琥珀酸对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响

第46卷第！期2017年11月发酵科技通讯Bulletin of Fermentation Science and TechnologyVol. 46 No. 4Nov. 2017琥珀酸对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响刘镇瑜，蔡萌萌，刘子强，徐庆阳%""(1.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457&.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457;3.天津科技大学生物工程学院，天津300457)摘要：以色氣酸生产菌co/f T R T H为出发菌株，在30L发酵罐上进行实验，在发酵10 h后随糖外源流加1g/L的琥6酸，以降低代谢抑制物质的积累量，提高L-色氨酸的产量.实验结 果显示：外源流加1g/L的琥6酸发酵与未流加琥6酸发酵相比，菌体生物量与L-色氨酸产量分 别提高了 5.4%和10.0%，乙酸积累量下降了 9.5%，糖酸转化率提高了 4.0%.这表明外源流加1 g/L琥珀酸发酵可以提高L-色氨酸的产量，降低乙酸的积累量，提高糖酸转化率.关键词：L-色氨酸；琥珀酸；乙酸；糖酸转化率中图分类号：T Q922 文献标志码：A文章编号：1674-2214(2017)04-0238-05T h e effect of succinic acid o n the f e r m e n t a t i o n ofL-t r y p t o p h a n b y E s c h e r i c h i a c o l iL I U Z h e n y u1，2,3, C A I M e n g m e n g1，2,3, LIUZiqiang1，2,3, X U Q i n g y a n g1，2,3(1. National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457，China；2. Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China；3. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)Abstract%Escherichia coli T R T H was taken as the starting strain for tryptophan production.The succinic acid was added with glucose after 10 h fermentation in the 30 L fermenter to reduce the accumulation of metabolic inhibitors and increase the L-tryptophan yield.W h e n 1 g/L succinic acid was added, the biomass, L-tryptophan production and glucose conversion rate were increased by 5.4%, 9.98% and 4%respectively ,while the accumulation of acetic acid was decreased by 9. 5%. The results suggests that the addition of 1g/L succinic acid can increase the production of L-tryptophan, reduce the accumulation of the acetic acid and improve the glucose conversion rate.Keywords% L-tryptophan； succinic acid； acetic acid； glucose conversion rateL-色氨酸是一种芳香族氨基酸，广泛应用于食 品、医药与卫生等行业[1]. L-色氨酸作为人体所必需 的八种氨基酸之一，在生物体的生理生化、代谢等方 面有着重要作用[2]. L-色氨酸的生产方法主要包括酶法、微生物转化法与微生物发酵法[3].其中微生物 发酵法由于具有材料来源广泛、价格低廉等优势而得到大规模的工业化应用[4].微生物发酵法的研究 主要集中在菌种改造以及发酵过程控制优化等方面[58].截至目前，通过菌种改造与发酵过程控制优化等手段，L-色氨酸的产量可以达到54. 5g/L)].发酵法生产L-色氨酸常用的菌株包括大肠杆菌与谷氨酸棒状杆菌，由于大肠杆菌具有发酵周期短、易收稿日期=2017-07-03基金项目：天津市科技支撑计划重点项目（14ZCZDSY00015);天津市科技特派员项目（15JCTPJC57000)作者简介:刘镇瑜（1990—），男，河南安阳人，硕士研究生，研究方向为代谢控制发酵，E-mail: 1905302718@qq. com.通信作者：徐庆阳副研究员，E-mail: xuqingyang@tust. edu. cn.第！期刘镇瑜，等：琥珀酸对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响•239 •培养，并能实现基因的高效表达等特性，因此是目前 工业化生产的常用菌株[1°].大肠杆菌发酵法生产L-色氨酸的过程中，乙酸一直是抑制产色氨酸的主要因素[11].为了减少发酵过程中乙酸的积累量，提高色氨酸的产量，可 对发酵培养基的成分进行优化，或者结合菌体的代谢特性，在发酵过程中流加一定的物质，从而达 到减缓乙酸的积累量、提高色氨酸产量的目的.有研究报道，枯草芽孢杆菌连续发酵时，葡萄糖与柠檬酸联合应用会减弱E M P途径，阻遏有机酸的生物合成[12]，依据大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的代谢流分布，添加的硫酸盐质量浓度达到8g/L时会 降低大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的生物转化率，而添加！ g/L的磷酸二氢钾会显著地提高L-色氨 酸合成的代谢流[13].在菌体的生物代谢过程中，琥 珀酸作为T C A循环的中间代谢产物，广泛存在于动物、植物以及微生物中[1415].在微生物代谢过程中，微生物利用葡萄糖合成琥珀酸可以为菌体的生长提供所需要的能量以及其他生物大分子前体物，并且琥珀酸还是T C A循环的中间代谢产物，在代谢过程中可以补充能量损耗[16].因此笔者研究了外源添加一定量的琥珀酸对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸过程中菌体生物量、L-色氨酸产量、乙酸积累量与糖酸转化率的影响.1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1 菌株f^c/ieric/w'acoZi T R T H菌株由天津科技大学工业微生物菌种保藏室提供.1.1.2 培养基活化斜面培养基:葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2. 5 g/L，琼脂条 20 g/L，p H 7.0"7. 2,121 °C 灭菌 20 min.种子培养基:葡萄糖30 g/L，酵母粉3 g/L，柠檬 酸 1.6g/L，（N H4)2S04 3 g/L，K2H P045. 6 g/L，FeS04 • 7H20 2. 8 m g/L，M g S04• 7H20 1. 6g/L，V B11.3m g/L，V H0.3m g/L，115 °C灭菌 15min.发酵培养基:葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，柠 檬酸 1g/L，琥珀酸1g/L，（N H4)2S045g/L，K2H P04 7.5 g/L，FeS04 • 7H20 70 m g/L，M n S04 •H2010m g/L，M g S04 • 7H z02g/L，氯化胆碱 0.5g/L，V B12m g/L，V H0.5m g/L，微量元素 1ml/L，115°C 灭15 min微量元素溶液成分：钼酸铵0. 28m g/L，硼酸 5 m g/L,CoCl2• 6H20 1. 4 m g/L,C u S04•7H20 0. 5 m g/L,Z n S04 • 7H20 0. 6 m g/L.1<仪器与设备5L和30L自动控制发酵罐，上海保兴生物设 备公司&亘温培养箱，杭州汇尔仪器设备有限公司；氨基酸色谱分析仪器，美国Laballiance设备公司；752分光光度计，上海分析仪器厂；T G L-16G台式 高速离心机，上海医用分析仪器厂；生物传感分析仪，山东科学院生物研究所.1.3方法1.3. 1斜面活化培养取斜面菌种划线接种于250 m L茄形瓶中，然后将 活化斜面放置于36C恒温培养箱中培养16"20 81.3.2 5L罐种子培养取200 m L灭菌后的无菌水倒于250 m L茄形 瓶中并用接种针将菌体悬浮，采用火焰接种的方式将 菌体悬浮液接种于5L种子罐中.培养温度为36C，通过自动流加25V的氨水保持p H在7. 0[17].种子 培养过程保持溶氧水平在30%.培养12h后至种子 〇D6。

接近于15,准备接人发酵罐.1.3.3 30 L罐发酵培养以15%的接种量将种子液接种于装有发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵.维持溶氧水平在20%〜30%.通过自动流加25%的氨水维持p H在 7.0，以泡敌消泡.培养过程中待初始葡萄糖消耗完毕时，以一定的速率流加葡萄糖，发酵过程中每隔2h取样测定，在发酵10h后开始随糖流加1g/L 的酸1.3.4 p H值测定采用p H电极与p H6.4〜8. 0精密p H试纸测定。

1.3.5 溶氧水平测定采 电实 时 发 酵 的量。

通过调节搅拌转速与通气量维持发酵过程中的 溶氧水平在20%"30%。

1.3.6 菌体生物量测定取10m L发酵液，8 000 r/m i n离心5 m i n,用 蒸馏水洗涤离心两次，105 C烘干至恒重。

用电子 分析天平称重。

1.3.7葡萄糖浓度的测定采用S B A-40C(山东科学院生物研究所）生物 传感仪测定。

先吸取标准葡萄糖乳酸样液25 &L进 样标定，直至标定结朿，取发酵液1m L离心，取上 清液10 &L，稀释100倍后，取25 &L稀释液进样直 接读数。

• 240 •发酵科技通讯第46卷51015 20 253035时间/h(a )菌体生物量0 5 10 15 20 25 30 35时间/h(b )菌体比生长速率图1琥珀酸对菌体生物量与比生长速率的影响Fig. 1Effect of succinic acid on biom a s s and s pe­cific growth rate2.2琥珀酸对L -色氨酸质量浓度和比产酸速率的影响在发酵10h 后随糖流加l g /L 的琥珀酸对L -色氨酸质量浓度与比产酸 的影响如图2所示.由图2可知：外源流加l g /L 的琥珀酸使L -色氨酸的质度了一定程度的$加J酸发酵相比，流加琥珀酸后L -色氨酸的质量浓度由 36.1g/L 提高到39.7g /L ，提高了 10.0%，比产酸定程度的.L -色氨酸质量浓度的要是由体生物量的增长与抑制性代谢副产物乙酸 的下降.L -色氨酸作为细胞代谢产生的初级代谢产物，其产量的高低 体生物量浓度有着 关系.由源流加酸了 T C A循环的代谢 ，减少了需要乙酸合成途径来填补菌体对A T P 和N A D H 的能量需求，从而降低了乙酸的.抑制性代谢副产物乙酸；量的减少以及菌体生物量的增加使得L -色氨酸的产定程度的.T C A 循环能力 步加强，菌体能充足，使得发酵过程体的比生长相对的水平.60 rI1. 3. 8 L -色氨酸质量浓度的测定L -色氨酸质 度采用高效液相色谱法与比色法定。