营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合
实验三营养缺陷型的筛选
实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。
二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
三、实验材料1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。
2. 培养基(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。
(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。
配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。
(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。
(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。
3. 溶液(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。
(2) 水溶性维生素混合液。
(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。
4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。
四、实验内容1. 菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定
营养缺陷型菌株的挑选和鉴定mutugenesis and isolation of auxotroph细菌革兰氏染色法gram stain酵母菌的形态构造观察yeast morphology培养基的配制和灭菌types of mddia and sterlization菌种保藏preservation of cultures细胞计数法conting of cell凝集反响agglutination reactions相差显微镜phase contrast microscope细胞交融cell fusion质粒DNA的提取isolation of plasmid DNA植物DNA的提取isolation of plant DNA多肽的末端分析analysis of terminal of polypeptidePCR扩增DNAPCR amplify DNA fragmentSDS-聚丙烯凝胶电泳SDS-polyacrylamide gel electrophoresis蛋白质的性质properties of protein植物组织培养plant tissue cultureBL-410生物机能实验系统简介the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备preparation methods for nerve-muscle specimen of frog人ABO血型的鉴定Identification of humankind ABO blood group蟾蜍心室肌的期前收缩与代偿性间歇compensatory pause and ventricular extrasystole of ventricular muscle for toad 果蝇的两对因子的自由组合pair factors for free combination of Drosophila植物姊妹染色单体及染色体的区分sister chromatid of plant and differentiate of chromosomeβ-半乳糖苷酶基因〔lac-Z〕的定点突变site-directed mutagenesis of β-galactosidase gene〔lac-Z〕β-半乳糖苷酶的固定化及应用application and immobilization of β-galactosidase大肠杆菌感受态细胞的制备及转化the preparation and transformation of competent cells from Escherichia coli质粒DNA的提取及酶切extraction of plasmid DNA and its detection植物基因组DAN的提取extraction of plant genome DNA小鼠巨噬细胞吞噬实验的观察experimental observation of macrophage cell分小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能phagocytosis of mice peritoneal macrophage cell动物骨髓细胞染色体标本的制备preparation method of chromosomes for animal marrow cells细菌的形态观察bacteria morphology植物叶绿体色素含量的测定determination of chloroplast pigment in plant根的形态构造morphology of root茎的形态构造morphology of stem植物的各种组织tissus of plants氨基酸的别离鉴定-纸层析法the isolation and identification of amino acid- paper chromatography蛋白质的颜色反响coloration reaction of proteins白菜的组织培养tissue culture of cabbageHigh School Biology Experiment IdeasBy Jennifer Eblin, eHow Contributorupdated: April 28, 20211.One idea involves testing the effects of different substances on plants.High school level biology covers all aspects of biology, including animals, plant life and humans. That should mean it's easy to come up with ascience fair project or a classroom research project, but the amount oftopics sometimes makes it even harder. When you first start researching, you'll find thousands of ideas and it's difficult to decide which one is best for your situation. Provided that you know what you want to do and what your teacher or judges are looking for, it's easy to come up with a greatbiology experiment.Effects on Plants2. Test the effects of different substances on plants. Place plants from thesame source in pots of the same size, then use different types of materials.You can test different types of potting soil against regular dirt or use the same type of potting soil and test other substances. Water the plants with different types of bottled water and tap water from your home and other homes or add a small amount of vinegar and other liquids to see how the plants react to those substances. Observe the effects of the differentsubstances on the plants and measure how quickly each plant grows in comparison to the others.Water Bottles3. Test the amount of germs and toxins found when you refill a water bottle.Start by taking a sample swab from the outside lip of the bottle and looking at the water under a microscope for any bacteria or impurities. Then drink from the bottle as you otherwise would and test the bottle each time you refill it with extra water. Student athletes can even use the same plasticwater bottles they carry with them to practice every day. Each time, you'll want to swab the inside lip of the bottle and look at the swab under amicroscope. Identify any bacteria or toxins by looking at the examplesfound in your textbook.Public Germs4. You might be surprised when you check different public areas for germs.Take swabs at public bathrooms, in your classroom, on the door handles at stores and even books at the public library. Look at the swabs under a microscope and see what types of germs you find. Then offer acomparison of the germs and explain your findings. Discuss which germs are harmful and what levels of germs you found.Hair5. Do a biology experiment focusing on how the hair reacts to differenttypes of products. Test shampoos, conditioners, hair gels, hair sprays and other products. Look for residue left behind by the product, but take a few sample hairs before you begin. Check the consistency and health of the sample hairs under a microscope and compare those results against hairs after using the products. Observe any changes you notice in the look or feel of your hair, as well. Then look for signs that the hair has becomemore damaged or healthier since you used the product. You'll need tonarrow it down to just a few products, but if you have more time, use one product for several days before switching to anotherRead more: High School Biology Experiment Ideas | eHow。
第四节营养缺陷型菌株的筛选
（4）将CM和MM在恒温箱中培养。 （5）二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM
平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长 而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷 型。
此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应 有一定间隔。
CM
MM
２、点种法
用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和 CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后 一起培养，观察其生长情况。
影响突变率的因素
①诱变前预培养和诱变后培养
②温度、pH、氧气等外界条件
对诱变效应的影响
③平皿密度效应
第三节营养缺陷型菌株的 缺
途很大。
陷 目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是
型 各种类型的缺陷型。
的 用 途
研究代谢途径，育种技术都必须有营 养缺陷型的菌株为材料。
在基本培养基中加入相应的营养成分； [A][B]
二、筛选营养缺陷型的步骤
诱变 淘汰野生型 检出缺陷型 确定生长谱
（一）诱变方法
用于诱发营养缺陷型的诱变剂有： 亚硝基胍 紫外线 亚硝酸
（二）淘汰野生型
1、抗生素法：加青霉素
MM
原理：
CM
CM MM MM CM
一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。
一、基本概念
二、筛选营养缺陷型的步骤
（一）诱变 （二）淘汰野生型 （三）检出缺陷型 （四）确定生长谱
一、基本概念：
1、野生型菌株（wild type strain） 2、营养缺陷型（auxotroph）：
指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质 如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其 基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生 长的变异株。 3、原养型（prototroph）：
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要[目的]通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。
[方法]以大肠杆菌E.coli K12SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。
[结果]经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。
其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。
通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。
在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的DNA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。
一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。
本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。
此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。
在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。
当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。
如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
第五章微生物的遗传变异与菌种选育复习题知识讲解
第五章微⽣物的遗传变异与菌种选育复习题知识讲解第五章微⽣物的遗传变异与菌种选育复习题⼀、名词解释1.遗传型（genotype）遗传型⼜称基因型，是指某⼀⽣物个体所含有的全部遗传因⼦（基因组）所携带的遗传信息。
它是⼀种内在的可能性或潜⼒，只有在适当的环境条件下，通过⾃⾝的代谢和发育，才可将遗传型转化成现实的表型。
2.表型（phenotype）表型是某⼀⽣物体所具有的⼀切外表特征和内在特性的总和。
它是遗传型在⼀定环境下通过⽣长和发育后得体现，故是⼀种现实性（具体性状）。
3.变异（variation）变异是⽣物体在某外因或内因的作⽤下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变，其特点是群体中，以极低的概率出现（约10-9-10-5），性状变化幅度⼤，且变化后的新性状是稳定的、可遗传的。
4.饰变（modification）饰变是⼀种不涉及遗传物质结构或数量变化，只发⽣在转录、转译⽔平上的表型变化。
其特点是整个群体中⼏乎每⼀个体都发⽣同样的变化；性状变化的幅度⼩；饰变后的性状是不遗传的。
5.基因（gene）基因是⽣物体内的最⼩遗传功能单位，其本质是⼀段核苷酸序列，它能编码多肽链（通过mRNA）、tRNA或Rrna.6.操纵⼦（operon）操纵⼦是原核⽣物特有的基因形式，由三种功能上密切相关的基因组成，包括结构基因、操纵基因和启动基因。
7.结构基因（structure gene）结构基因是决定某⼀多肽链⼀级结构的DNA模板，它通过转录和转译机制可指导多肽链的合成8.遗传密码（genetic code）DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸序列称为遗传密码，其信息单位是密码⼦（核苷酸三联体）9.质粒（plasmid）直⽴式⼀类游离于核基因组外，具有独⽴复制能⼒的⼩型共价闭合环状dsDNA分⼦（cccDNA）。
10．F质粒（F plasmid）F质粒⼜称F因⼦或致育因⼦。
是⼤肠杆菌等细菌决定其性别并有转移能⼒的质粒。
【资料】营养缺陷型突变体的筛选及其应用汇编
２淘汰野生菌的方法
• ２．２菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其 原理是在基本培养基中，野生型的孢子能 发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此 将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养 一段时间后，再进行过滤。
• 如此重复数次后，就可以除去大部分野生 型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的 目的。
３营养缺陷型的检出方法
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法
• 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。
三种培养基的定义
• 在基本培养基中只是有针对性的加入某一 种或某几种自身不能合成的有机营养成分， 以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养 基，称为补充培养基(SM)。
营养缺陷型菌株筛选的一般方法
（1）诱变剂处理 • （2）淘汰野生型菌株 • ① 抗生素法 • ② 菌丝过滤法 • （3）检出营养缺陷型 • （4）鉴定营养缺陷型
２）夹层培养法
• 夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
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营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合营养缺陷型的筛选、鉴定与原生质体融合摘要:本实验主要是筛选鉴定芽胞杆菌营养缺陷型菌株，制备原生质体并检出融合子。
以现有的枯草芽胞杆菌为材料，进行紫外诱变，并逐级筛选出某种氨基最后进行不同缺陷型菌株的原生质融合并检出融合子。
实验酸营养缺陷型菌株。
得到色氨酸营养缺陷型，原生质再生率93.3%，亲本再生率83.9%，融合率为0.74%。
故本实验所采用的一系列方法都比较适宜。
关键词:芽胞杆菌紫外诱变原生质融合枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群，是工业、农业和医药工业等领域广泛应用的一种细菌。
枯草芽胞杆菌在生长过程中产生的抗菌蛋白对动植物病原菌均有很强的抑制作用,且能提高动植物免疫抗病能力。
蛋白酶作为枯草芽胞杆菌产生的另一种有重要价值的产物,在纺织、食品、饲料、洗涤剂及皮革工业中早已发挥着重要的作用。
蛋白酶作为饲用酶制剂的重要成分,有利于提高饵料蛋白质在仔猪消化道的消化率,具有促进生长、改善健康状况等作用。
蛋白质是仔鱼、仔虾生长的主要成分之一,饵料蛋白质的质量分数高达35%-55%,但消化率却较低。
因此,蛋白酶也是鱼、虾饲料中必须添加的消化酶。
1. 实验材料1.1菌株上学期筛选出来的产蛋白酶的枯草芽孢杆菌1.2 培养基完全培养基(CM，液体)、完全培养基(CM，固体)、基本培养基(MM)、补充基本培养基(SM)、再生补充基本培养基(SMR)1.3试剂缓冲液、原生质体稳定液(SMM)、促融合剂(40,聚乙二醇(PEG-4000)的SMM液) 溶菌酶液等1.4主要仪器显微镜、台式离心机及各种微生物实验常用仪器2.实验方法2.1菌悬液制备2.1.1细胞悬浮液的制备取保藏的斜面菌种，接种到液体试管中在转接入三角瓶。
取适量培养液，离心，收集菌体，洗涤沉淀，之后将菌体充分悬浮于10mL生理盐水中 2.1.2活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度采用十倍稀释法测定细胞菌悬液的浓度。
初始菌体浓度(个/mL) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数 2.2诱变处理在离心管中用pH 6.0的磷酸缓冲液悬浮菌体使其终浓度为108-109/mL。
加入新配置的NTG，使NTG的终浓度为0.1mg/mL，分别将诱变处理10、20、30min。
用硫代硫酸钠终止诱变反应。
将诱变后的菌悬液涂布到培养基上培养，观察诱变结果，得到最适的诱变条件。
2.3中间培养取最适诱变条件处理过的菌体，洗涤，取菌悬液1mL加入装有20mL完全培养基的250mL锥形瓶中，30?震荡培养2-3小时。
2.4营养缺陷型的检出鉴定2.4.1营养缺陷型初步检出-5-4-5 取最适诱变条件诱变过的菌悬液用十倍稀释法稀释至10，取10和10两个浓度涂布培养。
在培养基上生长的大菌落为野生型，小菌落为缺陷型。
用灭菌牙签在培养基平板上逐个挑取小菌落，对应点接种在基本培养基平板和完全培养基平板上。
先点接基本培养基平板,后点接种完全培养基平板,对点接的菌株进行标记。
接种量应少.30?培养48h,在完全培养基上平板上生长，而在基本培养基平板的对应位置不长的菌落，可能是营养缺陷型菌株。
2.4.2氨基酸营养缺陷型的检出将可能是营养缺陷型的菌株接种于含2g/mL蛋白胨的基本培养基中并相应做上标记，培养，能长出菌落的即为氨基酸的营养缺陷型。
2.4.3确定氨基酸营养缺陷型的种类取20 种氨基酸组合成9 组氨基酸混合液，如下所示: 组别第一组第二组第三组第四组第五组第六组丙氨酸精氨酸天冬酰胺天冬氨酸半胱氨酸第七组谷氨酸谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氨酸第八组亮氨酸赖氨酸蛋氨酸苯丙氨酸脯氨酸第九组丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸将筛选出来的氨基酸营养缺陷型制备菌悬液，分别涂布在9个氨基酸组合平板上，在适宜条件下培养。
观察结果即可确定为何种氨基酸营养缺陷型。
2.5原生质体的融合2.5.1缺陷型菌株的培养取两种不同的营养缺陷型菌株接种到液体培养基中，36?振荡培养14 h。
转接三角瓶，36?振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期。
2.5.2菌悬液的制备各取菌液2-3 mL，4000 r/min离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。
如此洗涤两次，将菌体悬浮10mLSMM中(记作A菌液)，每mL约含108,109活菌为宜。
2.5.3总菌数测定-5-6采用十倍稀释法，用生理盐水稀释，取10、10各0.1mL(每稀释度作两个平板)倾注完全培养基，36?培养24 h 后计数。
2.5.4脱壁取亲本菌株菌悬液4.5 mL，加入0.5mL 溶菌酶溶液，混匀后于37?水浴保温处理，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，4000 r/min离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除去溶菌酶，然后将原生质体悬浮于4.5mL 高渗缓冲液中(记作B菌液)。
立即进行剩余菌数的测定。
2.5.5剩余菌数测定-4-5取1mLB菌液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10、10 稀释液各0.1mL涂布于完全培养基平板上，36?培养24,48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。
计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。
原生质体形成率,未经酶处理的总菌数-酶处理后剩余细胞数 2.5.6亲本再生-5-6取0.5mLB菌液于4.5mLSMM的试管中，取10、10 稀释液各0.1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基，36?培养48 h。
分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。
2.5.7原生质体融合取两个亲本的原生质体悬液各1mL混合，静置5 min 后，离心，弃上清液。
再加入1.8mL4000PEG 溶液，轻轻摇匀，置36?水浴保加0.2mLSMM溶液悬浮，-2温处理2 min，离心。
用SMM洗涤菌体并悬浮。
稀释，将10的菌液用双层培养法培养。
观察结果。
2.5.8检出融合子取0.5mL融合液，用SMM 液作适当稀释，取0.1mL菌液于灭菌并冷却至50?的再生补充基本培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上，36?培养2 d，捡出融合子，转接传代，并进行计数，计算融合率。
3.实验结果3.1诱变处理实验中对诱变时间进行了优化选择，实验结果表明，诱变时间为20分钟时致死率在80%左右，可产生尽可能多的诱变体。
因此可得诱变20min是最佳的诱变剂量。
3.2营养缺陷型的检出鉴定3.2.1营养缺陷型初步检出通过基本培养基和完全培养基的对应点接，挑选出29株在只在完全培养基上生长的菌株。
这29株菌株即为营养缺陷型。
3.2.2氨基酸营养缺陷型的检出将29株菌对应点接在加有蛋白胨的培养基中培养，可观察到所有菌株都可正常生长，说明29株菌都是氨基酸营养缺陷型。
3.2.3确定氨基酸营养缺陷型的种类将29株氨基酸营养缺陷型菌株分别点接在加有9组氨基酸组合的培养基中，培养。
观察到19号菌只在第3和9组氨基酸的平板上生长，鉴定为色氨酸缺陷型菌株;24号菌只在3和6组氨基酸的平板上生长鉴定为天冬酰胺缺陷型菌株。
3.3原生质体的融合3.3.1总菌数测定表1脱壁前总菌数的测定-5-6平板号 10 10平板1 314 58平板2 274 62平均数 294 608可得脱壁前的总菌数为6*10个/mL。
-5-6和10时的结果如图所示。
图一脱壁前总菌数测定中，菌液稀释10 3.3.2剩余菌数测定表二脱壁后剩余菌数测定-4-5平板号 10 10平板1 303 58平板2 281 62平均数 292 468可得剩余菌数为0.4*10个/mL。
综上数据可得原生质形成率= 总菌数-剩余菌数/总菌数*100%=93.3%-5图二脱壁后剩余菌数测定中，菌液稀释度为10时的结果如图所示。
3.3.3亲本再生8亲本再生数为4.7*10个/mL。
所以再生率=亲本再生数/原生质总数=83.9%3.3.4捡出融合子将筛选出的色氨酸和天冬酰胺营养缺陷型进行融合，在合适的条件下培养。
6最后得到的融合子数为3.5*10个/mL。
融合率=0.74%4.讨论本实验从整体上看比较成功，各个环节都得到了预期的结果。
而且所得到的原生质形成率和亲本再生率都较高。
理论结合实际使我们对营养缺陷型的筛选、鉴定和原生质的融合这一系列的知识有了更加系统得了解。
但是实验中也存在着一些不足。
如很多步骤理论上都应该做条件的优化，但由于实验条件和时间的限制，都是用的老师的经验值。
如:在诱变处理时，NTG的终浓度为0.1mg/ml，只对时间进行了平行实验。
但结果都比较好，能过算出菌落的个数。
如果提高试验操作水平，改善实验条件有待得到更加完美的实验结果。
5.结论本实验以芽胞杆菌为出发菌株，通过紫外线诱变和一系列的筛选鉴定，得到了色氨酸和天冬酰胺营养缺陷型。
又经过原生质的融合，最后挑选出融合子。
实验数据与理论值基本吻合。
因此，本实验方法是芽胞杆菌营养缺陷型筛选鉴定和原生质融合的较好的途径。