Notch信号通路抑制剂对原代耐药白血病干细胞生长分化的影响_杜宏

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2015 年 2 月 第 4 卷 第 1 期 《转化医学杂志》
Translational Medicine Journal， Vol．4 No．1， Feb 2015
·基础研究·
Notch 信号通路抑制剂对原代耐药白血病 干细胞生长分化的影响
杜
［ 摘要］ 目的
宏， 吴南海， 栾
佐
分离再诱导
含 10%FBS 的 1640 培养液中培养 5 d 后， 计数细 4 × 胞， 取其中 1 10 细胞植于 H4434 培养基中， 于7 d 后计数集落数。 1. 7 细胞形态检测 药物处理 5 d 后细胞 PBS 洗 3 遍， 甩片后甲醇固定 10 min， 行瑞特姬姆萨染色， 显微镜下观察细胞形态变化。 1. 8 流式细胞术检 测细胞表 型 于药物处理 48 h 后收集培养细胞， 采用直接免疫荧光染色法， 加入藻 红蛋白或异硫氰酸荧光素或藻红蛋白偶联物标志的 CD38、 CD123、 CD14 及阴性对照鼠 IgG 鼠抗人 CD34、 FBS 洗涤 2 次后加入 1% 多聚甲醛 0. 5 mL 孵育 30 min， 上机， 采用 FACScabilur 型流式细胞术 CELLQuest 软 件检测分析。 1. 9 统计学处理 应用 SPSS 10. 0 软件， 计量资料 ± s ） 表示， 以均数 ±标准差 （ x 组间比较采用两样本 t 珋 P ＜0. 05 为差异有统计学意义。 检验， 2 2. 1 结果 DAPT 对细胞 增 殖 的 抑 制 作 用 MTT 测定结
Effects of Notch inhibitor γsecretase inhibitor on the growth differentiation of primary drugresistant leukemia stem cells DU Hong，WU Nanhai，LUAN Zuo （ Department of Pediatrics，Navy General Hospital， Beijing 100048， China） We do some research about effects of Notch inhibitor γsecretase inhibitor （ DAPT） on the growth differentiation of leukemia stem cells （ LSCs） ． Methods Mononuclear cells （ MNCs ） separated from bone marrow from 9 proinduction chemotherapy relapsed patients were cultrure in wells with DAPT． We evaluated the cells survival rate by cell proliferation inhibition experiment， tested colony forming ability and the selfrenewal capacity by stem cell colon cultivation ， and observed cells morphology． We evaluated the expression levels of CD34 ，CD38，CD123，CD14 by flow cytometric analysis． Ｒesults The result showed that DAPT inhibited the cells proliferation and selfrenewal capacity of LSCs and increased the express of differentiation marker such as CD14． There were more destroied cells by cultured with DAPT and less S phase cell by cultured with DAPT，more cells were division arrested in G1 / G0 phase． Conclusion maturation stage． ［ Key words］ Leukemia stem cells （ LSCs） ； Notch pathway； γsecretase inhibitor Notch 基因最初是由突变果蝇翅上凹陷的表型 Notch 信号通路作为一 所命名。 随着研究的深入， 个高度保守的信号传导通路， 在胚胎发育、 组织再生 及肿瘤产生等多方面功能逐渐被人们所认识。Notch 信号通路的调节异常成为一系列血液系统恶性肿瘤 发生的关键事件。在多种肿瘤中均发现一类因干细 胞功能异常而产生的一群具有自我更新能力的干细 胞样细胞， 即肿瘤干细胞， 在白血病中称白血病干细
我更新及分化 2 个方面基本特征。 同样 LSCs 同造 HSCs ） 一样也具 血干细胞 （ hematopoietic stem cells， 备干细胞的特征， 正是由于 LSCs 的自我更新特征使 其成为白血病难治及复发的根本原因。 因此， 本研 究中选取难治复发白血病样本中的单个核细胞为研
图4 加入 DAPT 处理 7 d 后细胞克隆形成情况 ×40） （ 未染色，
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Translational Medicine Journal， Vol．4 No．1， Feb 2015 1. 6 细胞自我更 新 能力 检 测
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DMSO ） 溶于二甲基亚砜 （ dimethylsulfoxide， 公司） ， Xiasi Bio 公司） ， 中（ 美国， 以 1 mmol / L 浓度分装储存 于 － 20℃ 避光保存。 淋巴细胞分离液 （ 中国医科院 Gibco 公司） 。 血研所科技公司） 。1640 培养液 （ 美国， 10%胎牛血清（ fetal bovine serum， FBS， 中国医科院血研 所科技公司） 。四甲基偶氮唑盐 （ methylthio tetrazole， MTT， Sigma 公司） 。H4434 培养基（ 加拿大， Stem 美国， Cell 公司） 。CD34、 CD38、 CD123、 CD14、 及阴性对照鼠 Ig） G（ 美国， BD 公司） 。 免疫球蛋白（ immunoglobulin， 1. 2 样本采集 样本选自中国医学科学院血液病研 究所韩明哲教授惠赠初治复发白血病骨髓样本 9 例， 患者临床特征见表 1。取骨髓 5 mL， 乙二胺四乙酸 （ ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA） 抗凝， 骨髓不 用肝素抗凝。采集后 1 h 内经淋巴细胞分离液分离单 MNCs） 。 个核细胞（ mononuclear cells，
表 1 患者临床特征
病例 1 2 3 4 5 6 7 8 9 疾病分型 自然杀伤细胞淋巴瘤白血病 急性杂合性白血病 M3 急性髓系白血病M4 急性髓系白血病急性淋巴细胞白血病 M1 急性髓系白血病M5 急性髓系白血病M1 急性髓系白血病M2 急性髓系白血病骨髓涂片原始细胞比例（ %） 73．0 81．5 93．2 77．5 93．5 88．5 87．5 87．0 69．5
1 μmol / L 浓度 DAPT 对白血病细胞的增殖 果表明， DAPT 处理组较对照组可抑制 有明显的抑制作用， 细胞存活率的 （ 82. 4 ± 15. 2 ） % ， 两者比较差异有统 计学意义（ P = 0. 02） 。 2. 2 DAPT 对 细胞形态 的作 用 瑞特姬姆萨染色 DAPT 作用后细胞形状不规则， 显示， 细胞膜出现芽 状或棘刺状突起， 且破坏细胞增多 （ 油镜放大 100 倍， 图 1） 。
LSCs） 。LSCs 的存在成为白 胞（ leukemia stem cells， 血病复发、 耐药及难治的一重要因素。 本研究选取 难治复发白血病样本中的单个核细胞为研究对象 ， 难治及复发的临床特征表明其单个核细胞群中存在 LSCs。本研究通过 Notch 信号通路抑制剂对难治复 发白血病中单个核细胞群中的白血病干细胞的自我 更新及分化的影响作一初步研究， 现报道如下。 1 1. 1 材料与方法 Sigma 实验材料 γ分泌酶抑制剂 DAPT（ 美国，
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图2
低倍镜下对照组克隆形成情况 ×10） （ 未染色， 图5 对照组流式细胞周期
图3
高倍镜下对照组克隆形成情况 ×40） （ 未染色， 图6 处理组流式细胞周期
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讨论 干细胞是体内最原始的一类细胞群， 其具备自
1. 3 细胞培养 分离出的 MNCs 接种于培养瓶， 培养 5% CO2 全 液为加入 10%FBS 的 1640 培养液， 于 37 ℃ 、 湿条件下培养。加药处理组 DAPT 以 1 μmol / L 浓度 处理细胞。 1. 4 细胞增殖抑 制 实 验 将经淋巴细胞分离液分 4 离的 MNCs 以 1 × 10 / mL 接种于 96 孔板， 每孔 100
图1 经 DAPT 处理后细胞形态变化 ×100） （ 瑞特姬姆萨染色，
数较加入 DAPT 处理组显著增加， 差异有统计学意义（ P = 0. 01， 图 2 ～ 4） 。
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［1 ］ μL。DAPT 以 1 μmol / L 浓度处理 ， 设 3 个复孔，
并设未加药孔作为对照组， 药物作用 5 d 后加 5% MTT 溶液， 每孔 20 μL， 置 CO 2 培养箱孵育 4 h， 离心 弃上清终止培养， 加入 DMSO 每孔 150 μL， 于 BioＲad 450 型酶 标 仪 570 nm 读 取 各 孔 吸 光 度 （ A 570 ） 值， 按细胞存活率 （ % ） = A 570 用药组 / A570 未用药组 × 100% 计算。 1. 5 干细胞集落 培 养 常规半固体培养法进行造 血祖细胞培养 7 d 计数集落数。 2. 3