用于Real-time PCR检测的牛肉组织DNA提取方法探索
PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源_孙艳华
目前，市场上经过加工的熟肉制品质量难以鉴
基金项目：北京市自然科学基金（6092011） 作者简介：孙艳华（1972—），女（汉），副教授，在职博士研究生，研究 方向：生物检测。 * 通讯作者:乔建军（1973—），男（汉），副教授，博士后，研究方向：生 物制药。
定，国家及地方各级质监部门急需要一种分析食品中 的肉类来源的方法能够快速，有效的对肉类来源进行 检测。分析食品中的肉类来源的方法主要有两种：应用 抗 体 特 异 性 的 ELISA 法 和 基 于 核 酸 特 异 性 的 PCR 法 [3-4]。由于肉制品加工过程中蛋白质容易变性，导致 ELISA 法鉴定肉类来源的稳定性和可靠性较差。而在 食品加工过程中，部分 DNA 不会被破坏，所以利用 PCR 方法检测食物中肉类成分是切实可行的方法，该 法可以不受肉类高温加工的影响。另外，PCR 法具有 特异性强、操作简单、灵敏度高的特点，建立的方法由 于成本低，也易于快速推广[5]。
检测分析
食品中动物源成分牛肉成分PCR鉴别实验标准操作程序
食品中动物源成分牛肉成分PCR鉴别实验标准操作程序1 目的：保证食品中动物源成分牛肉成分PCR检测结果准确、可靠。
2 适应范围：食品中动物源牛肉成分PCR定性，样本类型生、熟肉制品。
3 试剂、耗材来源：商品试剂盒，PCR专用耗材；质控物：ddHO做空白,阴性、阳性对照来源于试剂盒。
24 仪器：BIO-RAD T-100 PCR仪；BIO-RAD电泳装置；BIO-RAD凝胶分析成像系统；生物安全柜；高速离心机(≤16,000g)；微量移液枪(0.5-10μL、10-20μL、20-200μL、1000μL)；5 标准操作:5.1样本的处理：取样应尽量采取肌肉组织。
对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。
采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织捣碎机中进行均质成糜状，充分混匀。
取适量充分混匀的样品，放入研钵中，液氮研磨。
研磨时应间断加入液氮以防止材料融化5.2试剂配制0.5xTBE:取10ML50x的TBE加灭菌超纯水稀释至1000ML，摇匀备用。
DNA提取、PCR反应体系、上样缓冲液等试剂均为商品试剂5.3、DNA提取DNA提取试剂盒操作标准说明a.取20-50㎎动物组织，液氮研磨成细分，转入有180μL组织裂解液的1.5ml离心管。
大口径枪头吹打混匀。
b.加入20μ蛋白酶K（20㎎/ml）立即漩涡混匀，c.55℃水浴3小时或至组织完全消化，期间轻柔振荡几次帮助裂解。
加入20μL RNase A(25㎎/ml)溶液去除RNA。
d.用一个1ml不带针头的一次性注射器抽打裂解物2-3次。
e.加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，立即漩涡混匀。
f.13，000rpm离心5分钟，将上清转入吸附柱AC中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
g.加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。
h.加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃废液。
用于牛肉掺杂肉成分检测的荧光PCR方法研究
·48· 食品安全导刊 2021年6月
该方法可有效检测出同等质量下三种肉 以牛源性、猪源性、鸭源性基因为靶基 两次实验均值，即牛 d 为 932.42，猪 d
质的 DNA 浓度差异、质量百分比，且 因，设置特异性引物与探针 [1]。
为 156.24，鸭 d 为 11.53。
误差不超过 5%，通过该检测方式的应 用，可对牛肉中掺杂肉成分进行准确有 效检测。
材料与方法
试剂与设备 本实验主要试剂为动 物基因 DNA 提取试剂盒、Tap DNA 聚 合酶、分析纯、引物和探针合成、人 工全基因合成、无水乙醇。仪器为荧光 PCR 仪、高速冷冻离心机、绞肉机、电 泳系统、恒温混匀仪、电子天平。
实验方法 （1）样本制备。本实验采用牛肉、 猪肉和鸭肉，按照不同比例制备样品； （2）DNA 提取。选择 50g 动物肌 肉样本，用绞肉机搅碎后，先将样本选 取特定量放入 2ml 离心管内，将 3.8μL 蛋白酶 K 溶液放入混均仪中，温度设定 66℃，时间为 60min，间隔 15min 取出 颠倒混匀后取出；提炼样本中的上清液， 将其提炼出后沉淀晾干，加入 49μL 超 纯水使其完全溶解，放入 -18℃冰箱内 存储备用。 （3）荧光 PCR 检测。PCR 反应体 系为 35μL，循环参数设置为 95℃，变
实验结果
特异 为检验该实验中设计引物的 特异性，以猪、鸭、牛的 DNA 为模板， 利用引物和探针扩增样本。根据实验结 果可知，牛源性基因特异性引物和探针 与其他物种的 DNA 没有反应，仅与牛 DNA 产生扩散曲线；猪源性基因特异 性与其他 DNA 无反应，仅与猪 DNA 产 生扩散曲线；鸭源性基因特异性与其他 DNA 无反应，仅与鸭 DNA 产生扩散曲线。 由此可见，该实验中引物与采用荧光 PCR 检测五 个样本中不同动物源性成分质量比值含 量，分别从样本中选取 0.04g 样品进行 PCR 检测，获得质量百分比结果如下。 样品一：牛肉质量 0.36，猪肉 0.004， 实际检测质量比值为 87.9% 与 12.1%； 样品二：牛肉质量 0.028，鸭肉 0.012， 实际检测质量比值为 68.2% 与 31.8%； 样品三：牛肉质量 0.026，猪肉 0.014，实 际检测质量比值为 63.5% 与 36.5%；可见， 采用 PCR 检测法可准确测出全部样本中 掺入的猪肉与鸭肉，且比值误差不超过 5%，与掺杂肉成分检测需求相符合。
牛肉检测程序方案
牛肉检测程序方案子标题1：引言牛肉是一种常见的肉类食品，但由于某些原因，如商品混淆、食品安全等问题，对牛肉的准确检测变得十分重要。
本文将介绍一种牛肉检测程序方案，能够帮助快速而准确地检测牛肉的真实性。
子标题2：方案概述该方案基于分子生物学技术，通过检测牛肉中特定的DNA序列来判断其真实性。
下面将详细介绍该方案的步骤和所需设备。
子标题3：步骤步骤1：样品准备•从市场或供应商处取得牛肉样品。
•将样品切碎或搅拌，以便充分混合。
步骤2：DNA提取•使用商业化的DNA提取试剂盒，按照说明书的指导进行操作。
•加入样品到提取试剂盒中，进行细胞破碎和DNA释放。
•根据试剂盒的说明书，进行后续的离心、洗涤和洗脱步骤。
•分析提取得到的DNA的浓度和纯度，确保可用于后续的PCR反应。
步骤3：PCR反应•准备PCR反应体系，包括PCR引物、DNA模板、核酸酶、缓冲液和酶切缓冲液等试剂。
•在PCR反应管中按照以下顺序加入试剂：酶切缓冲液、DNA模板、PCR引物、核酸酶、缓冲液和水。
•使用PCR仪进行PCR反应，设置适当的温度和时间，以放大目标基因片段。
步骤4：凝胶电泳•准备凝胶电泳仪及所需试剂：琼脂糖、TAE缓冲液等。
•根据所放大的基因片段大小，选择合适的琼脂糖浓度和电泳条件。
•将PCR产物与DNA分子量标准一同加载到凝胶槽中。
•开始电泳，设置适当的电压和时间。
•观察凝胶结果，根据目标基因片段的大小确定牛肉的真实性。
步骤5：数据分析•根据凝胶电泳结果，分析每个样品中目标基因片段的存在与否。
•将结果与已知的牛肉DNA样品对照进行比较。
•判断样品中是否存在目标基因片段，从而确定牛肉的真实性。
子标题4：所需设备•样品切割器或搅拌器•DNA提取试剂盒•离心机•PCR仪•凝胶电泳仪•电源电缆和连接线•电泳槽和凝胶模具•加热器和恒温水槽•数据分析软件子标题5：总结牛肉检测程序方案基于分子生物学技术，能够快速而准确地检测牛肉的真实性。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性PCR法是一种分子生物学技术，可用于检测食品中的肉源性。
它可检测DNA的存在和数量，因此可以用于确定食品中的肉源。
在本文中，我们将探讨如何利用PCR法检测熟牛肉的肉源性，以及其在食品安全监管中的重要性。
熟牛肉是一种常见的食品，其质量和安全性对人们的健康至关重要。
近年来，一些食品安全事件引起了人们对熟牛肉的担忧。
一些不法商家可能在熟牛肉中添加不合格或假冒的肉类成分，从而危害消费者的健康。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性成为了保障食品安全的重要手段。
PCR法的原理是通过特定的引物扩增目标DNA序列，然后利用凝胶电泳等方法对扩增产物进行鉴定。
对于熟牛肉的肉源性检测，可以设计特异的引物用于扩增特定物种的DNA序列，然后通过PCR扩增和鉴定的方法来确定熟牛肉中的肉源。
为了利用PCR法检测熟牛肉的肉源性，需要选取合适的DNA标记。
DNA标记是特定物种DNA序列的片段，可以用作PCR扩增的靶标。
通常选择的DNA标记包括线粒体DNA和线粒体基因。
需要设计特异的引物用于PCR扩增。
引物是用于扩增目标DNA序列的短链DNA分子，必须与目标DNA序列的两端互补配对。
通过特异的引物设计，可以确保只有目标物种的DNA序列被扩增，从而实现对熟牛肉的肉源性检测。
进行数据分析和结果判定。
对PCR扩增实验得到的数据进行分析，确定熟牛肉的肉源。
若结果显示熟牛肉中含有其他物种的DNA序列，则可以判定熟牛肉存在肉源混杂或假冒的情况。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性具有许多优点。
PCR法具有高灵敏度和特异性，可以有效地检测食品中极微量的DNA序列。
PCR法的操作简单、快捷，可以在短时间内得到结果。
PCR法能够同时检测多个目标物种的DNA序列，可以应用于多种食品的肉源性检测。
利用PCR法检测熟牛肉的肉源性对于保障食品安全具有重要意义。
通过PCR法的应用，可以有效地检测熟牛肉中的肉源，避免食品中的肉源混杂或假冒现象发生，保障消费者的健康。
组织dna提取实验步骤
组织dna提取实验步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述DNA提取实验是分子生物学中一项重要的实验操作，通过该实验可以从细胞或组织中提取出DNA分子，为后续的分子生物学研究提供基础材料。
DNA的提取可以应用于许多领域，如基因检测、遗传学研究以及犯罪调查等。
DNA提取实验通常包括几个关键步骤，包括实验准备、样品收集、细胞破碎和DNA提取步骤。
在实验准备阶段，我们需要准备所需的试剂、器材和实验条件等。
样品收集要求从既定的细胞或组织样品中采集到足够的细胞数量以及完整的DNA。
细胞破碎是为了破坏细胞膜，使DNA释放出来。
最后，通过一系列的化学处理和离心等步骤，可以得到纯净的DNA 样品。
DNA提取实验的成功与否对后续实验的结果具有重要影响，因此实验步骤的正确和严谨非常重要。
本文将详细介绍DNA提取实验的步骤及其操作要点，并对实验结果进行分析和讨论。
通过本实验的学习和掌握，读者将能够熟练进行DNA提取实验，并为科研工作和应用研究提供有力的支持。
总之，本文旨在介绍DNA提取实验的步骤和操作要点，帮助读者了解和掌握该实验的基本原理和操作流程，同时也展望了进一步的研究方向。
通过本文的学习，相信读者将能够更好地应用这一技术，为科研工作和生物学领域的发展做出贡献。
文章结构部分的内容如下:1.2 文章结构本文将按照以下结构进行撰写：1. 引言：首先对DNA提取实验的背景和意义进行概述，介绍该实验在生物学研究中的重要性和应用领域。
2. 正文：详细介绍组织DNA提取实验的步骤及各个步骤的操作方法和注意事项。
正文将包括以下几个部分：2.1 实验准备：介绍进行实验所需的器材和试剂准备工作，确保实验的顺利进行。
2.2 样品收集：说明如何选择合适的生物组织样品，并介绍收集样品的方法和注意事项。
2.3 细胞破碎：详细介绍如何破碎细胞以释放DNA，并介绍各种细胞破碎方法的选择和操作步骤。
2.4 DNA提取步骤：逐步介绍DNA提取的各个步骤，包括细胞裂解、蛋白质酶处理、DNA沉淀、洗涤和溶解等过程，重点强调每个步骤的关键操作和注意事项。
realtime pcr操作流程
realtime pcr操作流程英文回答：Real-time PCR, also known as quantitative PCR (qPCR), is a widely used technique in molecular biology to detect and quantify DNA or RNA molecules. It is a sensitive and accurate method that allows researchers to measure gene expression levels, identify genetic variations, and detect pathogens.The general workflow of a real-time PCR experiment involves several steps:1. Sample preparation: This step involves extracting DNA or RNA from the sample of interest. Various methods can be used for sample preparation, such as phenol-chloroform extraction, column-based purification kits, or automated extraction systems. The quality and purity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of the PCR reaction.2. Primer design: Primers are short DNA sequences that specifically bind to the target DNA or RNA region of interest. They are designed using bioinformatics tools and should have high specificity and minimal secondary structures. The forward and reverse primers are designed to flank the target sequence, and ideally, they should have similar melting temperatures.3. Reaction setup: The PCR reaction mixture is prepared by combining the extracted nucleic acids, primers, a DNA polymerase enzyme, and a fluorescent dye or probe. The reaction mixture is typically prepared in a PCR tube or plate. It is important to maintain proper aseptic techniques to prevent contamination.4. Thermal cycling: The PCR reaction goes through a series of temperature cycles in a thermal cycler machine. These cycles typically include denaturation, annealing, and extension steps. The denaturation step separates the DNA double strands, the annealing step allows the primers to bind to the target sequence, and the extension stepsynthesizes new DNA strands using the primers as templates. The number of cycles depends on the initial amount oftarget nucleic acid and the desired level of amplification.5. Data collection and analysis: Real-time PCR instruments monitor the fluorescence emitted by the fluorescent dye or probe during each cycle. The fluorescence signal increases proportionally to the amount of amplified DNA or RNA. The data can be plotted in a graph called the amplification curve, which shows the exponential growth of the target sequence. The threshold cycle (Ct) value, which represents the cycle number at which the fluorescence signal crosses a predetermined threshold, is used to quantify the initial amount of target nucleic acid.Real-time PCR is a versatile technique that can be adapted to various applications, including gene expression analysis, pathogen detection, and genetic testing. Itoffers high sensitivity, specificity, and quantification accuracy, making it an essential tool in molecular biology research and diagnostic laboratories.中文回答：实时荧光定量PCR（real-time PCR），也被称为定量PCR （qPCR），是分子生物学中广泛使用的一种技术，用于检测和定量DNA或RNA分子。
Real-Time_PCR实验流程
Real-Time_PCR实验流程一、RNA 的提取详见 RNA 提取及反转录不同组织样本的 RNA 提取适用不同的提取方法，因为 Real-Time PCR 对 RNA 样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止 RNA的降解，保持 RNA 的完整性。
在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；取 2ug 进行 RNA 的甲醛变性胶电泳检测，如果存在 DNA 污染时，要用 DNase I 进行消化（因为在处理过程中 RNA 极易降解，建议体系中加入适量 RNA 酶抑制剂）。
二、DNase I 消化样品 RNA 中的 DNA用 DNase I 消化 DNA组份加量模板RNA 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC 处理 H2O 至 100ul混匀，37℃ 90min三、RNA 琼脂糖凝胶电泳1．1的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1)称取琼脂糖 0.45g 放入三角瓶中，向其中加入 4.5ml 的10×MOPS 缓冲液和 39.5ml 的DEPC 水，放微波炉里溶化。
2)待冷却到 60 摄氏度左右时，加入 1ml 甲醛，摇匀（避免产生气泡）。
倒入凝胶板上凝固 30min。
2．取各个 RNA 样品 4l，加入6×RNA 电泳上样缓冲液 2l 混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V 电压下电泳 25min。
用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA 电泳结果如下图所示。
可见 28S 和 18S 两条明亮条带，无 DNA 条带污染。
四．RNA 反转录为 cDNA反转录程序以 MBI 的 M-MLV 为例组份加量20ul 体系加量40ul 体系模板RNA 0.12.5ug 3ug根据条带的亮度适当调整引物 T1850uM或其他引物 2.0ul 4.0ulDEPC 处理 H2O 至 12.5ul 至25ul混匀，70℃ 5min，立即冰浴5buffer 4.0ul 8.0uldNTP10mM 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃ 5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃ 60mi n ，70℃ 10min反转录引物的选择与 Real-Time PCR 引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量
实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量作者：谭波杨春萍刘小玲来源：《福建农业科技》2023年第10期摘要：建立一種快速、高效、准确且低成本的肉制品中牛源性成分鉴定及量化检测方法。
以细胞核单拷贝基因bosPDE为目的基因，LcoR为内参基因分别合成引物及探针，优化反应条件，评价该方法的特异性和灵敏度。
采用实时荧光PCR相对定量法，以△Ct值与2△△Ct值线性模型分别建立回归曲线，通过人工模拟混合牛肉样品对方法准确性评估。
结果表明：目的基因bosPDE引物仅对牛肉DNA进行扩增，具有特异性，对牛肉DNA扩增的灵敏度可达0.01 ng·μL-1。
以△Ct值与2△△Ct值为定量指标的回归曲线分别为y=-3.096 5x+8.479 7（R2= 0.998）、y=0.712 2x+3.050 4（R2=0.988 7）。
两个方法检测35%～90%牛肉含量的人工模拟混合牛肉样品的回收率为分别为94.30%～102.52%、98.55%～106.30%。
将两种定量方法进行数均处理，回收率的偏差减少。
本研究建立的实时荧光定量PCR方法能够准确对肉制品中的牛源性成分进行定性，并可用于牛肉掺伪制品中的牛肉相对定量分析，对鉴别肉制品掺假以及量化牛肉制品成分含量具有重要参考价值。
关键词：肉制品；牛源性成分；实时荧光定量PCR；相对定量中图分类号：TS 251.5 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）10-0006-09DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.10.002Detection of the Bovine-derived Materials and Their Contents inMeat Products by Real-time Fluorescence Quantitative PCRTAN Bo1，2， YANG Chun-ping3， LIU Xiao-ling1*（1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004， China;2. Guizhou Research and Application Center of Detection Technology， Guiyang， Guizhou 550014， China;3. Guizhou Institute of Analysis and Testing， Guiyang， Guizhou 550014， China）Abstract： In order to establish a rapid， efficient， accurate and low-cost method for the identification and quantitative detection of the bovine-derived materials in meat products， the primers and probes were synthesized with the single-copy gene of cell nucleus， bosPDE as the target gene and LcoR as the internal reference gene， to optimize the reaction conditions and evaluate the specificity and sensitivity of the method. By using the relative quantitative method of real-time fluorescence PCR， the regression curves were respectively established with the linear model of △Ct value and 2△△Ct value， and the accuracy of the method was evaluated by simulating artificially the mixed beef samples. The results showed that： the bosPDE primer of the target gene only amplified the DNA of beef， which was specific， and the sensitivity of amplification to beef DNA could reach 0.01 ng·μL-1. The regression curves with △Ct value and 2△△Ct value as the quantitative indexes were y=-3.096 5x+8.479 7 （R2=0.998） and y=0.712 2x+3.050 4 （R2=0.988 7）， respectively. The recovery rates of the artificial simulated mixed beef samples with 35%-90% beef content detected by the two methods were 94.30%-102.52% and 98.55%-106.30%， respectively. The deviation of recovery rate was reduced when the number-average treatment was carried out on the two quantitative methods. The real-time fluorescence quantitative PCR method established in this study could accurately characterize the bovine-derived materials in meat products， and could be used for the relative quantitative analysis of beef in the beef adulterated products. It had important reference value for identifying the adulteration of meat products and quantifying the concentrations of components in beef products.Key words： Meat products； Bovine-derived materials； Real-time fluorescence quantitative PCR； Relatively quantitative近年来，随着全球化经济的高速发展，人们的物质需求逐渐提升，各种肉类食品的流通和交易也越来越频繁，这使得一些不法商家为了牟取暴利，以低价肉替代高价肉，导致肉制品掺假事件频繁发生［1-3］。
牛肉中疯牛病特殊风险物质荧光RT-PCR检测方法的建立
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2007,15(5):752~756*基金项目： 国家科技奥运专项 （No.207001000560716)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.研究员,主要从事进出口动物检疫工作和疯牛病研究。
Tel： 861058619200； Fax:861058619201;Email:<magp@>.收稿日期： 20070207接受日期： 20070404·研究论文·牛肉中疯牛病特殊风险物质荧光 RTPCR检测方法的建立*史喜菊, 马贵平 **, 李冰玲, 杨金良, 王 宇,刘旭辉, 李炎鑫, 刘全国（北京出入境检验检疫局， 北京 100026）摘要：建立了检测牛肉中疯牛病特殊风险物质 （主要是中枢神经组织） 标记物胶原纤维酸性蛋白 （ ）mRNA的荧光 RTPCR检测技术。
结果表明，该技术具有良好的种属特异性和组织特异性，只能从牛源和羊源的中枢神经组织中检测到 GFAP， 猪源和禽源检测结果为阴性， 而且只有脑和脊髓等中枢神经组织产生阳性反应， 其它内脏组织以及不同部位牛肉检测 结果均为阴性； 敏感性检测结果表明， 该方法最低检测限达到 0.001%以下； 稳定性试验结果表明， 100 ℃加热处理 30min对检 测结果无明显影响， 中枢神经组织在30 ℃以上室温可以稳定存放 4d， 在 4 ℃可以稳定冷藏 2周， 检测结果仍然为阳性。
所建 立的荧光 RTPCR技术用于牛肉中疯牛病特殊风险物质的检测具有特异性强、 敏感性高、 稳定性好、 快速方便等优点， 适合于 在日常检测工作中推广使用。
关键词：疯牛病;风险物质； 荧光 RTPCR； 牛肉中图分类号:S188 文献标识码: A 文章编号:10061304(2007)05075205Detection of Bovine Central Nervous System Tissue as Bovine SpongiformEncephalopathy Specified Risk Material in Beef by Real Time RTPCRSHI Xiju,MA Guiping**,LI Bingling,YANG Jinliang,WANG Yu,LIU Xuhui， LI Yanxin,LIUQuanguoA real time RTPCR detection of bovine central nervous system tissue (CNS)as bovine spongiform encephalopathy （BSE）specified risk material（SRM）in beef and beef products based on glial fibrillary acidic protein( )mRNA was reported. The results showed that the developed method allowed the detection of CNS tissues from bovine and ovine origins,but not from porcine and avian origins,and that the lowest detection limit was below0.001%bovine brain homogenate,and the mRNA sig nal detection was not affected by100 ℃ heating treatment for30min and long period of storage at over30 ℃ room temperature(RT) for4d and at4 ℃ for15d.It is concluded that real time RTPCR based on mRNA can serve as a sensitive and specific test inroutine inspection and quarantine detection for illegal use of bovine CNS tissues in beef and beefproducts.bovine spongiform encephalopathy；specified risk material； real time RTPCR；beef牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopa thy,BSE)， 俗称疯牛病， 是牛的一种进行性和致死性 神经系统疾病 （Wells .， 1995）。
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用于Real-time PCR检测的牛肉组织DＮA提取方法探索摘要：使用ｃｈｅｌｅｘ－１００提取牛肉组织ｄｎａ，并用紫外分光光度法检测所提取的ｄｎａ浓度和纯度，结果表明所提取的ｄｎａａ２６０ｎｍ / ａ２８０ｎｍ在１．６６２～１．８２６之间，纯度较高。
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ扩增提取的ｄｎａ模板，表现出较高的敏感性。
该ｄｎａ提取方法效率较高，操作简便，能够获得较高质量的ｄｎａ，适合检疫部门的快速检测需要。
关键词：ｄｎａ；提取；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ；牛肉组织ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ of ｂｅｅｆｔｉｓｓｕｅ’s ｄｎａｆｏｒｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｂｓｔｒａｃｔ：ｃｈｅｌｅｘ－１００ｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｄｎａｆｒｏｍｂｅｅｆｔｉｓｓｕｅ．ｔｈｅｄｎａｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｔｈｅｎｔｅｓｔｅｄｂｙｕｖｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔａ２６０ｎｍ/ ａ２８０ｎｍｏｆｄｎａｗａｓ１．６６２～１．８２６．ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｄｎａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄａｎｄａｂｌｅｔｏｏｂｔａｉｎｄｎａｗｉｔｈｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌｔｉｓｓｕｅｂｙｉｎｓｐｅｃｔａｎｄｑｕａｒａｎｔｉｎｅｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｎａ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； rｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ；ｂｅｅｆｔｉｓｓｕｅ肉类食品的安全直接关系到人类的健康，建立准确的动物源性成分检测方法非常重要［１，２］。
实时定量ｐｃｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）将荧光能量传递技术应用于常规ｐｃｒ中，具有高特异性和高灵敏性［３－５］。
提取用于ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ检测的ｄｎａ模板的方法很多，酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提取ｄｎａ最为经典的方法，但不适用于仅有少量提取材料时［６］。
另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康［７］。
玻璃棒缠绕法用盐酸胍裂解细胞，这种方法简单快速，但对操作技术要求较高，盐析法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的ｄｎａ可以满足ｐｃｒ的要求，但产率相对较低［８］。
用ｃｈｅｌｅｘ－１００作为金属离子螯合剂提取ｄｎａ，其原理是细胞在含有ｃｈｅｌｅｘ－１００悬浊液中煮沸时，细胞膜破裂释放出ｄｎａ，同时与二价金属离子螯合，可以避免ｄｎａ在金属离子的催化作用下降解，从而获得纯度较高的ｄｎａ［９，１０］。
本实验采用该法提取牛肉组织ｄｎａ，并将其应用于ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ检测，探索将该方法运用于动物检验检疫的可行性。
１材料与方法１．１材料与仪器４份新鲜牛肉均购自成都市农贸市场；溶液ⅰ（含质量分数２０％的ｃｈｅｌｅｘ－１００）；ｍｇｂ－ｔａｑｍａｎ探针、细胞色素ｂ基因通用引物（引物１：５′－ｔａｃｃａｔｇａｇｇａｃａａａｔａｔｃａｔｔｃｔｇ－３′，引物２：５′－ｃｃｔｃｃｔａｇｔｔｔｇｔｔａｇｇｇａｔｔｇａｔｃｇ－３′）订购自上海基康生物技术有限公司；实验仪器包括高速离心机、荧光定量ｐｃｒ仪、漩涡振荡器、核酸蛋白检测仪、均质仪等。
１．２实验方法１．２．１牛肉组织ｄｎａ的提取方法与步骤称取新鲜牛肉５０ｍｇ，加入５００μｌ生理盐水，漩涡振荡１０ｍｉｎ充分混匀，直至沉淀泛白。
１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清（若离心沉淀为红色，继续混匀后离心）。
在沉淀中加入溶液ⅰ３００μｌ，漩涡振荡１０ｍｉｎ，重新悬浮沉淀。
沸水浴处理１０ｍｉｎ，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液待用，共提取４份牛肉组织样品的ｄｎａ。
１．２．２ｄｎａ的浓度及纯度测定用核酸蛋白检测仪在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ波长下分别测定提取的ｄｎａ样品吸光度，并计算ａ２６０ｎｍ / ａ２８０ｎｍ及ｄｎａ浓度。
１．２．３ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ检测提取的ｄｎａ本实验的ｐｃｒ程序以ａｂｉｐｒｉｓm ７７００ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ为基础建立。
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ反应体系如下：２×ｍａｓｔｅｒｍｉｘ１２．５μｌ，引物１和引物２各１．５μｌ，探针１．５μｌ，分别加入提取的ｄｎａ模板０、１、２、３μｌ，加蒸馏水至２５μｌ。
反应程序为：９５℃预变性１０ｍｉｎ；９５℃变性４５ｓ，５３℃退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，４０个循环［１１］。
反应过程中通过与循环变温加热器相连的ｃｃｄ摄像检测荧光值，ａｂｉｐｒｉｓm ７７００ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ软件分析ｄｎａ扩增曲线。
２结果与分析２．１提取的ｄｎａ浓度和纯度检测结果分光光度法检测结果表明，提取的４份牛肉组织ｄｎａ的ａ２６０ｎｍ / ａ２８０ｎｍ均在１．６６２～１．８２６之间，质量较好（表１）。
２．２ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ扩增结果及检测ｃｔ值即阈值循环数，表示能被仪器明显检测到的荧光值（δｒｎ）到达设定的阈值时所对应的循环数，在扩增曲线上通常表现为进入快速扩增期时的循环数。
每个模板的ｃｔ值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ｃｔ值越小。
以提取的ｄｎａ为模板进行ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ，结果显示加入提取的牛肉组织ｄｎａ样品体积分别为３、２、１μｌ时，得到的ｐｃｒ扩增曲线ｃｔ值递增。
如图１中箭头所示，ｃｔ值与ｄｎａ模板量的相关性较好，ｄｎａ模板量越大，ｃｔ值越低。
说明用此方法提取ｄｎａ，在有效去除ｐｃｒ抑制剂的同时，没有降低ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ的敏感性，也避免了ｐｃｒ反应假阴性结果的出现。
３结论与讨论本实验采用的ｃｈｅｌｅｘ－１００是一种离子螯合剂，由苯乙烯和苯二乙烯组成，其悬浊液在碱性环境（ｐｈ１０～１１）和１００℃的条件下可导致细胞膜的破裂和ｄｎａ的变性并释放出来［１２］。
使用ｃｈｅｌｅｘ－１００提取ｄｎａ时，不用蛋白酶ｋ消化，血红素从血红蛋白中的释放减少，可使获得的ｄｎａ纯度提高。
ｃｈｅｌｅｘ－１００还可以结合金属离子，阻止金属离子对ｄｎａ降解的催化作用。
同时由于ｃｈｅｌｅｘ－１００颗粒可离心去除，不会干扰ｐｃｒ扩增反应体系中的ｍｇ２＋等离子浓度。
此外，借助于ｐｃｒ反应体系中的缓冲液，其碱性也不会影响到ｐｃｒ的扩增反应。
ｃｈｅｌｅｘ－１００提取方法对组织的需求量很少，本实验中５０ｍｇ牛肉组织中提取的ｄｎａ可用于ｐｃｒ扩增的次数大于３００次（１μｌ模板量）。
本方法提取的ｄｎａ适用于ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ扩增，省时快速，可用于动物组织的快速检测。
综上所述，ｃｈｅｌｅｘ－１００快速提取牛肉组织ｄｎａ的方法提取效率较高，实验操作简单，无需贵重仪器和有毒化学物质，能够获得较高质量的ｄｎａ，且适用于ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｃｒ检测，可被应用于动物新鲜组织的ｄｎａ提取。
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