仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物多样性研究

仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物多样性研究樊建辉;侯建光;郭福祥;陈蒙恩;杨方玉;陈文强【摘要】研究陶融型白酒大曲可培养微生物的多样性.采用组织培养方法分离陶融型白酒大曲的微生物,提取分离菌株DNA,用酵母通用引物NL1/NL4、细菌通用引物799F/1492R和真菌通用引物ITS1/ITS4对酵母26S rRNA、细菌16S rRNA、霉菌28S rRNA序列扩增,提交测序分析,构建系统发育树.仰韶陶融型白酒大曲酒曲中共分离到酵母213株、细菌386株、霉菌73株,酵母归分为72株形态种,细菌归分为77株形态种,霉菌归分为7株形态种,根据测序结果不同,陶融型白酒大曲微生物被分为21个分类单元.仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物具有多样性特征,为其发酵及开发利用提供理论参考.%The diversity of culturable microorganism in Pottery-flavor Baijiu (Chinese liquor) Daqu was studied.The Daqu microorganisms in Potteryflavor Baijiu were isolated by tissue culture method.When microbial DNA was extracted,yeast universal primersNL1/NL4 was used for 26S rRNA sequences amplification,bacteria universal primer 799F/1492R was used for 16S rRNA sequences amplification,mold universal primer ITS1/ITS4 was used for 28S rRNA sequences amplification,the sequences were analyzed and results were submitted,to construct phylogenetic tree.Results showed that there were 213 yeasts,386 bacteria and 73 mould strains isolated from Pottery-flavor BaijiuDaqu,including 72 yeasts species,77 bacteria species,and 7 moulds species.Based on sequencing results,the isolated strains were classified into 21 operational taxonomic units (OUTs).The culturable microorganismin Yangshao Pottery-flavor Baijiu Daqu had microbial diversity,which provided theoretical foundation for fermentation and utilization.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)007【总页数】5页(P71-75)【关键词】陶融型白酒;大曲;微生物多样性;系统发育树【作者】樊建辉;侯建光;郭福祥;陈蒙恩;杨方玉;陈文强【作者单位】河南仰韶酒业有限公司,河南渑池472400;河南仰韶酒业有限公司,河南渑池472400;河南仰韶酒业有限公司,河南渑池472400;河南仰韶酒业有限公司,河南渑池472400;河南仰韶酒业有限公司,河南渑池472400;陕西理工大学生物工程与科学学院,陕西汉中723001【正文语种】中文【中图分类】TS261大曲在我国白酒酿造中起着重要的作用，作为白酒的酿造动力源，首先为白酒酿造提供了大量的酶类以及香味生成基础物质[1]，同时也为白酒酿造提供了大量产香微生物，其中含有丰富的兼性可培养微生物，对白酒中脂类、醛类、醇类等有机物的形成有着直接作用[2-3]，并且大曲对白酒的风味形成也至关重要[4-6]。

目前有关大曲的研究已经取得很大成果，如YAO S等[7]从山东扳倒井高温大曲中分离到一株高温放线菌属新种H-18T；XIONG X M等[8]对白云边手工制作大曲和机器制作大曲研究发现，两者微生物的优势种属和Shannon指数基本相同，机器制作大曲完全可以代替手工制作大曲；SHI J H等[9]对汾酒大曲研究中发现，放线菌目和乳杆菌目只在大曲表皮部被分离到，芽孢杆菌目主要存在于大曲内部，真菌主要分布于大曲表皮部；黄晓宁等[10]对同一酒厂酱香型和浓香型两种大曲微生物研究发现，两者大曲在真菌种属差异性很大，细菌差异性较小。

仰韶陶融型白酒大曲是由小麦、豌豆以及大麦为原料，经过大曲成型、曲房培养、大曲后熟三个阶段而成。

仰韶陶融型白酒大曲在整个形成过程中属于开放式接种培养，增加了仰韶陶融型白酒大曲微生物的多样性。

陶融型白酒是我国第十三种香型白酒[11]，以浓香型、酱香型、清香型、芝麻香型于一体的创新型香型白酒，其酒体香气优雅、细腻，口感醇厚丰满、余味净爽的特点而被广大消费者喜爱[12]。

目前有关陶融型白酒大曲微生物多样性研究，国内鲜有报道。

本次研究以陶融白酒发酵使用的大曲为材料，研究陶融白酒大曲中微生物的多样性和菌落分布，以便为陶融型白酒的发酵提供理论参考。

1.1 材料与试剂1.1.1 样品仰韶陶融型白酒大曲由河南仰韶酒业有限公司提供，将样品放入无菌保藏管中，置于4℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉：北京奥博星生物技术有限公司；2×TapPCR Master Mix、BioSpin试剂盒：西安热摩尔公司；T-19载体、DH5α感受态细胞：TAKARA公司；酵母DNA基因组快速提取试剂盒、溴酚蓝、DL2000DNAMarker、Tris平衡酚、接触酶、氧化酶、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、淀粉、明胶、H2S、吲哚、丙二酸盐、孟加拉红培养基、纳他霉素、氨苄青霉素、引物等：上海生物工程有限公司。

1.1.3 培养基（1）细菌分离培养基：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨5 g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，纳他霉素1g/L，琼脂粉12g/L，pH7.0。

（2）酵母分离培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，豆芽200 g/L，氨苄青霉素1 g/L，琼脂粉12 g/L，pH 6.0。

（3）霉菌分离培养基：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨0.5g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O3g/L，VB10.1g/L，琼脂粉12 g/L，氨苄青霉素1 g/L，pH自然。

1.2 仪器与设备GT9611PCR仪：杭州晶格科学仪器有限公司；SF-CJ-2净化工作台：上海三发科学仪器有限公司；WD-9403A型紫外分光光度仪：北京六一生物科技有限公司：HYG-B全温摇瓶柜：苏州培英实验设备有限公司；1-14SIGMA高速台式离心机：美国SIGMA公司；LPZM-80KCS-Ⅱ立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；eppendorf移液器：德国Eppendorf公司。

1.3 方法1.3.1 菌株的分离和纯化称取仰韶陶融适量大曲，将其彻底粉碎，溶于无菌水中，分别置于28℃和37℃恒温摇床中预培养2 h。

采用梯度稀释法，将预培养样品分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，将大曲按照梯度稀释，经过预培养，吸取10-5梯度样品1 mL涂布于霉菌分离培养基，吸取10-7梯度样品1 mL涂布于酵母和细菌分离培养基，放入恒温培养箱中培养。

细菌分离培养基置于37℃恒温培3 d，酵母和霉菌分离培养基置于28℃恒温培5～7 d，挑取平板上形态特征不同的单菌落，通过划线纯化，并接种于斜面（4℃）保藏和甘油冷冻（-80℃）保藏。

1.3.2 仰韶陶融大曲微生物形态学鉴定根据分离真菌菌落形态特征，采用插片法对菌株菌丝，孢子及产孢结构，进行显微形态结构观察，进行分类鉴定。

将分离到的细菌依照菌落形态特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》，对待鉴定细菌进行生理生化指标检测。

1.3.3 DNA的提取和PCR扩增测序使用酵母DNA基因组快速提取试剂盒提取酵母基因组DNA，改良冻融法[13]提取细菌基因组DNA，十六烷基三甲基澳化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[14]提取霉菌DNA。

用酵母通用引物NL1/NL4[15]扩增26S rRNA基因片段，细菌通用引物799F/1492R[16]扩增16S rRNA基因片段，霉菌通用引物ITS1/ITS4[13]扩增ITS基因片段。

细菌聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）反应体系和扩增程序参照参考文献[15]，酵母PCR反应体系和扩增程序参照参考文献[16]，霉菌PCR反应体系和扩增程序参照参考文献[17]。

将PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收纯化PCR 产物，连接T-19载体，并转化到DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆子送上海杰李生物公司测序。

1.3.4 分离菌株的系统发育分析将所得序列提交GenBank数据库中进行BLAST检索，整理修剪所测序列，提交NCBI，并索取序列登录号。

下载同源性较高的数据，生成Fasta格式文件。

用Clusta-X[18]软件对序列进行比对及人工校正，利用Mega5.1[19]软件构建邻接法（neighbor-joining，NJ）系统发育树[20]，Bootstrap值设置为1000。

2.1 大曲微生物的分离和纯化将分离到的菌株菌落，通过多次划线纯化挑取，并接种于平板培养基中。

从仰韶陶融大曲中总共分离到672株菌，其中真菌286株菌，细菌386株菌。

经过菌落形态特征排重，结果表明，共分离到156株菌形态种，包括细菌77株、酵母菌72株、霉菌7株。

2.2 仰韶陶融大曲微生物的鉴定2.2.1 大曲微生物形态学观察（1）真菌将分离纯化到的菌株接种到孟加拉红平板培养基上，观察部分菌株的形态特征（见图1），依据真菌分类鉴定手册[21]，初步确定分离真菌菌株分类地位，结果见表1。

由表1可知，接合菌亚门分离到2株菌，毛霉属（Mucor）和根霉属（Rhizopus）各1株，担子菌亚门分离到1株，只有锁掷酵母属（Sporobolomyces）1株菌，子囊菌亚门分离到76株菌，其青霉属（Penicillium）、翘孢霉属（Emericella）、有孢圆酵母属（Torulaspora）及季也蒙酵母属（Meyerozyma）各分离到1株，伊萨酵母属（Issatchenkia）和假丝酵母属（Candida）2株，曲霉属（Aspergillus）分离到3株，地丝菌属（Geotrichum）4株，覆膜孢酵母属（Saccharomycopsis）6株，酵母属（Saccharomyces）8株，毕赤酵母属（Pichia）18株，异常维克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）29株。