自身免疫调节因子在小鼠肠系膜和外周淋巴结中的表达及其意义

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－０００１－０５［收稿日期］　２０１１－０７－２９［基金项目］　国家自然科学基金资助课题（３０８７２３０７，８１００１３０４）［作者简介］　孙际童（１９８５－），女，吉林省长春市人，在读医学博士，主要从事免疫耐受研究。

［通信作者］　杨　巍（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４７６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｏｙａｎｇ２００８２００８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ）ＤＯＩ： ＣＮＫＩ：２２－１３４２／Ｒ．２０１１１２２８．１０１７．００４网络出版时间：　２０１１－１２－２８　１０：１７网络出版地址：　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２２．１３４２．Ｒ．２０１１１２２８．１０１７．００４．ｈｔｍｌ自身免疫调节因子在小鼠肠系膜和外周淋巴结中的表达及其意义孙际童，吴　静，贾　婷，刘雪岩，杨　巍（吉林大学白求恩医学院免疫学系，吉林长春１３００２１）［摘　要］　目的：研究自身免疫调节因子（Ａｉｒｅ）在小鼠肠系膜和外周淋巴结表达的分布，探讨Ａｉｒｅ在外周免疫耐受中的作用，阐明淋巴结表达Ａｉｒｅ在维持耐受及防止自身免疫病中的作用机制。

方法：分别采用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测ＢＡＬＢ／ｃ小鼠肠系膜淋巴结和外周淋巴结中Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ和蛋白的表达情况；采用ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＢＡＬＢ／ｃ小鼠淋巴结基质和非基质组分中Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ表达情况；采用ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫细胞化学染色法检测小鼠淋巴结基质细胞中Ａｉｒｅ的表达情况。

结果：肠系膜淋巴结和外周淋巴结均有Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ和蛋白的表达，表达水平组间比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；淋巴结基质与非基质组分均检测到Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ的表达，其中Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ在非基质组分的表达水平高于基质组分（Ｐ＜０．０５）。

成功分离培养淋巴结基质细胞，即上皮细胞（ＥＰＩｓ）与纤维原网状细胞（ＦＲＣｓ），阳性率约为７０％；Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ及蛋白在ＥＰＩｓ与ＦＲＣｓ中均有表达，且在ＥＰＩｓ中的表达强于ＦＲＣｓ。

结论：Ａｉｒｅ可表达于小鼠肠系膜和外周淋巴结以及淋巴结基质细胞中，提示Ａｉｒｅ可能通过多种机制共同参与外周免疫耐受的维持。

［关键词］　自身免疫调节因子；肠系膜淋巴结；外周淋巴结；外周免疫耐受［中图分类号］　Ｒ３９２．１ ［文献标志码］　ＡＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｉｎ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓａｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｓＳＵＮ　Ｊｉ－ｔｏｎｇ，ＷＵ　Ｊｉｎｇ，ＪＩＡ　Ｔｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｘｕｅ－ｙａｎ，ＹＡＮＧ　Ｗｅｉ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ　Ｂｅｔｈｕｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（Ａｉｒｅ）ｉｎ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ（ＭＬＮｓ）ａｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ（ＰＬＮｓ），ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ａｎｄ　ｃｌａｒｉｆｙ　ｔｈｅａｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｌｙｍｐｈｙ　ｎｏｄｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＭＬＮｓ　ａｎｄ　ＰＬＮｓ　ｆｒｏｍＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｓｔｒｏｍａｌ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｓｔｒｏｍａｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆｔｈｅ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｙｍｐｙ　ｎｏｄｅｓｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎＭＬＮｓ　ａｎｄ　ＰＬＮｓ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ１第３８卷　第１期２０１２年１月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１　Ｊａｎ．２０１２ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｍａｌ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｓｔｒｏｍａｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓｔｒｏｍａｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＥＰＩｓ）ａｎｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ（ＦＲＣｓ）ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　７０％．Ｔｈｅ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ＥＰＩｓａｎｄ　ＦＲＣｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＥＰＩｓ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｔ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ＦＲＣｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｉｒｅ　ｃａｎ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｎ　ＭＬＮｓ　ａｎｄ　ＰＬＮｓ　ｏｆ　ｍｉｃｅ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　Ａｉｒｅｍａｙ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ　ｔｏ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ；ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ；ｐｅｒｉｐｌｅｒａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ 自身免疫增多内分泌病变－念珠菌病－外胚层营养不良（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ－ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ－ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ＡＰＥＣＥＤ）是一种多器官受累的自身免疫病，也称为自身免疫性多腺体综合征Ⅰ（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｔｙｐｅⅠ，ＡＰＳⅠ）。

１９６４年首次报道其典型临床表现为三联征，即慢性皮肤黏膜念珠菌感染、甲状旁腺功能低下和Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ病［１］，此外患者还常伴有其他自身免疫病及免疫缺陷症状，如甲状腺疾病、糖尿病和自身免疫肝炎等。

然而其发病原因直到１９９７年才被揭示，研究证实ＡＰＥＣＥＤ是由自身免疫调节因子（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ，Ａｉｒｅ）单一基因突变所导致［２］。

Ａｉｒｅ作为一种转录因子主要表达在胸腺髓质上皮细胞（ｍＴＥＣｓ）中，通过影响ｍＴＥＣ中多种外周组织特异性抗原（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ，ＰＴＡｓ）的表达，从而参与胸腺的阴性选择，清除自身反应性Ｔ细胞。

研究［３］表明：在外周免疫器官（淋巴结、脾脏和外周血细胞）特别是淋巴结中，同样可以检测到Ａｉｒｅ基因的表达。

这一结果引起了研究者对Ａｉｒｅ在胸腺外作用的思考：Ａｉｒｅ是否同在胸腺中的作用类似，也参与外周耐受的维持？然而目前为止Ａｉｒｅ在外周表达的功能及意义仍不十分清楚［４］。

肠道作为一个特殊部位，在维持机体正常菌群的同时，具有强大的耐受作用。

Ａｉｒｅ作为免疫调节因子在维持免疫耐受中发挥重要作用，因此Ａｉｒｅ是否也对肠道这一特殊部位的耐受提供支持，是否会优势表达于其相关淋巴结（ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ，ＬＮｓ），各家报道不一致。

ＬＮｓ可分为肠系膜淋巴结（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ，ＭＬＮｓ）和外周淋巴结（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ，ＰＬＮｓ），已检测到Ａｉｒｅ　ｍＲＮＡ在ＭＬＮｓ中表达［５］。

但Ａｉｒｅ在ＭＬＮｓ和ＰＬＮｓ中表达是否存在差异尚不清楚。

此外，在淋巴结中表达Ａｉｒｅ的具体细胞类型也不明确。

最近，非血源性的淋巴结基质细胞（ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ，ＬＮＳＣｓ）在外周免疫耐受中的作用得到了广泛关注。

研究［６］发现：这些基质细胞表达一系列与临床疾病相关的ＰＴＡｓ和转录因子，参与对从中枢逃逸到外周的自身反应性Ｔ细胞的清除，并能维持外周免疫耐受。

本研究主要通过检测Ａｉｒｅ在淋巴结表达的分布情况，明确淋巴结中表达Ａｉｒｅ的基质细胞类型，探讨其在外周免疫耐受中的可能机制，为研究Ａｉｒｅ在外周表达的功能和意义提供理论基础。

１　材料与方法１．１　实验动物　洁净级近交系ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，体质量１８～２２ｇ，雄性，由吉林大学实验动物中心提供。

１．２　主要试剂及仪器　ｍＲＮＡ　ＰＣＲ（ＡＭＶ）ｋｉｔ试剂（日本ＴａＫａＲａ公司），Ｔｒｉｚｏｌ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴａｑ聚合酶、Ｍａｒｋｅｒ（北京全式金生物技术有限公司），ｄＮＴＰ（２．５／１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）、ＯｌｉｇｏｄＴ（天根生物试剂有限公司），ＰＣＲ引物（上海生工生物技术有限公司合成），ＤＥＰＣ、胰酶（北京鼎国生物技术有限责任公司），琼脂糖（厦门百维信生物科技有限公司），ＮＣＳ（长春博德生物技术公司），Ｓ－Ｐ组化试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司），角蛋白抗体（武汉博士德生物技术有限公司），ｇｐ３８抗体（美国ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ公司），Ａｉｒｅ抗体（美国ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ公司），β－ａｃｔｉｎ抗体（武汉博士德生物有限公司），ＨＲＰ标记山羊抗小鼠二抗、ＨＲＰ标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物公司）。