红酵母类胡萝卜素提取工艺及色素稳定性研究

红酵母类胡萝卜素提取工艺及色素稳定性研究作者：梁慧星,陈欣,李朝霞来源：《湖北农业科学》2011年第04期摘要：从细胞壁破碎方法及类胡萝卜素提取条件等方面对红酵母类胡萝卜素提取方法进行了优化；研究了红酵母色素的光稳定性、热稳定性及山梨酸钾对其保存的作用。

结果表明，酸热法是红酵母破壁较理想的方法，最佳优化提取条件为盐酸摩尔浓度２ｍｏｌ／Ｌ，盐酸用量１０ｍＬ／（ｇ干菌体），浸泡时间６０ｍｉｎ；红酵母色素的热稳定性和光稳定性较差，红酵母色素保存时添加一定浓度的山梨酸钾对防止其氧化有一定的作用。

关键词：红酵母；类胡萝卜素；提取；色素稳定性中图分类号：ＴＳ２０５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）04－0815-03ＳｔｕｄｙｏｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｓｐ．ａｎｄＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａＰｉｇｍｅｎｔＬＩＡＮＧＨｕｉ－ｘｉｎｇ１，２，ＣＨＥＮＸｉｎ３，ＬＩＺｈａｏ－ｘｉａ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００３７，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＹａｎｃｈｅｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｃｈｅｎｇ２２４００３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；３．ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２００３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｓｐ．ｂｙｂｒｅａｋｉｎｇｃｅｌｌｗａｌｌｓａｎｄｏｔｈｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ；ｔｈｅｎｔｈｅｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＧｌｕｔｉｎｉｓｐｉｇｍｅｎｔ，ｓｔｏｒａｇｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｏｔａｓｓｉｕｍｓｏｒｂａｔｅｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｃｏｍｂｉｎｉｎｇｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃａｃｉｄｗｉｔｈｈｅａｔｉｎｇｗａｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｅｌｌｒｕｐｔｕｒｉｎｇｏｆＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ，ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｓｏａｋｉｎｇｉｎＨＣｌａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２ｍｏｌ／Ｌｗｉｔｈａｎｄｏｓａｇｅｏｆ１０ｍＬ／ｇ（ｄｒｙｃｅｌｌｓ）ｆｏｒ６０ｍｉｎ．Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｉｇｍｅｎｔｒｅｄｕｃｅｄｑｕｉｃｋｌｙｉｆｄｉｒｅｃｔｌｙｅｘｐｏｓｅｄｔｏｈｅａｔａｎｄｌｉｇｈｔ；ｂｕｔ adding ｃｅｒｔａｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｏｆｐｏｔａｓｓｉｕｍｓｏｒｂａｔｅｃｏｕｌｄｐｒｏｔｅｃｔｔｈｅｐｉｇｍｅｎｔｆｒｏｍｏｘｉｄａｔｉｎｇｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｓｐ．；ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｉｇｍｅｎｔｓｔａｂｉｌｉｔｙ类胡萝卜素作为食品添加剂和营养增补剂，其优良品质和功效，早已为人们所公认，目前已被广泛应用于医药、食品及饲料添加剂等领域中。

另外，它还具有预防血管硬化、抑制肿瘤发生、增加宿主免疫力和抗氧化等功能［１－３］。

利用微生物技术生产天然类胡萝卜素的主要菌种为三孢布拉氏霉和红酵母［４，５］，其中三孢布拉氏霉发酵产率虽然较高，但存在发酵工艺复杂、周期长、成本高等缺点；红酵母营养要求简单，发酵工艺易于调控，培养周期短，菌体可综合利用，且属于我国饲料行业１２种确认的饲用微生物之一，发酵过程易于产业化，具有很高的应用价值和较好的开发前景［６，７］。

试验以一株红酵母作为试验菌种，利用较适宜的发酵培养条件获得一定量红酵母菌体后，分别研究了破壁方法、提取溶剂、溶剂添加量及提取时间等因素对类胡萝卜素提取效果的影响，并通过正交试验，确定最佳的提取工艺条件，以提高类胡萝卜素的提取含量，并对其所产色素的稳定性进行了初步研究。

１材料与方法１．１材料１．１．１菌种、培养基红酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）为盐城工学院东校区微生物试验室保存；斜面活化培养基（ＰＤＡ）：马铃薯４０ｇ，葡萄糖４ｇ，琼脂３ｇ，水２００ｍＬ；发酵液：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１５ｇ，水１０００ｍＬ；种子培养基：葡萄糖２．０％，蛋白胨１．０％，酵母膏１．０％。

１．１．２试剂葡萄糖、琼脂粉、盐酸、氯化钠、丙酮、乙醇、乙酸、乙醚、氯仿、甲苯等，石英砂。

１．１．３仪器ＳＷ－Ｃ－Ｊ－２Ｆ超净工作台、３１０Ｐ－０３精密台式ｐＨ计、ＹＸＱ－ＳＣ４１－２８０Ａ手提式压力蒸气灭菌锅、ＵＶ－９２００紫外／可见分光光度计、ＴＧＬ－１８Ｇ高速台式离心机。

１．２方法１．２．１红酵母的发酵培养将保藏菌种移接到ＰＤＡ培养基上，在２８℃下活化４８ｈ。

挑２环接入装有５０ｍＬ液体种子培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，２８℃振荡培养２４ｈ。

然后按５％的接种量接入装有５０ｍＬ发酵培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，于２８℃下振荡（１５０ｒ／ｍｉｎ）培养７２ｈ。

１．２．２干菌体的获得将三角瓶中的发酵液倒入离心管中，４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，倒去上清液，加入少许水洗涤，再４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，并倒去上清液。

用玻璃棒把细胞泥刮至培养皿中，５０℃左右烘干即得干菌体［８］。

１．２．３破壁方法比较酵母的细胞壁比较坚韧，单靠氯仿、丙酮、苯等有机溶剂的破坏作用是不够的。

根据有关文献与相关研究结果，选取了以下５种破壁方法进行比较。

１）酸热法。

取０．２５ｇ干菌体放入带帽试管中，按１５ｍＬ／（ｇ干菌体）加入３ｍｏｌ／Ｌ盐酸，浸泡４０ｍｉｎ，之后于沸水浴中加热４ｍｉｎ，取出试管将细胞泥倒入离心管中，把离心管放在冰水混合液中冷却。

冷却至０℃后４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，弃上清液，即得细胞碎片。

２）机械法。

取０．２５ｇ干菌体放入带帽试管中，按０．５０ｇ／（ｇ干菌体）加入石英砂研磨，同时按１０ｍＬ／（ｇ干菌体）加入丙酮作为助磨剂，研磨时间为１５ｍｉｎ，所得混合物直接用于浸提。

３）细胞自溶法。

取０．２５ｇ干菌体放入带帽试管中，加入１０倍质量的水，并按４％的用量加入ＮａＣｌ作为质壁分离剂，调ｐＨ值为６．０～７．０，控制温度５５℃，自溶约３ｈ后以４５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，所获沉淀水洗后再离心，即得细胞碎片。

４）甲苯法。

取０．２５ｇ干菌体放入带帽试管中，按６ｍＬ／（ｇ干菌体）加入甲苯，于３５℃破壁４５ｍｉｎ，然后４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，去上清液即得细胞碎片。

５）超声波辅助酸热法。

步骤和酸热法相同，在盐酸浸泡过程中将试管置于超声波条件下，利用超声波来辅助破碎细胞壁。

每一种破壁方法结束之后，向细胞碎片中加入８ｍＬ丙酮作为浸提剂，浸泡３０ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，所得上清液即为丙酮的类胡萝卜素浸提液。

将浸提液用分光光度计在４８５ｎｍ处测定吸光度，类胡萝卜素含量测定参照Ｇｉｒａｒｄ等［９］的方法测定。

１．２．４有机浸提剂的选择为了比较和选择效果良好的有机浸提剂，对丙酮、乙醇和乙酸3种极性溶剂与甲苯、氯仿和乙醚3种非极性溶剂作了对比试验。

１．２．５光对红酵母色素稳定性影响红酵母色素粗体液按１．２．３中酸热法提取。

将１０ｍＬ同浓度的红酵母色素提取液分别倒入试管中，并且密封，分别置于暗室、室内散射光、室外日光及紫外光下８ｈ，每２ｈ测定其在４８５ｎｍ处的吸光度，并分析不同光照条件对红酵母色素稳定性的影响。

１．２．６热对红酵母色素稳定性影响将１０ｍＬ同浓度的红酵母色素提取液分别置于３０、４０、５０、６０℃的水浴锅中保温８ｈ，每２ｈ测定其在４８５ｎｍ处的吸光度。

１．２．７防腐剂对红酵母色素稳定性影响在１０ｍＬ同浓度的红酵母色素提取液中加入不同浓度（０～４ｇ／Ｌ）的山梨酸钾溶液１ｍＬ，常温下放置８ｈ，每２ｈ测定其在４８５ｎｍ处的吸光度。

２结果与分析２．１几种破壁方法比较从图１可知，利用超声波辅助酸热法得到的类胡萝卜素的含量最高，酸热法次之，两者结果差异不显著（Ｐ＞０．０５），考虑到生产成本、工艺操作等因素，酸热法在所试５种方法及其试验条件下具有最佳的破壁效果。

２．２有机浸提剂对类胡萝卜素提取含量的影响从图２可知，极性有机溶剂对类胡萝卜素的浸提效果明显好于非极性有机溶剂，其中又以丙酮浸提效果最好，浸提后细胞碎片基本呈无色。

２．３酸热法提取工艺的优化根据单因素试验的结果，选择盐酸摩尔浓度、盐酸用量、浸泡时间为考察因素，以红酵母中类胡萝卜素的提取含量为考察指标，进行正交试验。

因素与水平设计见表１，结果见表２。

由表２可知，影响类胡萝卜素提取含量的各因素主次关系依次为盐酸摩尔浓度＞盐酸用量＞浸泡时间；类胡萝卜素提取条件的最优组合为Ａ２Ｂ１Ｃ３，即盐酸摩尔浓度为２ｍｏｌ／Ｌ，盐酸用量为１０ｍＬ／（ｇ干菌体），浸泡时间为６０ｍｉｎ。

经验证试验，类胡萝卜素提取量平均达到４５０μｇ／（ｇ干菌体），提取效果较好。

２．４光对红酵母色素稳定性的影响由图３可知，紫外光对色素的稳定性影响是相当大的；室内自然光照条件下，虽然吸光度总体呈下降趋势但下降的幅度较小，总体还是趋于平稳；避光保存时，吸光度几乎不变。

２．５热对红酵母色素稳定性的影响从图４可以看出，在红酵母色素储存温度为４０℃以下时，随着时间的推移吸光度的变化不大，当温度大于４０℃时，红酵母色素的吸光度下降得非常明显。

也就是说随着储存温度的上升，红酵母色素容易被氧化，在４０℃以下时相对稳定，但吸光度总体的趋势还是在下降。

２．６防腐剂对红酵母色素稳定性的影响由图５可知，防腐剂山梨酸钾在色素短期保存时，对防止色素氧化有一定的作用，且山梨酸钾的浓度越高越利于色素的保存。

３小结通过对几种破壁方法的比较，认为酸热法是适合红酵母细胞破壁较理想的方法；通过对比几种有机溶剂的浸提效果，认为丙酮是从红酵母中浸提类胡萝卜素较优越的有机溶剂；红酵母菌株类胡萝卜素提取的最优条件组合为盐酸摩尔浓度２ｍｏｌ／Ｌ，盐酸用量１０ｍＬ／（ｇ干菌体），浸泡时间６０ｍｉｎ。

对于如何从红酵母中提取更多的类胡萝卜素，试验仅从提取工艺方面进行了研究，其他影响类胡萝卜素提取含量的条件如培养基成分、发酵条件及发酵时间等还有待于进一步的研究。

红酵母色素对光的稳定性较差，特别是在强烈的室外光下８ｈ左右红酵母色素的吸光度几乎为0；红酵母色素对温度的稳定性也较差，在４０℃以下相对比较稳定，但是随着保存温度的上升，红酵母色素的稳定性越来越差；防腐剂山梨酸钾在色素短期保存时，对防止色素氧化有一定的作用，且山梨酸钾的浓度越高越利于色素的保存。