共培养体系-①直接共培养体系将2种或2种上的细胞同时或分别接种于同一孔中不同种类的细胞之间直接接触

共培养体系-①直接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触

共培养体系-①直接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触。②间接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。

学术术语来源——

不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养

文章亮点：

1 共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化，诱导细胞自身分化，维持细胞功能和活力，对细胞增殖进行调控，促进早期胚胎的发育和提高代谢产物的产量。

2 实验的创新性在于将第3代脂肪干细胞和第2代成骨细胞在不同胎牛血清条件下共培养，证实两种方法均能使脂肪干细胞向成骨细胞分化。

关键词：

干细胞；脂肪干细胞；成骨分化；共培养；细胞培养；胎牛血清

主题词：

脂细胞；成骨细胞；细胞分化；细胞培养技术

摘要

背景：成骨细胞与骨髓干细胞共培养后可以诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，成骨细胞与脂肪干细胞共培养是否也能诱导向成骨细胞分化呢？

目的：观察脂肪干细胞与成骨细胞共培养后能否向成骨细胞分化。

方法：分离新西兰大白兔脂肪干细胞和成骨细胞，待脂肪干细胞生长至3代，成骨细胞生长至2代时，进行共培养。根据培养时血清浓度不同分为10%胎牛血清共培养组和5%胎牛血清共培养组，共培养14 d。

结果与结论：共培养7 d后，2组脂肪干细胞均出现部分变圆。14 d后，脂肪干细胞高度分化与成熟成骨细胞相似，碱性磷酸酶染色阳性、茜素红染色阳性，其Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均增高，以10%胎牛血清培养组更为明显。提示脂肪干细胞与成骨细胞经过共培养后可以向成骨细胞分化，高浓度血清培养可以促进诱导作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

安徽医科大学研究生细胞培养技术考试重点.doc

2014年细胞培养重点名词解释： 1组织工程应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物。从而使组织工程学研究的内容、应用范围和任务更加明确。组织工程的主要n的或内涵是对人体器官和组织修复。 2.接触抑制.指细胞相互接触后失去运动的现象。 3.肿瘤干细胞肿瘤中具有自我更新并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。 4.平衡盐溶液简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。在生理盐水的基础上，分别加入了无机盐、葡萄糖以及少量酚红，具有维持渗透压，调节溶液的PII值，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离了成分的作用, 常用的BSS有PBS、Hanks液等。 5.密度抑制由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多，和生存空间消失所引起细胞增殖抑制的现象。 6.去分化指己成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态，但是分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化的特点。 7.iPS诱导多功能干细胞即诱导多能干细胞，是指体细胞经过基因“重新编排”, 回归到胚胎细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力。这种方法可以不需要用人胚胎或卵母细胞，就能制造干细胞。 8.confluent汇合指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 9.细菌污染培养的细胞被细菌污染均会造成细胞受损和死亡，是细胞培养工作的大敌。细胞发生污染时，常有培养液变浑浊和PH发生改变等现象，镜下观察细胞变形、生长缓慢或分裂相消失，以及细胞圆缩脱落等现象。常有抗生素预防该污染。 10.灭菌杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 11.单克隆抗体，指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。问答题； 1 .试述“克隆”的基本概念并举例说明其在细胞培养工作中的实际意义。克隆(Clone):指由从一个共同的祖先通过无性繁殖而来的、遗传上同一的细胞群或后裔；Clone也可作动词用，用于指细胞形成克隆细胞群的过程，即从群体中把单个细胞分离出来, 通过增殖形成细胞群或后裔的过程;

MDCK细胞培养技术

孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml, 12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml, 24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml, 96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml, 24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml. 附件1：三、MDCK细胞培养技术（一）生物安全级别和生物安全规定 1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。 2. MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。（二）MDCK细胞的传代培养步骤

1. 细胞培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）：（1）生长成片的MDCK细胞；（2）T-75细胞培养瓶,颈口有倾角；（3）D-MEM培养液；（4）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000μg/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20℃；（5）HEPES缓冲液，1M母液；（6）胎牛血清；（7）EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA·4Na)（Gibco CatNo. 25300-062），分装后保存于-20℃；（8）牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液（GIBCO CatNo. 15260）；（9）1mL和10mL无菌移液管等；（10）70％～75％的酒精。建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。 2. 培养基和试剂的准备: （1）500mL的D-MEM液中加入 a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素)； b) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)； c) 7.5％牛血清白蛋白组分V12.5mL。 d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)

病毒的细胞培养

病毒的细胞培养病毒严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞，可用于病毒的培养。SPF动物及SPF鸡胚是目前常用的培养载体。一．细胞培养的特点 20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养，得以应用于病毒学研究、诊断及疫苗制备等方面。细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也相等，没有实验动物的个体差异，而且可以用于实验的数量远远超过动物或鸡胚，并且可以在无菌的条件下进行标准化的实验，可重复性良好。感染病毒的细胞可以通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可以结合免疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。细胞培养的重要用途之一就是从感染的动物体内分离病毒以及病毒克隆。从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑可达到克隆的目的。二．细胞培养的类型 1.原代细胞：动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个的细胞，再生长于培养器皿中。大多数组织均可制备原代细胞，但生长的速度及难易程度不等。肾和睾丸最为常用，甲状腺细胞生长缓慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性胃肠炎病毒的培养。原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。最好用SPF 动物的组织，以免携带潜伏的病毒，会影响所需病毒的生长，甚至造成灾难性的后果。 2.二倍体细胞株：将长成的原代细胞分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可以扩大，对病毒的易感性则基本无变化。从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。但巨噬细胞、神经细胞等体外培养一般不分裂，很难获得二倍体细胞株。 3.传代细胞系：与上述两类细胞不同，这类细胞可在体外无限制的分裂，亦可无限制的传代。有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。传代及培养方便是其优点，因此使用广泛。缺点是有的对分离野毒（即样本中的病毒）不敏感。因在实验室传代时间长，有的可能污染霉形体或者隐形感染的病毒，应予注意。由于担心致肿瘤的潜在危险，传达细胞系一般不能用于制备疫苗。

细胞工程知识点

细胞工程知识点 1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。 2、细胞工程的应用： 1)动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物 2)新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组 3)细胞工程生物制品：单克隆抗体制备、疫苗生产 4)细胞疗法与组织修复： 2细胞工程理论基础 1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。 2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。 3、细胞的脱分化：在一定营养和刺激因素作用下,具有特定结构与功能的植物组织的细胞被诱导而改变原来的发育途径,逐步失去原来的分化状态,细胞特性消失,转变为具有分生机能的细胞,并进行活跃的细胞分裂,这一过程称为去分化。 3细胞工程技术 1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。 2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏（1）细胞保存方法传代培养保存法低温冷冻保存法(低温、超低温保存) 液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态）玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻）细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。细胞培养和代谢调控：

细胞培养基种类

细胞培养基的选择及常用数据库日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中得培养一. 实验目得了解倒置显微镜得构造与使用，了解不同传代细胞得形态及接毒后得病变特征,掌握细胞得传代培养方法、病毒接利方法及收毒方法。二、常用细胞得种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela ：人得子宫瘤细胞 Ver 。：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero 细胞 TK-143:人得胸昔激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞三、材料 1、lOOml 细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 BHK-21 (baby hamster kidney)细胞生长液:含10%犊牛血清、200U/inl 青、链霉素得DMEM 2、 3、 0、25%胰酶 4、

维持液:含2-5%犊牛血清、200U/inl青、链霉素得DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV) 四.传代细胞培养得条件要求 1)细胞密度:2-3X105个/ml 2)pH 范围最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、8 3)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C 昆虫细胞28-3(rC 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸得竣基与其她氨基酸得氨基之间得多肽链发生水解, 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散得单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA):与二价钙、镁离子结合■从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶川I灰色链丝菌提取得一种酶制剂,就是蛋口酶、氨肽酶与竣肽酶得混合物。六、营养液 1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嚓吟、陀唏、辅助生长因子。 2、血清 1)血清得种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

病毒感染细胞实验整体流程和原理

病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。、腺病毒原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体

细胞工程重点总结

细胞工程（1）绪论 1．根据研究对象的不同，细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程。 2．克隆羊多莉的诞生证明了动物细胞核具有全能性。（2）第一章基本技术 1. 培养基基本成分大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十毫克到几千克。 ①无机盐类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素微量元素的用量一般低于10-5-10-7克分子浓度。植物所的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mn、Mo、Co ②有机成分：糖、维生素、肌醇、氨基酸、其他 ③植物激素：生长素、细胞分裂素 ④水：不同实验室要求使用不同级别的纯化水 ⑤其它附加成分：琼脂、活性炭、附加复合成分 2. 外植体(explant)：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。外植体的三种来源：①生长在自然环境下的植物 ②在温室控制环境条件下生长的植物 ③无菌环境下培养的植物 3. 外植体取材总体原则:①根据培养需求选择植物部位 ②多年生植物注意树龄和季节 ③在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作为外植体 4. 外植体灭菌顺序：外植体→清洗整理→杀菌剂灭菌→无菌水清洗外植体灭菌后应及时接种培养 5. 外植体培养条件的控制 ①光照光照时间影响外植体再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质研究报道较少 ②温度适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量增加。 ③pH 通常使用的pH值范围是5.5—6.5。pH在4.0以下或者7.0以上培养物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化；高压灭菌引起pH值变化 ④气体生长量与气体含量关系呈现倒“V”形，折点处的气体含量对应最大生长量

细胞培养板的选择和使用

细胞培养板的选择和使用（四）点击次数：1678 作者：clearair00 发表于：2008-07-23 10:32转载请注明来自丁香园来源：丁香园（一）培养板的清洗和消毒培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作? 答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：）我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板

子，也不是很贵。我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。 1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。 2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。 (二)方法讨论

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。二、常用细胞的种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15:猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela :人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero细胞 TK-143:人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9 :昆虫细胞三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21 (baby hamster kidney )细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV

四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3 x 105个/ml 2）p H范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度哺乳动物细胞一般为37C 昆虫细胞28-30 C 五、常用细胞分散剂与作用原理 1 、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA :与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。六、营养液 1 、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1 ）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活30min 3）血清的作用

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃ 第二天

高中生物选修三专题二细胞工程知识点总结归纳和答案

植物细胞工程和动物细胞工程默写 1、细胞工程是在或的操作 2、细胞工程按操作对象分为和 3、植物细胞工程通常采用的技术手段是：和 4、植物组织培养的理论基础是： 5、理论上每一个活细胞都应该具有。因为 6、受精卵的全能性最高，受精卵生殖细胞体细胞 7、为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？ 8、植物组织培养的外界条件：，内在原理是： 9、植物组织培养的过程：经过形成经由过程形成，最后移栽发育成。 10、是指已分化细胞经诱导，失去其特有的结构和功能而变为未分化细胞的过程。 11、是指由外植体长出来高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。 12、植物体细胞杂交的意义（优势）：。 13、去除细胞壁的常用方法：（纤维素酶、果胶酶等） 14、人工诱导原生质体融合方法：物理法：等；化学法： 15、融合完成的标志是： 16、植物体细胞杂交过程包括：和。 17、植物体细胞杂交的原理是：和 18、人工种子的特点是： 19、作物脱毒(1)材料: (2)脱毒苗: 20、单倍体育种：(1)方法: (2)优点: ; 21、动物细胞工程常用的技术手段： (基础)、、、

22、动物细胞培养的原理是：。 23、用处理，一段时间后获得单个细胞。 24、细胞贴壁： 25、细胞的接触抑制： 26、原代培养：，培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。将原代细胞从培养瓶中取出，用处理后配制成，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为 27、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为 28、细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。 29、动物细胞培养的条件：1. 2. 3. （培养液的Ph为7.2-7.4）4. 30、细胞所需营养：等，按种类和所需数量严格配制而成的合成培养基。培养基内还需加入、等天然成分 31、动物细胞培养所需的气体环境：95%的空气和5%的二氧化碳的混合气体。氧气：；二氧化碳： 32、植物组织培养和动物细胞培养的比较：

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒令狐采学一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env 基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，

4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃ 第二天 1、配管 A+B混合室温静置20min

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

第19卷第2期江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立汪河海1　刘红林2　范必勤1　钟　卉3　丁家桐4 (1　江苏农科院牧医所,南京　210014;2　南京农业大学动物科技学院,南京　210059;3　南京铁道医学院,南京　210009;4　扬州大学农学院动物科学系　225009) 摘要通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1　材料和方法 111　动物准备选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112　溶液的配制按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113　胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α

细胞组织培养重点

体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养 Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养：培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法体内外细胞分化的差异： “反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）。生存条件改变使分化阻抑。脱分化或去分化：细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失去储存肝糖原能力）。是基因突变所致培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。组织培养细胞生命期：原代培养期传代期衰退期细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群冻存配方：向培养液中加入DMSO或甘油，封与安瓶，存于温度达-196℃液氮中长期储存连续细胞系：获得持久性增殖能力的细胞群体。细胞获得永生性或称为恶性性，而获得不死性的细胞核型大多变成异倍体，接触抑制消失 “一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段：潜伏期：接种——经过——悬浮期（细胞质回缩，胞体呈球形）——贴壁初代培养细胞经过10~24h或更多连续细胞系和癌细胞系经过10~30min 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。停滞期/平顶期：细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平。特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH 降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。接触抑制：细胞相互接触抑制细胞运动的现象。肿瘤细胞没有此现象

3D细胞培养和试验系统

简介哺乳动物细胞培养作为一个无价的细胞生物学工具已有几十年。生长在扁平和僵硬的二维(2D)底物(如聚苯乙烯或玻璃)上的单层贴壁细胞已成为传统细胞培养系统的中流砥柱。二维细胞培养的研究在扩宽我们对发育生物学、组织形态发生、疾病机制、药物发现、大批量蛋白生产、组织工程和再生医学方面的知识方面扮演了至关重要的角色。与此同时，随着2D培养系统而来的缺陷也显现了出来，尤其是其不能模拟体内环境以提供生理相关的数据。在体内，几乎所有组织的细胞都处在由一个复杂三维(3D)结构的细胞外基质(ECM)中，它们和相邻的细胞通过生化和机械关系产生着相互作用1。细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用构建成了一个用于维持组织特异性和稳态的3D通讯网络2。细胞生命周期的关键事件通过受到周边细胞微环境的控制3。2D培养试验中，细胞无法实现类似于体内的结构组织和连接，这使得细胞形态、存活力、增值能力、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及一般的细胞功能受到了限制或减弱。 2D 培养的限制对临床前基于细胞的药物和毒性筛选试验的可预测性造成了影响。超过90&的药物通过了体外临床前研究，却在随后的临床实验中未能达到预期的疗效或安全范围4。癌症药物的失败率更高 5, 12，因为2D培养系统常常无法构建有效的肿瘤生物学模型6,7。而且，在使用2D模型进行临床前药物研发时，生物利用率和毒物学的研究严重依赖于动物模型的使用。这一高失败率表明动物模型可能并不适用和/或并非人用治疗方案安全性评测的代表4,16,17。为了克服这些短板，大量的3D细胞培养模型在近20年被开发了出来。由于3D模型显著促进了癌生物学、组织工程和再生医学的研究，又得到了进一步的发展。为此，细胞生物学家们、材料科学家们、生物医学工程师们以及其他开发更有用的模拟体内环境的3D模型来缩短2D培养与活体组织间差距的人，携手参与了多学科的研究。越来越多的证据表明，3D培养建立起来的生理细胞-细胞与细胞-细胞外基质相互作用可以模拟天然组织的特异性，并且比传统2D培养的生理相关性更强8-10。这在干细胞培养和分化、癌生物学、药物和毒性筛选及组织工程中显得尤为突出。 Suparna Sanyal, Ph.D.3D细胞培养和试验系统综述文章

贴壁细胞培养实验讲义

贴壁细胞培养技术课讲义一、克隆形成及克隆形成抑制试验克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。平板克隆形成实验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 1.准备所需试剂及物品： ①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组） ②PBS ③0.25%胰酶 ④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司）， 100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。 ⑤甲醇：冰醋酸（3:1） ⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可） ⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等 ⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC7901 2.操作：实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。第一天： ?制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。具体操作如下： ①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。

高中生物选修3细胞工程知识点

细胞工程植物细胞工程) 1.细胞工程 (1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。 (2)目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。 2.植物细胞的全能性 (1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。 (2)原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。 (3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。 3.植物组织培养技术 (1)原理：植物细胞具有全能性。 (2)过程： 4.植物体细胞杂交技术 (1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 (2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。 (3)过程 (4)意义：克服不同种生物远缘杂交的不亲和性。 5.植物细胞工程的实际应用 (1)植物繁殖的新途径 ①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。 ②作物脱毒技术：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗的技术。 ③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。 (2)作物新品种的培育 ①单倍体育种 a.实质：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。 b.流程：花药单倍体幼苗纯合子。 c.优点：后代不发生性状分离，都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短了育种年限。 ②突变体的利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。 (3)细胞产物的工厂化生产 1.植物组织培养的关键 (1)条件：离体，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。 (2)培养基状态：固体培养基(需再分化生根培养基及生芽培养基)