比例加水，置60℃下糖化4h至碘液显示无色，然后离心15min，获得麦芽汁（或取啤酒厂未加酒花的麦芽汁）调整浓度50Brix，添加25g/L琼脂，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。
于121℃灭菌15~20min，取出摆成斜面备用。
③一级种子（麸曲种子）培养基
含麸皮的查氏培养基（g/L）：蔗糖30；KNO31.0；K2HPO41.0；MgSO4·7H2O 0.5；KCI 0.5；FeSO4·7H2O 0.01；调节pH7.0~7.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，拌匀至无干粉又无结团，分装入8~10个500mL三角瓶中,塞入8层纱布并包扎好。
于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮:水＝1:1.0～1.3比例加水,拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。
上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装80～100g湿料，塞入8层纱布并包扎好。
于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
④摇瓶发酵培养基
取细度为40目以上的薯干粉6～8g，装入500mL三角瓶中，再加入40mL水和5个单位α-淀粉酶（中温）/g薯干粉，于75~80℃下液化15min，瓶口塞入8层纱布包扎好，于110℃灭菌15~20min，冷却备用。
（5）玉米粉液化
取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中，加入1000mL水和7~8个单位α-淀粉酶（高温）/g玉米粉，于80℃液化10min后，继续加热至90℃保温30min，碘检不变色后，再加热到100℃煮沸（5~10min），趁热经过二层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15~20%和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤清夜40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞入8层纱布包扎好，于121℃灭菌15~20min，冷却备用。
4、实验步骤及方法
（１）种子制备
①斜面种子制备用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35℃恒温箱中培养3~5d，待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。
②孢子悬浮液的制备用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子振荡数分钟。
每支斜面的孢子悬浮液可接2~3瓶麸曲三角瓶。
③吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻陪拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于30~32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，于35℃下培养，每隔12~24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养3~4d，即成种曲。
（２）摇瓶发酵培养
将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。
接
种量：一支斜面接4~5瓶，一瓶麸曲孢子接20~35瓶。
500mL三角瓶装液量为40mL，于转速为200r/min（24h前为100r/min，24h后为200r/min）、300r/min（24h前为100r/min，24h 后为300r/min）旋转摇床上，35℃下培养3~4d。
（３）发酵过程检测
①发酵0h、24h、48h、72h、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。
②柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429mol/LNaOH溶液滴定
发酵过滤清夜
③总糖及残糖(还原糖)测定: 采用斐林试剂法。
5、实验结果与记录
表5-3 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵（24h前为100r/min，24h后为200r/min）
6、实验数据处理
（1）平均耗糖速率（g/h）：单位时间内黑曲霉消耗糖（还原糖）的克数。
（2）平均柠檬酸生成速率（g/h）：单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。
（3）糖酸转化率（％）：黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖（还原糖）的克数之比的百分数。
7、实验结果与讨论
（1）试以发酵时间为横座标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵座标作图，
说明三者随发酵时间的变化，并加以分析。
（2）试比较表1与表2的结果，阐述通风量对柠檬酸发酵产酸的影响。
8．参考文献
（1）王博彦、金其荣.《发酵有机酸生产与应用手册》北京.中国轻工业出版社.2000.
（2）罗大珍、林稚兰.《现代微生物发酵及技术教程》北京.北京大学出版社.2006.
9．预习与思考题
请预习《发酵有机酸生产与应用手册》和《现代微生物发酵及技术教程》中柠檬酸发酵部分并思考：
（1）柠檬酸发酵关键技术是哪些？
（2）若要提高柠檬酸发酵产量和发酵的糖酸转化率，应再考虑设计哪些实验？。