琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
pcr扩增琼脂糖凝胶电泳操作流程
pcr扩增琼脂糖凝胶电泳操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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分子医学技能-生化：实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
• 本实验的预期目标：通过观察电泳条带的 差异，检测来自不同样本的apoB基因的多 态性.
apoB基因PCR产物鉴定
700 bp 600 bp
乙肝基因PCR产物鉴定
阳性 - + + -
对照
400 bp 300 bp
（2）个体疾病的预防：易感基因 （3）个体化用药的指导：药物代谢酶等 （4）个体身份的验证：识别个体、亲子
鉴定等
Apo B
• 载脂蛋白B基因位于2号染色体断臂末端，全长 43Kb；
• DNA 3’端181bp构成一种由11-16bp重复排列的超 变异小卫星序列，分布在500-800bp之间；
• ApoB是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要 结构蛋白 ,血液中ApoB的测定值可直接反映LDL的 含量 .
实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
实验内容
• 1、乙肝病毒基因PCR、apoB基因PCR（已完 成）；
• 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；
• 3、鉴定乙肝病毒基因PCR产物的DNA凝胶电 泳：1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，30min；
一、DNA琼脂糖凝胶电泳
• 导致血浆胆固醇升高的基因突变 ：
– ApoB基因遗传变异可合成有缺损的ApoB蛋白质， 后者与LDL受体亲和力下降，引起LDL清除障碍， LDL在血浆中蓄积。
– apoB DNA多态性或遗传变异与高胆固醇血症、 动脉粥样硬化、心肌梗赛、冠心病以及肥胖之 间密切相关；
• 导致血浆胆固醇水平降低的基因突变 :
单条带，700bp左右）
，315bp）
1. 电泳前准备
准备内容
琼脂糖凝胶电泳的理论技术和应用
琼脂糖凝胶电泳的理论技术和应用1 引言琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离，这种技术时基因操作中常用的一种方法。
下面简单介绍琼脂糖凝胶电泳的理论技术及其应用。
2 琼脂糖凝胶电泳技术及其原理(1)电泳主要是指混悬于溶液中的样品电荷颗粒，在电场影响下向着与自身相反电荷的电极移动的现象，电泳技术是一种非常先进的检测手段，电泳技术与其它先进的技术相配合能够创造出非常之高的成果，这种技术能够使人们以最小的代价获得最大的利益。
电泳技术现在主要用于纯化以及分离DNA片段的一种最常用的技术。
原理：电泳是现在用于纯化以及分离DNA片段的最常用的技术，如果装备一块“胶”包含电解质的多孔支持介质，并把这些介质放置在静电场中，DNA分子将会随着向阳极移动，这主要是因为DNA分子沿着双螺旋骨架两侧带有含有电荷的磷酸根残基，当DNA的长度增加后，来自电场的驱动力以及凝胶的阻力之间的比率就会降低，并且不同长度的DNA片段就会出现不同的迁移率，所以就可以根据DNA分子大小使其分离。
这个过程可能是通过把分子量标准参照物或者是示踪燃料以及样品一起进行电泳检测分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
(2)琼脂糖凝胶电泳主要是采用琼脂糖作为支持介质的电泳方法，琼脂糖凝胶电泳技术的分析原理与其他支持物电泳的最主要的区别是它具有“电泳”和“分子筛”双重作用。
琼脂糖凝胶是一种网络结构，物质分子通过时会受到阻力，其中较大的分子物质在涌动时受到的阻力比较大，所以在凝胶中，带电颗粒的分离不仅与静电荷的性质以及数量有关，而且与废纸的大小有很大的关系，这就可以大大的提高了粪便能力，但是由于其孔径相差比较大，对于大多数蛋白质来说其分子筛效应很小，目前琼脂糖凝胶技术主要用于核酸的研究中。
实验2-PCR与琼脂糖凝胶电泳-New
1）吸取18µl水稻总DNA+3µl loading buffer, 混匀
Mark DNA: 5µl λDNA-HindⅢ
2） PCR产物+3µl loading buffer，混匀
Mark DNA : 5µl 100bp DNA 5、电泳：打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm（约 100V），注意电极方向（可见到溴酚蓝条带 从负极向正极移动）；约30min后可观察 。
10× PCR buffer：
500mM KCl 200mM Tris-HCl（pH8.3）
0.01% 明胶 （ gelatin ）
15-20mM MgCl2
1×TBE缓冲液（1000ml）：电场中的导体 Tris 硼酸 EDTA 10.8 g 5.5 g 0.93 g
载样缓冲液（6×）：含指示剂溴芬蓝和二甲苯青，可在 可见光下指示样品的泳动过程 溴芬蓝 二甲苯青 甘油 0.25 % 0.25 % 30 %
0.2 µ l 引物R（10 µ M） :22179R
0.2 µ l Taq酶（5U/ µ l） 15.2 µ l ddH2O Total 18.0 µ l 模板DNA， 混匀，放入PCR仪中开始反应
最后加 2 µ l
PCR技术
PCR反应混合液（总体积20 µl）
成 份 ddH2O 1 15.2 n n × 15.2 10 152 25 380
72 ℃，延伸5 min PCR反应在带热盖的PCR仪上进行，大约
需要2小时。
电泳技术
3、制胶（浓度为2%）：
1）称取2.0g 琼脂糖，加入盛有200ml 1×TBE电泳缓冲 液的500ml蓝盖瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂 糖完全溶解，冷却到60 ℃，加入10µl Goldview并摇 匀。
pcr扩增实验报告
pcr扩增实验报告篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA 的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验)
t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义一、实验目的1、掌握PCR反应的原理和方法；2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。
二、实验原理PCR原理：首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。
使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。
每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA物增加一倍。
变性（denaturation）：双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。
退火（annealing）：引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。
延伸（extension）：在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端，DNA链的延伸方向为5’-3’。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。
不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下，DNA呈现橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1μg，溴乙锭检测 DNA，灵敏度很高，10mg 或更少的DNA即可检出。
三、实验仪器超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。
四、实验药品蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddHO、EB、EDTA、SDS、引物。
pcr扩增后产物流程和注意事项
pcr扩增后产物流程和注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!PCR扩增后产物的处理流程及注意事项PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于生物学、医学、法医学等领域，用于复制和放大特定DNA片段的技术。
实验三-琼脂糖凝胶电泳检测DNA
在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有 相同的电荷密度，其电泳行为线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目 的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。
鲁东大学 生命科学学院 School of Life Sciences
思考题
1.影响核酸在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率的因素有哪些？
2.电泳中加入Loading buffer的作用是什么？
鲁东大学 生命科学学院 School of Life Sciences
鲁东大学 生命科学学院 School of Life Sciences
8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～ 30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：接通电泳槽与电 泳仪的电源，调节电压100V 30min,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停 止电泳。
鲁东大学 生命科学学院 School of Life Sciences
注意事项
1. 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使 凝胶盘变形。 2. 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏 点样孔。 3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。 4.EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔，紫外线 照射不宜太久。
鲁东大学 生命科学学院 School of Life Sci Nhomakorabeances
3. 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分碱基对子中形成 荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检 测琼脂糖中的DNA。
pcr产物纯化回收跑胶试验结果分析
pcr产物纯化回收跑胶试验结果分析PCR产物的回收（玻璃奶吸附法）SYBR会使DNA部分显出绿色荧光，在紫外灯下辨认绿色荧光，可将胶切下。
实验结果及分析本次试验中，在最后一步检测中看到了荧光，说明了DNA的存在，证明回收到了PCR的产物PCR产物的直接纯化：一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。
目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。
本实验中， Buffer PCR-A促使大于100bp 的DNA片段选择性地吸附到 silica膜上。
经 Buffer W. BufferW2洗涤去除残留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到sica膜上的DNA片段经微量水或 Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。
二、材料与方法1、材料PCR产物2、仪器、用具恒温孵育器（65C)、离心机、移液器、1.5ml离心管3、试剂Buffer_PCR -A Buffer w1；已加无水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去离子水4、方法(1）在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A若需加入的BufferPCR-A不足100ul，则加入100ul。
(2）将DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中，将步骤（1）中的混合液移入DNA -prep Tube I中，5500rpm离心1min。
(3）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入500 ul Bufer W1,5500rpm离心1min。
(4）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入700山已加无水乙醇的 Buffer V2,5500rpm离心1min，以同样的方法再用700山己加无水乙醇的 Buffer\2洗涤一次。
PCR检测实验报告
pcr实验报告实验目的：了解pcr技术原理，掌握最基础的pcr实验步骤。
实验试剂：模板dna，mg2+，buffer，dntps，taq dna聚合酶，引物，h2o 。
实验原理：pcr全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或dna序列最常用的方法。
基本原理：首先将双链dna分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链dna分子，dna聚合酶以单链dna为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的dna互补链。
pcr反应时，只要在试管内加入模板dna、pcr引物、四种核苷酸及适当浓度的mg2+，dna聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。
（1）双链模板dna分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板dna 两端的特定序列相结合，产生双链区。
（2） dna聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。
（3）在后续反应中，无论是起始模板dna还是经复制的杂合dna双链，都会在高温下解开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板dna。
（4）由于在pcr反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的dna链上都有新的引物结合位点。
（5）整个pcr的反应全过程，即dna解链（变性）、引物与模板dna结合（退火）、dna 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。
经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链dna分子数，即两条引物结合位点之间的dna区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。
试剂作用：（1）引物：dna复制的起始点，针对复制dna片段的两端，有5’引物和3’引物（2） taq dna聚合酶：促进dntps与模板结合。
（3） buffer：tris-hcl反应缓冲液，taq dna聚合酶提供一个最适酶催反应条件。