间充质干细胞(MSCs)的分离方法研究
干细胞提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在从骨髓中提取间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），并对其进行初步鉴定，为进一步的实验研究提供细胞来源。
二、实验材料1. 大鼠骨髓：购自动物实验中心，新鲜取材。
2. DMEM/F12培养基：购自Gibco公司。
3. 胎牛血清（FBS）：购自Gibco公司。
4. 0.25%胰蛋白酶：购自Gibco公司。
5. 抗CD29、CD34、CD45抗体：购自BD公司。
6. 流式细胞仪：购自BD公司。
7. 其他试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、PBS含2%FBS、4%多聚甲醛等。
三、实验方法1. 骨髓采集：将大鼠麻醉后，无菌操作下取出髌骨，用剪刀剪成小块，置于含有PBS的离心管中，充分漂洗后，用镊子将骨髓组织分离出来。
2. 骨髓细胞消化：将分离出的骨髓细胞用PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶消化5分钟，再用PBS终止消化。
3. 骨髓细胞计数：将消化后的细胞用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。
4. 骨髓细胞培养：将骨髓细胞接种于DMEM/F12培养基中，添加10%FBS，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
5. 细胞传代：当细胞贴壁生长至80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代至新的培养瓶中。
6. 细胞鉴定：取第3代细胞，用抗CD29、CD34、CD45抗体进行流式细胞仪检测，分析细胞表型。
四、实验结果1. 骨髓细胞在培养箱中贴壁生长，形态呈梭形。
2. 流式细胞仪检测结果显示，骨髓细胞表达CD29、CD34，不表达CD45。
3. 骨髓细胞表现出典型的间充质干细胞表型。
五、实验结论本实验成功从大鼠骨髓中提取了间充质干细胞，并通过流式细胞仪检测验证了其表型。
这为后续的实验研究提供了可靠的细胞来源。
六、实验讨论1. 骨髓是MSCs的重要来源之一，具有来源丰富、易于获取等优点。
2. 本实验采用胰蛋白酶消化法分离骨髓细胞，操作简便，细胞活力较高。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
送检中检验机构间充质干细胞质量标准
送检中检验机构间充质干细胞质量标准引言充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作为一种多潜能的干细胞，被广泛应用于组织工程、再生医学以及免疫治疗等领域。
由于充质干细胞的质量直接关系到其临床应用的效果和安全性，各个检验机构在进行充质干细胞的质量检验时需要遵循统一的标准。
本文档旨在制定一份统一的充质干细胞质量标准，以确保不同检验机构之间的一致性。
标准内容1. 充质干细胞定义充质干细胞为一类具有自我更新和多向分化潜能的成人软组织起源的凋亡细胞。
2. 充质干细胞分离与培养2.1 分离方法：推荐使用胶原酶及胰酶对组织进行消化分离。
分离过程中需注意细胞的存活率和纯度。
2.2 培养条件：充质干细胞应在适当的培养基中进行培养，包括适宜的营养液、培养基浓度及PH值等。
3. 充质干细胞鉴定3.1 表面标记物：充质干细胞常表达CD73、CD105、CD90，并不表达CD34、CD45和CD11b等表面标记物。
3.2 多向分化潜能：充质干细胞应具备成骨、成脂以及成软骨的分化潜能。
4. 充质干细胞增殖能力充质干细胞应具备较高的增殖能力，通常满足以下条件：- 能够快速扩增至临床所需的细胞数量；- 经带有标记的试剂进行检验，其增殖指数要达到一定的标准。
5. 充质干细胞免疫学特性5.1 免疫抑制作用：充质干细胞应具备对淋巴细胞等免疫细胞的抑制作用。
5.2 免疫抗原性：充质干细胞应具备较低的免疫原性，以减少免疫排斥反应。
结论本文档提供了送检中检验机构间充质干细胞质量标准的基本内容，以确保对充质干细胞的质量检验具有一致性。
各个检验机构应根据实际需求，在此基础上进行进一步的细节制定，以提高充质干细胞的质量控制水平。
在追求高质量代码的同时，本文档已经超过了800字，如需进一步扩展内容或有其他要求，请告知。
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
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间充质干细胞（MSCs）的分离方法研究
发表时间：2016-11-29T12:22:49.340Z 来源：《医师在线》2016年10月第19期作者：唐立敏
[导读] 间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力。
江苏省泰州市人民医院检验科江苏泰州 225300
摘要：间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。
并且MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。
目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。
MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。
本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
关键词：间充质干细胞（MSCs），组织工程，流式细胞仪，差速贴壁培养法，定向分化，传代培养，CD13、CD29，多向分化1，资料与方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞, 具有多向分化能力，如具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管内皮细胞及神经星形胶质细胞分化的潜能。
MSC体外较易分离培养、扩增，细胞免疫原性低，易于转染并能长期表达外源基ha因等特点，故已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。
MSC存在于体内多种组织，人们已经从骨、脂肪、脐血及脐带等多种组织中成功分离培养出间充质干细胞，但血管组织中MSC的分离培养及功能研究未见报道。
骨髓是MSC分离培养的主要组织来源，但由于 MSCs还可以存在于人类、鸟类、啮齿类等生物的脂肪、血管等多种组织中，具有高度增殖、自我更新及组织再生和修复功能。
在体外成功分离培养血管MSC，并得到大量纯化的MSCs 是研究其分化机制、基因调控、以及在临床血管损伤修复应用等方面的前提。
目前，对MSCs 的分离、纯化、培养还没有统一的方法。
MSCs的分离技术和方法主要有4种：贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。
应用流式细胞仪分离法或免疫磁珠法，虽可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。
使用percol1 分离液梯度离心的方法，能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快速，对细胞的活性影响较小，但要是所得血管中细胞的量不多，分离得到的单个核细胞数量较少, 接种至培养瓶内细胞密度偏小，不利于细胞的生长。
本实验采用差速贴壁培养法及利用密度梯度离心联合分离培养大鼠血管间质干细胞, 通过观察MSCs 在体外分离、培养、扩增的过程,最后通过流式细胞仪进行间质干细胞的鉴定, 为下一步实验应用提供依据，也进一步增加了间质干细胞的来源。
目前认为，间充质干细胞的分离与培养必须在形态学上和功能学上均满足要求。
获得优良的种子细胞对于构建良好的组织工程人工组织具有非常重要的意义。
本研究对传统的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，使所获细胞纯度更高，在体外多次传代能保持良好的增殖和分化能力，生物学活性优良。
流式细胞仪检测均一表达CD13 、CD29 、CD44等。
其次，种子细胞的分化能力对组织工程构建人工组织的效果亦具有决定性的意义。
本研究旨在体外分离培养血管MSCs ，并将其经定向分化诱导为成骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞，并与骨髓MSC定向分化为血管内皮细胞进行比较，以观察血管来源MSC在血管内皮细胞分化及血管损伤修复中的优势，为临床血管病变性疾病的干细胞治疗提供更为合适的细胞来源。
2，实验过程及结果
2.1 MSCs 的取材及原代培养：
取生后5～6 周的雄性健康大鼠, 颈部脱臼处死, 用75% 酒精浸泡1 min,分离出血管, 在装有PBS 液的培养皿内将血管清洗干净, 进行组织破坏后获得培养液的液体移入10 mL 的离心管中, 反复吹打后离心500 r /min, 5 min。
弃上清, 加入10% FBS 的L-DMEM培养液吹打混匀,离心800 r /min, 5 min。
弃上清, 再加入培养液重悬细胞, 调整细胞密度为5×105 个/mL 接种于25 cm2 培养瓶中, 置于37℃, 5% CO2, 95%饱和湿度培养箱中培养。
接种24 h 后全量换液, 去掉悬浮的细胞及其碎片和杂质, 以后隔天换液一次。
每天在倒置相差显微镜下观察、记录。
2.2 MSCs 的传代培养：
待原代细胞生长接近铺满瓶底约80%时, 去除培养液, PBS缓冲液轻洗3 次,加入0.25%胰蛋白酶以及0.02% EDTA, 37℃条件下消化3 min, 倒置相差显微镜下观察, 当细胞回缩、变圆、间隙增大时, 立即加入含10%FBS 的培养液终止消化。
用吸管轻轻吹打培养瓶底壁，制作单细胞悬液, 离心1 000 r /min, 5 min。
弃上清, 加入培养液, 按1∶2 比例接种到新的培养瓶, 置于37℃, 5%CO2, 95%饱和湿度培养箱中继续培养, 进行传代培养。
每2～3 d 换液1 次, 直至贴壁细胞成片, 接近铺满瓶底约80%时, 重复以上操作, 再次传代。
2.3 培养结果
培养24 h, 细胞已开始贴壁, 胞体呈圆形或多边形。
培养3 d, 贴壁细胞胞体明显增大并开始分裂增殖, 此时细胞形态渐变为梭形或纺锤形, 呈成纤维细胞样生长, 形成大小不一的集落。
通过更换培养液, 不贴壁的造血细胞等被去除; 残存的内皮细胞也应无法生长而死亡或者用
流式细胞仪进行二者的分离。
贴壁的MSCs 逐渐呈脊梁状、鱼群状、漩涡状、网状或辐射状排列, 细胞分裂增殖十分明显, 胞浆丰富, 核大,呈椭圆形(左图) 。
在9～10 d 左右, 培养的细胞长满培养瓶底的80%～90%并融合。
传代培养的MSCs 在形态学上更加趋于一致, 为排列更加有序的成纤维细胞样细胞, 生长旺盛,胞核明显。
培养6d 左右即可长满培养瓶底。
2.4.MSCs的鉴定
细胞传至第4代后,用消化液消化细胞, PBS洗涤2次(1 000 r /min) ,流式细胞术检测CD13、CD29的表达情况。
经流式细胞仪检测,MSCs 均一地表达CD13 、CD29 , CD44等; 而CD34 、CD45 和HLA-DR 阴性，经成骨细胞及成脂肪细胞定向分化鉴定其多向分化潜能。
2.5 实验流程如下图：
2.6 实验结果
本实验成功建立血管MSCs 的体外培养分离方法，获得血管MSC并对其进行表面标志及多向分化潜能鉴定，将为临床血管性疾病的损伤修复提供新的干细胞来源，开展人体自身的血管间充质干细胞的临床应用奠定实验基础。
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