激光共聚焦显微镜使用流程-分析测试中心
激光共聚焦显微镜使用流程
1.导师网络注册并等待审核（导师注册过的跳过此步骤）
2.学生注册，注册时选定自己的导师
3.带本人校园卡及导师签名的注册申请表到先知楼603室
审核并激活校园卡
4.转账、系统充值
5.参加激光共聚焦显微镜使用培训，取得上机操作资格。
6.网络预约时间使用，并等待审核。
7.按时上机使用，使用刷卡开机。
8.结束使用，按操作规程关机，并刷卡。
注：
1.每一期共聚焦显微镜培训分两次，每次约
2.5小时，每两周进行一期。
具体时间看网站通知。
2.共聚焦显微镜开放时间9:30-19:00
3.本人预约，仅限本人使用，不得用他人校园卡上机。
4.预约成功后，可以用校园卡刷卡进先知楼603西门。
5.刷卡开机使用，使用完成关机后务必再次刷卡结束使用，以免造成多
计费。
分析测试中心
2013-04-22
德国Zeiss 激光共聚焦显微镜 快速操作手册
德国Zeiss 激光共聚焦显微镜快速操作手册德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作: 光学仪器(上海)制作:Zeiss 光学仪器(上海)国际贸易有限公司孙凯 2009 年 6 月目录:目录:1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序软件的快速使用说明2.2 软件的快速使用说明快速使用显微镜的2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。系统组成及光路示意图:系统组成及光路示意图: 组成及光路示意图电动荧光显微镜扫描检测单元激光器电脑工作站实物照片说明:实物照片说明: 电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序 )打开稳压电源(绿色按钮)(1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待 2 分钟(电压稳定)后，再开其它开关) “ ”(2)主开关 MAIN SWITC H “ON” “ ”电脑系统SYSTEMS/PC “ON” “ ”扫描硬件系统COMPONENTS “ON” )(3)打开电动显微镜开关打开荧光灯开关 (注:具有 5 档光强调节旋钮) ) 离子激光器主开关”(4)Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约分钟，预热等待约 15 分钟，”将激光器扳钮由“Standby”扳至”状态，“Laser run”状态，即可正常使用 ) ，(5)打开电脑开关，进入操作系统注:键盘上也具有电脑开关 2.2 软件的快速使用说明(1)电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件 ZEN 图标(2)进入 ZEN 界面，弹出对话框: ”——“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已”存图像数据的处理、分析。(3)软件界面: 功能界面切换:扫描取图( ) 图像处理( 、图像处
激光共聚焦扫描显微镜简介
激光共聚焦扫描显微镜简介 一、激光共聚焦显微镜的基本组成 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。 激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。 1.1 显微镜光学系统 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。 1.2 扫描装置 LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达5帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。 1.3 激光光源 LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光。 1.4 检测系统 LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。 二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用 与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性： 1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。 2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。 3、多维图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 操作手册
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册 目录: 1 系统得组成 系统组成及光路示意图 实物照片说明 2 系统得使用 2、1 开机顺序 2、2 软件得快速使用说明 2、3 显微镜得触摸屏控制 2、4 关机顺序 3 系统得维护 1 系统得组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。 系统组成及光路示意图: 电脑工作站 激光器 电动荧光显微镜扫描检测单元 实物照片说明: 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO2 培养系统控制器 激光器 电脑工作站 2 系统得使用 2、1 开机顺序 (1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待2 分钟(电压稳定)后,再开其它开关 (2)主开关[ MAIN SWITCH ]“ON” 电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON” 扫描硬件系统[ PONENTS ]“ON” (3)打开[ 电动显微镜开关] 打开[ 荧光灯开关] (注:具有5 档光强调节旋钮) (4)Ar 离子激光器主开关“ON” 顺时针旋转钥匙至“—” 预热等待约15分钟, 将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至 “Laser run”状态,即可正常使用 (5)打开[ 电脑开关],进入操作系统
注:键盘上也具有[ 电脑开关] 2、2 软件得快速使用说明 (1)电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标 (2)进入ZEN 界面,弹出对话框: “Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、 分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已 存图像数据得处理、分析。 (3)软件界面: 1 功能界面切换:扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)、维护(Maintain) (注:Maintain仅供Zeiss专业工程师使用) 2 动作按钮; 3 工具组(多维扫描控制); 4 工具详细界面; 5 状态栏; 6 视窗切换按钮; 7 图像切换按钮;8 图像浏览/预扫描窗口;9 文档浏览/处理区域;10 视窗中图像处理模块 动作按钮: Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。 Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程(1组图片,如XYZ、XYT 等)。 Stop ——暂停/结束扫描。 New ——建立一个新图像扫描窗口/文档。 激光连接状况检查 眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换(ZEN软件界面右上角): Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。(激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。) Camera ——光路切换至相机。 LSM ——共聚焦扫描成像光路。 显微镜设置: “Ocular”——> “Light Path”——> 点击物镜图标,选择物镜——> 样品聚焦。 透射光控制(Transmitted Light Control) 反射光光闸控制(Reflected Light Shutter) 荧光激发块选择(Reflector) 共聚焦LSM 扫描设置 点击“LSM”(ZEN软件界面右上角),系统切换至共聚焦扫描光路: 光路设置: Smart Setup ——自动预设光路 选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法, 应用“Apply”。 (注:Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫 描。Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺 序扫描。Best promise 为兼顾速度与信号得折
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理 从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用 目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
扫描电子显微镜文献综述
扫描电子显微镜的应用及其发展 1前言 扫描电子显微镜SEM(Scanning Electron Microscopy)是应用最为广泛的微观 形貌观察工具。其观察结果真实可靠、变形性小、样品处理时的方便易行。其发展进步对材料的准确分析有着决定性作用。配备上X射线能量分辨装置EDS (Energy Dispersive Spectroscopy)后，就能在观察微观形貌的同时检测不同形貌特征处的元素成分差异,而背散射扫描电镜EBSD（Electron Backscattered Diffraction）也被广泛应用于物相鉴定等。 2扫描电镜的特点 形貌分析的各种技术中，扫描电镜的主要优势在于高的分辨率。现代先进的扫描电镜的分辨率已经达到1纳米左右；有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构试样制备简单；配有X射线能谱仪装置，这样可以同时进行 显微组织性貌的观察和微区成分分析[1]。低加速电压、低真空、环境扫描电镜和电子背散射花样分析仪的使用，大大提高了扫描电子显微镜的综合、在线分析能力；试样制备简单。直接粘附在铜座上即可，必要时需蒸Au或是C。 扫描电镜也有其局限性,首先就是它的分辨率还不够高，也不能观察发光或高温样品。样品必须干净、干燥，有导电性。也不能用来显示样品的内部细节，最后它不能显示样品的颜色。 需要对扫描电镜进行技术改进，在提高分辨率方面主要采取降低透镜球像差系数, 以获得小束斑；增强照明源即提高电子枪亮度( 如采用LaB6 或场发射电子枪) ；提高真空度和检测系统的接收效率；尽可能减小外界振动干扰。 在扫描电镜成像过程中，影响图像质量的因素比较多，故需选择最佳条件。例如样品室内气氛控制、图像参数的选择、检测器的选择以及控制温度的选择，尽可能将样品原来的面貌保存下来得到高质量电镜照片[2]。
德国Zeiss激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册
德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司 孙 凯 2009年6月
目录目录：： 1 系统的组成 系统组成及光路示意图 实物照片实物照片说明说明 2 系统的使用 2.1 开机顺序 2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明 2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制 2.4 关机顺序 3 系统的维护
1 系统的组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。。 系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：： 电脑工作站 激光器 扫描检测单元 电动荧光显微镜
实物照片说明实物照片说明：： 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO 2培养系统控制器 激光器 电脑工作站
2 系统的使用 2.1 开机顺序 （1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮）） 等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关 （2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ” 电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ” 扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ” （3）打开 [ 电动显微镜开关 ] 打开 [ 荧光灯开关 ] （注：具有5档光强调节旋钮） （4）Ar 离子激光器离子激光器主开关主开关 “ON ” 顺时针旋转钥匙 至 “—” 预热预热等待约等待约15分钟分钟，， 将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby ”扳至 “Laser run ”状态状态，，即可正常使用 （5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统 注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ]
激光扫描共聚焦显微镜_图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2008.10.14 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……
Conventional fluorescence microscope Confocal microscope 历史
1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。 1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。 1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。 Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987 Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus
Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜 1．激光器： 1.1系统激光器覆盖可见光及紫外光： 1.1.1蓝光固体激光器488nm20mW； 1.1.2绿光固体激光器552nm20mW； 1.1.3红光固体激光器638nm，20mW 1.1.4紫外固体激光器405nm50mW； 1.2激光器的开闭和电压调节完全由软件控制，无需另设单根激光器的开关。并具有激光寿命保护装置。 1.3具有激光强度回馈稳定电路设计，在动态记录中激光强度不会受环境的影响而改变。 2．共聚焦扫描系统： 2.1激光扫描系统直接与共聚焦机身连接 2.2检测器数量 ①三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器； ②扫描检测器包括2个光电倍增管（PMT）和一个磷砷化镓混合型检测器HyD。*③可以升级为五个以上独立连续光谱荧光检测器。 2.3连续分光设计系统（或其它光谱分离系统） *①三个通道，一个透射光DIC通道；二个荧光通道均为可做连续全光谱检测的荧光通道； ②光谱型荧光通道可自由更换荧光通道检测的波长范围，二个荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描； ③多通道荧光图像即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加，精确对光谱进行分析； ④荧光通道具有高精度的共聚焦针孔，具有宽波谱范围内的色差校正功能，保证在多重荧光标记的同时检测过程中每个通道扫描光切平面和厚度的一致性和荧光精确定位。 2.4光谱扫描功能 ①高速多通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像； ②光谱分辨率2nm，可连续以1nm波长调节； ③光谱扫描范围：400-800nm；光谱扫描步进：1nm； ④高速棱镜分光，线性光谱拆分，可区分光谱大量重叠的染料； ⑤光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设（可调节）。 2.5扫描速度及速度调节 *①扫描视野22mm下扫描速度7幅/秒（512×512pixels）；70幅/秒（512×16pixels）； ②双向扫描速度3600线/秒；扫描速度可精确调节。 2.6共聚焦针孔1个，全自动调节型，孔径50-300微米，调节步进0.5微米。
LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13
Leica激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月
目录： 1 系统的组成 系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)
Leica SP8 系统组成图
1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件
激光共聚焦显微镜操作规程
激光共聚焦显微镜操作规程 一、准备工作 a)打开计算机。依次打开激光器电源、钥匙开关。多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) ON、氦氖绿(543 nm) ON、 氦氖红(633 nm) ON。打开汞灯电源开关。 b)登陆Windows XP系统。双击快捷方式：FV10-ASW 1.1。User ID: Administrator ; Passeword: Administrator。注 意区分大小写。 二、显微镜镜下观察 １.微分干涉差观察 a)使用手控面板选择物镜。插入起偏镜。插入微分干涉滑块。 b)点击FV10-ASW软件中的图标。标本聚焦. ２.荧光观察： c)使用手控面板选择物镜。 d)打开汞灯的机械快门，拉出DIC滑块，点击FV10-ASW软件中的图标 e)使用手控面板选择荧光滤色片。标本聚焦。 ３.获取单张荧光图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮。 b)关闭汞灯快门，点击按钮，关闭卤素灯快门。 c)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV,，并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮，“2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像:右图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像。(保存为“xml”类型是击FV10-ASW 软件专用的图像格式。) ４.获得单张（荧光+微分干涉）图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮，关闭汞灯快门。点击按钮，关闭卤素灯快门。 b)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 c)选择TD1。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节绿色(FITC)图像和微分干涉差的图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV, 并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像。 ５.获取3D图像 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光(Rhodamine)双标（这里介绍线序列扫描取图的过程.）
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图
二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一）细胞的三维重建
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡
激光共聚焦显微镜技术1讲解
激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别
nikon共聚焦显微镜安全操作规程
Nikon 共聚焦显微镜安全操作规程 一、操作步骤 1、开机：大体按照：电脑→激光台（打开要用的激光按钮）→卤素灯→载物台→显微镜→控制器→软件，荧光灯需要就打开，不需要不用打开 2、拍摄流程：打开软件Nikon confocal，ok进入软件操作界面，点eye port，看目镜聚焦，然后点eye port及Interlock解锁切换到激光光路L100，根据自己实验来设置参数和探测方法（DU4），然后点scan，重调Z轴找焦面，对通道进行HV和功率优化，停止scan，点击capture，完成一次拍摄。 3、图像保存：⑴数据保存：File，save as，保存原始数据文件格式.ND2；⑵图片保存：File，Inport/Export，Export ND document，在Export ND document 窗口中Channels，TIF compatibility Options（选择第二个或第三个），保存叠加图像时，在Export ND document 窗口中Channels勾选Insert Overlaps，再点击export 4、关机：Z轴降到500以下，物镜转到空挡，最后与开机完全相反顺序进行关机。 二、注意事项： 1、放置样品时，确保样品的中心区域在物镜的正上方，且尽量要物镜在两个夹片中心区域，以免转换物镜时，撞坏物镜； 2、原则上所有的光源都非常忌讳频繁开关，会大大缩短其使用寿命。荧光灯、卤素灯：开机后不管是否使用，都最好半小时后再关闭；关机后至少等十五分钟再开机。激光：开机后不管是否使用，都最好一小时后后关闭；关机后至少等一小时再开机。 3、明场卤素灯的功率值不能超过4，否则会导致温度过高烧坏光纤，影响明场成像； 4、60倍和100倍物镜是油镜，滴油时注意只需沾一下，切勿多，滴了油，如果要转物镜，必须先将当前滴了油的物镜用石油醚清洗擦干净才能转换； 5、实验结束或者换样品转换镜头时必须按照以下程序进行操作：首先，取下样品，将物镜Z轴值降到500以下，然后，将载物台的载玻片拨至两端，最后再进行物镜的转换。
扫描电子显微镜的操作步骤和注意事项心得
扫描电子显微镜的操作步骤和注意事项心得扫描电子显微镜的操作步骤与注意事项一、样品制备 将分散好的样品滴于铜片上，干燥后将载有样品的铜片粘在样品座上的导电胶 带上(对于大颗粒样品可直接将样品粘在导电胶带上)。 对于导电性不好的样品必须蒸镀导电层，通常为蒸金:将样品座置于蒸金室 中，合上盖子，打开通气阀门，对蒸金室进行抽真空。选择好适当的蒸金时间，达 到真空度定好时间后加电压并开始计时，保持电流值，时间到后关闭电压，关闭仪器。取出样品。(注意:打开蒸金室前必须先关闭通气阀门，以防液体倒流。) 二、扫描电镜的操作 1.安装样品 “Vent”直至灯闪，对样品交换室放氮气，直至灯亮; 1) 按 2) 松开样品交换室锁扣，打开样品交换室，取下原有的样品台，将已固定好 样品的样品台，放到送样杆末端的卡抓内(注意:样品高度不能超过样品台高度，并 且样品台下面的螺丝不能超过样品台下部凹槽的平面); 3) 关闭样品交换室门，扣好锁扣; 4) 按“EVAC”按钮，开始抽真空，“EVAC”闪烁，待真空达到一定程度，“EVAC”点亮; 5) 将送样杆放下至水平，向前轻推至送样杆完全进入样品室，无法再推动为 止，确认“Hold”灯点亮，将送样杆向后轻轻拉回直至末端台阶露出导板外将送 样杆竖起卡好。(注意:推拉送样杆时用力必须沿送样杆轴线方向，以防损坏送样杆) 2.试样的观察(注意:软件控制面板上的背散射按钮千万不能点，以防损坏仪器) -51) 观察样品室的真空“PVG”值，当真空达到9.0×10Pa时，打开“
Maintenance”，加高压5kv，软件上扫描的发射电流为10μA，工作距离“WD”为8mm，扫描模式为“Lei”(注意:为减少干扰，有磁性样品时，工作距离一般为15mm左右); 2) 操作键盘上按“Low Mag”、“Quick View”，将放大倍率调至最低，点击“Stage Map”，对样品进行标记，按顺序对样品进行观察; 3) 取消“Low Mag”，看图像是否清楚，不清楚则调节聚焦旋钮，直至图像清楚，再旋转放大倍率旋钮，聚焦图像，直至图像清楚，再放大……，直到放大到所需要的图; 4) 聚焦到图像的边界一致，如果边界清晰，说明图像已选好，如果边界模糊，调节操作键盘上的“X、Y”两个消像散旋钮，直至图像边界清晰，如果图像太亮或太暗，可以调节对比度和亮度，旋钮分别为“Contrast”和“Brightness”，也可以按“ACB”按钮，自动调整图像的亮度和对比度; 5) 按“Fine View”键，进行慢扫描，同时按“Freeze”键，锁定扫描图像; 6) 扫描完图像后，打开软件上的“Save”窗口，按“Save”键，填好图像名称，选择图像保存格式，然后确定，保存图像; 7) 按“Freeze”解除锁定后，继续进行样品下一个部位或者下一个样品的观察。 3.取出样品 1) 检查高压是否处于关闭状态(如HT键为绿色，点击HT键，关闭高压，HT键为蓝色或灰色); mm，点击样品台按钮，按Exchang(2)检查样品台是否归位，工作距离为8 键， Exchang灯亮; (3) 将送样杆放至水平，轻推送样杆到样品室，停顿1秒后，抽出送样杆并将送样杆竖起卡好，注意观察Hold关闭，为样品台离开样品室。
扫描式电子显微镜观察
掃描式電子顯微鏡觀察 為觀察觀音一號井與麓山帶地層中碎屑性和自生性黏土礦物之 分佈與生長，以及隨埋藏深度增加，自生性黏土礦物(如:混層伊萊石膨潤石)之元素組成之比例有無改變，本研究使用中央大學地球物理研究所JSM-7000F熱場發射掃描式電子顯微鏡(Thermal Field Emission Scanning Electron Microscope, TFE-SEM)，用以觀察碎屑性和自生性礦物之分佈與生長情形。SEM的操作條件為加速電壓15 kV、真空室壓力達2.8 × 10-4 Pa、工作距離10 mm。一般掃描式電子顯微鏡偵測主要為偵測二次電子(Secondary Electron Image, SEI)和背向散射電子(Backscattered Electron Image, BEI)成像，由於其產生電子之行為不同，所產生之影像分別為樣本之表面形貌和原子序對比(Goldstein et al., 2003)。平均原子序較高之區域，散射之背向電子訊號較強，呈現之影像較亮。本研究以背向散射電子偵測為主要觀察工具。由於黏土礦物之主要元素成份以原子序較低的矽、鋁氧化物和其他少量金屬鐵、鎂、鈣、鈉、鉀等，因此在背向散射電子影像中，黏土礦物多分佈在深暗色區域。 另外，使用加裝於SEM之元素能量分析儀(Energy Dispersion Spectrometer, EDS)，可透過搜集激發電子束產生的X光進行礦物化學組成之定性和半定量分析。EDS操作環境為電子加速電壓15 kV、放大倍率為2000倍以及接收100秒X光光譜時間。使用INCA 軟體(Revision 4.09)，鈦元素光譜校準，搜集測量結果之各氧化物重量百分比，混層伊萊石/膨潤石黏土礦物的化學式以22顆氧原子，計算化學式中的陽離子數，部分鋁離子納入四面體網格計算，即矽和鋁離子總和為8；剩餘鋁離子和鐵、鈦、鎂和鈉則被歸為八面體網格計算(Klein, 2002)。
激光共聚焦显微镜在材料领域应用的初探
激光共聚焦显微镜在材料领域应用初探 夏仲琦，周向群(2010-07-02 18:35:09) 一、前言 作为一种微观形态学工具，光学显微镜在工业测试方面的应用，目前主要大家比较熟悉的主要是以下方面： 首先，单独作为形态学工具，进行材料组织分析和外观缺陷检查，其典型的产品是金相显微镜和立体显微镜。 第二、光栅量测结合，进行部件的精密尺寸测量，其典型的产品是工具显微镜，测量显微镜。 近年来，随着计算机软件技术的发展，显微镜与图象处理系统的结合，产生了定量金相软件、工显测量软件、一般几何测量软件等等，使其不仅可以定性分析，更能在定量化上发挥重大作用。 但光学显微镜的局限在于，它是一种二维的形态学工具，其极限有效分辨率是0.35微米，该分辨率下的景深在1微米以下。因此如果要在高倍率下观察表面的三维形态，特别是纵向方向的形态，通常一定需要使用SEM而不是OM。SEM是这一方面非常成熟有效的标准工具，但有些样品使用SEM会碰到以下困难： 1、样品本身比较大，且不能做分割的器件组，虽然被观察的部分是微小的局部，但整个样品难 以放入SEM中。 2、非金属样品，且不适合做导电性处理。特别是一些对微小处理很敏感的样品。 3、无法测量多种尺寸数据，比如体积，面积，粗糙度等等。 针对这些问题，SEM厂家在不断推出更新的技术。同时，光学显微镜开发者也在探索如何使光学显微镜成为一种三维的微观形态学工具。 这方面目前比较有成效的技术，是激光扫描共焦显微镜（CF-LSM）。 共聚焦激光扫描显微镜的发展在国外，主要为日本。是从80年代末期开始的，目前在日本，共聚焦激光扫描显微镜已经是一种被广泛采用的技术，既用来观察样品表面亚微米程度（0.12微米）的三维形态和形貌，又可以测量多种微小的尺寸，诸如体积、面积、晶粒、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等等。 另外，它还有以下特点： 1、使用方便,与一般光学相似,且全部采用计算机直观控制。 2、基本无须制样,不损伤样品。不需要做导电处理,也容许大尺寸样品直接观察,完全不破坏样品。 3、几十秒到一两分钟即完成全部的扫描，成像，测量采样工作。该设备目前已经为吉林大学，哈 尔滨工业大学用于材料和机械加工方面的研究。
扫描电子显微镜基本原理和应用
扫描电子显微镜的基本原理和结构 下图为扫描电子显微镜的原理结构示意图。由三极电子枪发出的电子束经栅极静电聚焦后成为直径为50mm的电光源。在2-30KV的加速电压下，经过2-3个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成孔径角较小，束斑为5-10m m的电子束，并在试样表面聚焦。末级透镜上边装有扫描线圈，在它的作用下，电子束在试样表面扫描。高能电子束与样品物质相互作用产生二次电子，背反射电子，X射线等信号。这些信号分别被不同的接收器接收，经放大后用来调制荧光屏的亮度。由于经过扫描线圈上的电流与显象管相应偏转线圈上的电流同步，因此，试样表面任意点发射的信号与显象管荧光屏上相应的亮点一一对应。也就是说，电子束打到试样上一点时，在荧光屏上就有一亮点与之对应，其亮度与激发后的电子能量成正比。换言之，扫描电镜是采用逐点成像的图像分解法进行的。光点成像的顺序是从左上方开始到右下方，直到最後一行右下方的像元扫描完毕就算完成一帧图像。这种扫描方式叫做光栅扫描。 扫描电镜由电子光学系统，信号收集及显示系统，真空系统及电源系统组成。 1 电子光学系统 电子光学系统由电子枪，电磁透镜，扫描线圈和样品室等部件组成。其作用是用来获得扫描电子束，作为产生物理信号的激发源。为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。 <1>电子枪： 其作用是利用阴极与阳极灯丝间的高压产生高能量的电子束。目前大多数扫描电镜采用热阴极电子枪。其优点是灯丝价格较便宜，对真空度要求不高，缺点是钨丝热电子发射效率低，发射源直径较大，即使经过二级或三级聚光镜，在样品表面上的电子束斑直径也在5-7nm，因此仪器分辨率受到限制。现在，高等级扫描电镜采用六硼化镧（LaB6）或场发射电子枪，使二次电子像的分辨率达到2nm。但这种电子枪要求很高的真空度。 扫描电子显微镜的原理和结构示意图
激光共聚焦显微镜fv000中文说明书
Password: fluoview 5.双击快捷方式： 23
打开 FV10-ASW 应用软件. User ID: Administrator Password: Administrator * 系统软件的启动需要等待一定时间. 显微镜镜下观察微分干涉差观察 1.使用手控面板选择物镜. (参照?Memo ?.) 2.插入起偏镜. 3.插入微分干涉滑块. 4.点击FV10-ASW 软件中的图标 . Note1:使用TD 滑块控制卤素灯的 光强； Note2:检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT ”，如果不是，用手柄按下DICT 图标 5.标本聚焦 *DIC 元 件 2 4 手控面板
显微镜镜下观察 荧光观察 1.使用手控面板选择物镜. 2.点击FV10-ASW 软件中的图标. 3.使用手控面板选择荧光滤色片.(参照 ?Memo ?.) 4.标本聚焦. Hand switch Notes 1 & 3
扫描模 式扫描速 激光输出的调节 明场观察 ( 显微镜镜下观察 ) 荧光观察 ( 显微镜镜下观察 ) 扫描的按钮 选择 XYZ,XYT 或 X YL 每个通道的调节 共聚焦的孔径大小 卤素灯的光强调节 Kalman 方式 染料选择 光路图 设定 图像的拇指索引 内存中所显示的文件 Lambda 扫描的设定 物镜 聚焦 时间间隔和时间计数 ( 用于 XYT 或 X T 扫描 ) λ 扫
获取单张图像（XY 平面）（荧光图像） ?例：绿色荧光染色（FITC ） 1.点击FV10-ASW 软件中的 按钮关闭汞灯快门 . 同时, 点击按钮 关闭卤素灯快门. 2.点击染料选择按钮. 在染料列表中, 双击用于观察的荧光染料. *取消当前荧光染料，选择另外荧光染料，要双击已指定的荧光染料，并重复步骤2. 3.点击Apply 按钮. (关闭染料选择面板可以用Close 按钮.) 3 染料选择后的显示界面
共聚焦显微镜使用技巧与心得
共聚焦显微镜使用技巧与心得（一）之荧光原理篇 关键词：共聚焦显微镜心得2014-12-24 09:46 来源：丁香园点击次数：1112 工欲善其事必先利其器，想用好共聚焦显微镜光会用操作可不行，那永远不可能成为“共聚焦达人”，要想成为“达人“必先懂得原理，好吧，开始啦。 什么是荧光？ 荧光： 荧光现象是物质在光的照射下所产生的发光现象。 首先荧光是一种光致发光现象，荧光物质必须是在光的照射下才能发光。否则就是其他的发光现象而不是荧光。例如夜光物质，夜光表，虽然也需要先用光照射，但离开光照射后它还能继续发光，就不是荧光。这叫磷光。另外一个例子是作western blot时用化学发光，也是发光，但不是荧光。 其次，荧光物质发出的荧光与照射光的色彩不同。准确地说，是荧光物质发光的波长与照射光的波长是不同的。典型的荧光物质是在紫外线照射下能发出黄绿色的荧光。例如钱上的的荧光防伪标记，用紫外线照射后能发黄绿色的光。 所以在使用荧光显微镜的照片，观察绿色荧光样品时，你会看到物镜下照射到样品的光是蓝色的光。观察红色荧光样品时，照射样品的却是绿色的光。但在目镜里却能分别看到绿色与红色的荧光图像。 在荧光显微镜里，使用蓝色光照射样品后，样品发出的绿色荧光与照射样品的蓝色光混在一起，经过一个滤光片，把蓝色的照射光过滤掉，这样在目镜上就只看到绿色的荧光了。 样品发出的荧光，虽然有一种颜色，但它并不是单色光，而是有一定波长分布范围的混合光。具体测量出每个波长下的相对光强，作一条光强-波长的关系曲线，这就是荧光光谱了。或者称之为发射光谱。它反映了这个物质发射的荧光的色彩成分。一般情况下，荧光物质的荧光光谱的波长范围并不会太大，所以它会形成某种明显的颜色。例如绿色或红色或黄绿色。通常这个波长范围是几十个纳米。 在荧光的光谱分布中，当然会有一个波长对应着最强的荧光强度，这个波长就是我们平时所说的荧光的波长，又叫最大发射光波长，通常荧光染料的参数中的荧光波长就是这个波长。荧光物质所发出的光实际上是这个波长上下几十纳米范围之内的。 照射样品的光叫激发光。激发光的波长必须比荧光波长短。这是能量守恒的因素。短波长的
激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜原理 激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。 图1. 共聚焦显微镜简化原理图 图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。
图2. 探测针孔的作用示意图 图2解释了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。共聚焦显微技术是由美国科学家马文?闵斯基(Marvin Minsky)发明的；他于1957年就为该技术申请了专利。但是直到八十年代后期，由于激光研究的长足进步，才使得激光共聚焦扫描显微技术（CLSM）成为了一种成熟的技术。 图3. 激光共聚焦显微镜原理框图 当今的激光共聚焦显微镜已经发展为一种结合了激光技术，显微光学，自动控制和图像处理等多种尖端科研成果的高技术工具。是现代微观研究领域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信赖与创造”的一贯企业理念，正在为业界提供世界领先水平的共聚焦显微镜系统产品。