养成细心的习惯

今天，金老师让我们写《口算·心算·速算天天练》，这些题目很简单嘛，我和平常一样飞快地写完了。

妈妈让我认真地检查一遍，我就马马虎虎检查一遍就完事了。妈妈拿过去一改，结果连错3道口算题，妈妈问我怎么回事，我害羞地低下了头。妈妈让我说说为什么会错，我说：“我开始算得就不认真，检查也马马虎虎，所以才会错那么多。”妈妈说：“以后遇到这种问题一定要细心了，审题、做题都要细心，不要掉到题目的陷阱中去了，做完后的检查也是非常重要的。细心的习惯是通过平时的训练慢慢养成的。”

我一定会记住这次教训的，以后做题和检查都要细心了

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生物分离工程答案1

《生物分离工程》练习题一（第1~3章）一、选择题 1、下列物质不属于凝聚剂的有（ C ）。 A、明矾 B、石灰 C、聚丙烯类 D、硫酸亚铁 2、发酵液的预处理方法不包括（C ） A. 加热B絮凝 C.离心 D. 调pH 3、其他条件均相同时，优先选用那种固液分离手段（B ） A. 离心分离B过滤 C. 沉降 D.超滤 4、那种细胞破碎方法适用工业生产（ A ） A. 高压匀浆B超声波破碎 C. 渗透压冲击法 D. 酶解法 5、为加快过滤效果通常使用（ C ） A.电解质B高分子聚合物 C.惰性助滤剂 D.活性助滤剂 6、不能用于固液分离的手段为（ C ） A.离心B过滤 C.超滤 D.双水相萃取 7、下列哪项不属于发酵液的预处理：（ D ） A.加热 B.调pH C.絮凝和凝聚 D.层析 8、能够除去发酵液中钙、镁、铁离子的方法是（ C ） A．过滤B．萃取C．离子交换D．蒸馏 9、从四环素发酵液中去除铁离子,可用（ B ） A．草酸酸化B．加黄血盐C．加硫酸锌D．氨水碱化 10、盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 11、使蛋白质盐析可加入试剂（ D ） A：氯化钠；B：硫酸；C：硝酸汞；D：硫酸铵 12、盐析法纯化酶类是根据（ B ）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 13、盐析操作中，硫酸铵在什么样的情况下不能使用（ B ） A.酸性条件B碱性条件 C.中性条件 D.和溶液酸碱度无关 14、有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为（ D ） A.乙酸乙酯B正丁醇 C.苯 D.丙酮 15、有机溶剂为什么能够沉淀蛋白质（ B ） A.介电常数大B介电常数小 C.中和电荷 D.与蛋白质相互反应 16、蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（ A ）范围内适合。 A. 0.5％～2％B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 17、生物活性物质与金属离子形成难溶性的复合物沉析，然后适用（ C ）去除金属离子。 A. SDS B CTAB C. EDTA D. CPC 18、单宁沉析法制备菠萝蛋白酶实验中，加入1%的单宁于鲜菠萝汁中产生沉淀，属于( D )沉析原理。 A盐析B有机溶剂沉析C等电点沉析D有机酸沉析 19、当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（ C ）

高中生物《微生物的培养和分离实验》教学设计

微生物的培养和分离实验教学设计 ★课题目标（一）知识与技能了解有关培养基的基础知识；掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术（二）过程与方法分析实验思路的确定和形成的原因，分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性，分析差异，增加印象（三）情感、态度与价值观形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神 ★课题重点无菌技术的操作 ★课题难点无菌技术的操作 ★教学方法启发式教学 ★教学工具多媒体课件 ★教学过程（一）引入新课在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。（二）进行新课 1．基础知识 1．1 培养基的种类包括固体培养基和液体培养基等。〖思考1〗琼脂是从红藻中提取的多糖，在配制培养基中用作为凝固剂。

【补充】培养基的类型及其应用： 1．2 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源四类营养成分。〖思考2〗从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？ C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的97％以上。【补充】碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。 1．3 培养基除满足微生物生长的 pH 、特殊营养物质和氧气等要求。【补充】生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供糖、维生素和有机氮等营养物质。〖思考4〗培养乳酸杆菌时需要添加维生素，培养霉菌时需要将培养基pH调节为酸性，培养细菌时需要将pH调节为中性或微碱性。活动2：阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题： 1．4 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。 1．5 无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 1．6 比较消毒和灭菌（填表）

造血细胞分离、集落培养及表型分析

造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。图1 造血系统和造血干细胞分化图 Fig。1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation. 造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。

(整理)微生物的培养和分离选修1答案

微生物的营养和培养（人教版选修1 ）一微生物的实验室培养（p14-20） 1．营养物质供其生长繁殖的营养基质液体培养基固体培养基是否加入琼脂选择培养基鉴别培养基选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长 2．固体培养基菌落种群 3．碳源、氮源、水、无机盐、生长因子。硝酸盐等无机氮源，CO2, 糖类等有机物，N2, CO2, NH3, 糖类等有机物, 硝酸盐等无机氮源以及含氮的有机物。 4． 5.防止外来杂菌入侵，（1）空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子），煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒（酒精擦拭、氯气消毒）、紫外线消毒、石炭酸或煤酚皂溶液消毒等。（2）器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内所有的微生物，包括芽孢和孢子。灼烧灭菌（接种环、接种针等）、干热灭菌（玻璃器皿和金属用具等）、高压蒸汽灭菌等（培养基、培养皿等），高压蒸汽灭菌法。（3）酒精灯火焰，灼烧灭菌，接种环、接种针等 6．3）pH 4）灭菌，高压蒸汽灭菌法5）倒平板，酒精灯火焰，倒置（即皿盖在下，皿底在上），平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 7平板划线和稀释涂布平板法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经过数次划线后培养可以分离得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，接种环 1）操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。图略，见书18页 2）以免接种环温度太高，杀死菌种。 3）划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌，从而在培养基表面形成单个的菌落。三角玻璃刮刀火焰附近。用移液管吸取1ml培养的菌液，注入9ml无菌水，用手指轻压移液管的橡皮头，吹吸3次，充分混匀，这样稀释了101倍，以此类推。 8．颜色、形状、大小等，说明培养基上出现了其他菌，可能是培养基或者接种过程未达到无菌操作。设置空白对照 9．固体斜面培养基，4℃冰箱保存，菌种容易污染或产生变异。甘油管藏法。相关习题

流感病毒分离培养SOP

作业指导书第 1 页共 5 页第1版第1次修订起草人：王军鹏审核人：标题：流感病毒分离培养和鉴定标准操作规程批准人：批准日期：2013年12月18日实施日期：2013年12月18日 1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。 2. MDCK细胞培养程序 2.1 生物安全要求 MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料 2.2.1 生长成片的MDCK细胞 2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶 2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于 -20℃ 2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液 2.2.6 胎牛血清 2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃ 2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V 2.2.9 1mL、10mL无菌移液管 2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 2.3.1 D-MEM培养液的准备 500mL D-MEM液中加入： a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素）。 b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。 c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。 2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。 2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL

海洋中寡营养细菌的分离培养技术及环境适应机制的研究进展

目录 1. 摘要 (1) 2. 前言 (1) 3. 寡营养细菌生态分布 (1) 3.1 寡营养细菌在海洋中的分布 (1) 3.2 寡营养细菌在淡水中的分布 (2) 3.3 寡营养细菌在土壤中的分布 (2) 4. 海洋中微生物的研究概况、现状及发展前景 (2) 4.1海洋微生物的研究概况 (2) 4.2 海洋微生物的现状 (3) 4.3海洋微生物的研究发展前景 (3) 5. 海洋中寡营养细菌的分离纯化 (4) 5.1 传统分离纯化及培养办法........................................... 错误！未定义书签。 5.2 新型的分离培养纯化及培养办法................................. 错误！未定义书签。 6. 寡细菌的适应机制................................................................. 错误！未定义书签。 6.1形态变化.......................................................................... 错误！未定义书签。 6.2附着机制 (6) 6.3能量储存.......................................................................... 错误！未定义书签。 6.4抵抗性增强 (8) 7.总结和展望 (9) 参考文献 (10)

海洋中寡营养细菌的分离培养技术及环境适应机制的研究进展 1.摘要：寡营养细菌的分离、培养及鉴定较困难，并且生长慢，研究周期长，所以在较长一段时间内其研究进展缓慢，但近几年随着生物技术的快速发展及广泛应用，寡营养细菌在生态中的分布及其生态作用引起了生态学家和环境学家的广泛关注，寡营养细菌在生态、环境、能源、公共卫生等领域中的重要性已受到人们重视[3-8]。本文将从寡细菌的分布、分离培养、及环境适应机制等几方面对现有寡细菌的研究做出介绍。 2.前言：寡营养细菌(Oligotrophic bacteria)又称贫营养细菌，是指在寡营养生态环境(如远洋、深海、贫瘠土壤等环境)中生存并定义为第一次培养时能在含碳1～15 mg／L培养基中生长的一类细菌[1]。它们又被分为两类：如不能在富营养培养基上生长，称为专性寡营养（oligate oligotrophic），既能在富营养培养基又能在贫营养培养基上生长被称为兼性寡营养（facultative oligotrophic）。由于还存在一类微生物只能生长在营养丰富的环境中,为了与寡营养微生物有所区别,Poindexte提出了“富营养细菌”(copiotrophicor)一词,指的是能发酵碳水化合物的细菌[2]。寡营养细菌主要生长在有机质贫乏的极端环境中，寡营养细菌生态分布很广,构成了生物圈的大部分,在生物地球化学循环中起关键作用。根据寡营养细菌的培养性可以将其大致划分为4种类型:(1)仅在初次分离时能在营养贫乏的培养基上培养的细菌;(2)初次分离时能在营养贫乏的培养基上培养,然后也能在营养丰富的培养基上培养的细菌;(3)仅在特殊的营养贫乏培养基上生长的细菌;(4)在实验室尚不能培养,但在电子显微镜下能观察到的细菌。 3 寡营养细菌的生态分布 3.1 海洋：在自然界中,绝大多数自然环境都是以贫营养为特征的。浩瀚海洋占地球表面积的71%,研究表明，海水中可溶性有机碳浓度为0.35～70mg／L，颗粒性有机碳浓度为3～10mg／L，有机碳的平均水平相当低，但自然环境中低浓度的

苏教版高中生物选修1-1.1 微生物的分离和培养-教案设计

微生物的分离和培养【教学目标】 1.知识与技能了解微生物的分离和培养发展的历史。 2.过程与方法举例说明微生物的分离和培养的基本过程。 3.情感、态度与价值观：关注与微生物的分离和培养有关的社会问题，培养学生的社会责任感。【教学重难点】重点：了解微生物的分离和培养的意义。难点：了解微生物的分离和培养对于人类生活和社会生产的价值。【教学过程】一、引入微生物种类繁多，在自然界分布广泛，为了深入地研究它们的特性，首先要对其进行分离与培养。掌握无菌操作的技能（如使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌）是进行微生物分离与培养的基础；掌握微生物培养基的配制技术（如配制细菌培养基），学习微生物接种和培养的方法等，是实现微生物分离和培养的必要条件。二、讲授新课 1.微生物的分离和培养的基本过程高压蒸汽灭菌锅实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法。干热灭菌方法是将准备灭菌的物品放在干热灭菌箱内，在160?170℃下加热1 ?2h以达到灭菌的目的。湿热灭菌方法常采用高压蒸汽灭菌锅进行，如手提式高压蒸汽灭菌锅就是实验室常用的灭菌仪器之一。高压蒸汽灭菌锅的使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步骤。加水是指使用前在锅内加入适量的水。加水不可过少，以防将灭菌锅烧干。装锅是指将待灭菌物品放在灭菌桶中（不要装得过满），盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺栓，打开排气阀。加热排气是指加热后，锅内水沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维持2?3min以排出冷空气。如待灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务

必使空气充分排出，然后将排气阀关闭。保温保压是指当气压升至100kPa、温度达到121℃时控制热源，保持压力，维持20-30min后，关闭电源。出锅是指当压力表中指针降至“0”点，并待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，取出灭菌物品。若当压力表指针尚在“0”点以上、温度也在100丈以上时开启排气阀，会因压力骤然降低而造成培养基剧烈沸腾，并冲出管口或瓶口，污染棉塞，以致培养微生物时引起杂菌污染。灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，保持灭菌锅内壁及内胆干燥，盖好锅盖。配制培养基培养基是为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基可以分为天然培养基(采用动植物组织或微生物细胞以及它们的提取物或粗消化物配制而成，如牛肉膏蛋白胨培养基)和合成培养基（由准确称量的分析纯等级别的高纯度化学试剂加蒸馏水配制而成，如葡萄糖铵盐培养基)等类型。天然培养基的主要优点是取材便利、营养丰富、配制简便，缺点是营养成分难以控制、实验结果的重复性较差；合成培养基的优点是化学成分及其含量明确、实验的可重复性好，缺点是配制繁琐、成本较高。各种培养基的配方虽然不同，但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等最基本的物质配制固体培养基时，常常需要在液体培养基中添加一定量的凝固剂。例如，琼脂是较为常用的凝固剂之一，它是从某些藻类中提取出来的一类多糖物质。通常100mL液体培养基中需要加入1.5?2.0g琼脂。在配制培养基时，根据拟培养的微生物的不同需要，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的pH使之满足微生物生长的需要。接种微生物在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种。在接种操作过程中，常用的工具有玻璃涂布器、接种针、接种环等。由于接种方法的不同，采用的接种工具也有区别，如用玻璃涂布器进行涂布平板接种，用接种针进行穿刺接种，用接种环进行斜面接种，或在固体培养基平板上进行划线接种等。 2.微生物的分离和培养在生产和生活中的应用微生物与人类的关系十分密切，如在酒类酿造、食品发酵等传统生产工艺中，

传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化

传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化摘要：采用形态学观察对传统甜面酱中分离得到的米曲霉（Aspergillus oryzae）进行了初步鉴定，并对其培养条件进行了优化。首先，采用单因素试验确定米曲霉在培养时间56 h、湿度90%、曲料温度30 ℃的条件下，霉菌的产酶能力最高；接着采用响应面试验的Box-Behnken设计原理对单因素试验筛选出的显著影响因素进行三因素三水平的分析试验，使用SAS 9.1软件对试验数据进行二次多项式的回归拟合和方差分析，确定其关键影响因素的最终优化值，并且预测蛋白酶和糖化酶的最高酶活。通过响应面试验可知，当培养时间为54 h、曲料湿度为90%、温度为31 ℃时，米曲霉中蛋白酶和糖化酶的酶活总和为1 764.34 U/g，与优化前相比，酶活提高了17.33%。关键词：甜面浆；米曲霉（Aspergillus oryzae）；形态学观察；培养条件；响应面试验传统自然发酵酱的风味远比人工保温发酵产品优良，因为变温发酵过程有利于风味物质的形成[1]。因此对传统甜面酱种曲中的微生物进行分离、纯化和鉴定，筛选优良菌种用于工业化生产，对进一步提高甜面酱质量、改善其风味具有很重要的现实意义。目前，甜面酱的酿制主要采用沪酿3.042，并且甜面酱中主要功能菌株为米曲霉（Aspergillus oryzae）[2]，所以，研究重点对甜面酱种曲中的米霉菌进行分离鉴定和培养条件的优化，为对其进一步研究打下一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料酱样品：于江苏省溧阳市收集的民间酱种曲样品。培养基：菌落分离采用PDA培养基，菌种鉴定采用察氏培养基；霉菌发酵培养基（麸皮培养基）为250 mL三角瓶中加入8 g麸皮、2 g豆粕、10 mL水，于121 ℃灭菌30 min，摇散。仪器设备：LDZX-50FBS型立式蒸汽压力灭菌锅购自上海申安医疗器械厂，数码照相机购自北京华旗资讯科技发展有限公司，SPX-300B生化培养箱购自上海跃进医疗器械厂，AIR TECH超净工作台购自苏净集团安泰公司，LHS-150SC 恒温恒湿箱购自上海齐欣科学仪器有限公司。 1.2 方法 1.2.1 菌种的分离与纯化在无菌条件下将曲捣碎，称取适量样品，选取适宜的稀释度用生理盐水稀释，采用含100 U/mL青霉素的PDA培养基，采用稀释涂布平板法，每个稀释度接种3个平板，放置于30 ℃的培养箱内培养48 h，进行观察，将菌落形态不同的菌种分离，各自传代培养，至少进行3次传代分离，

第三节菌种分离

第三节菌种分离第三节菌种分离菌种分离即是进行蘑菇菌丝的纯化过程，它是制种工作的重要环节，通俗讲是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。蘑菇菌种的分离方法有三种：即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。一、孢子分离法蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。（一）采集孢子１、种菇的选择采集孢子首先要选好种菇即分离用的子实体。一般蘑菇种菇要求是第一潮菇，出菇较早，单生，个体健壮，特征典型的子实体，经过仔细的观察筛选后在菇床上做个记号，让种菇充分生长，直至即将破膜时将菇采摘进行孢子弹射。

２、孢子弹射收集种菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下 1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩（如图所示）。这套孢子收集装置需事先进行高压灭菌消毒。把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20℃的室内,经24-48小时左右，可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并在温度下进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。（二）孢子分离１、多孢分离法即把多个孢接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易，在过去的蘑菇制种中应用较为普遍。（１）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24℃恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约15-20天），挑选萌发快，

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进_李艳琪

中国组织工程研究第18卷第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.360docs.net/doc/b816301379.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进李艳琪1，王洪一2，姚尧2，刘晶晶3，徐潇2，张宇2，刘洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点：在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能，可成为临床研究和应用的细胞来源。关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁主题词：干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术摘要背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到关注。目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行生物学特性分析。结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性，而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts

传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化_黄红霞

湖北农业科学2013年收稿日期：2012－03－23 作者简介：黄红霞（1976－），女，湖北天门人，副教授，主要从事食品生物技术研究，（电话）153********（电子信箱）xiahh0814＠163．com ；通讯作者，李冬生，男，教授，（电话）027－88032319（电子信箱）huang760814＠163．com 。第52卷第2期 2013年1月湖北农业科学 H ubei A gricultural S ciences Vol．52No.2 Jan ．，2013 传统自然发酵酱的风味远比人工保温发酵产品优良，因为变温发酵过程有利于风味物质的形成［1］。因此对传统甜面酱种曲中的微生物进行分离、纯化和鉴定，筛选优良菌种用于工业化生产，对进一步提高甜面酱质量、改善其风味具有很重要的现实意义。目前，甜面酱的酿制主要采用沪酿3．042，并且甜面酱中主要功能菌株为米曲霉（Aspergillus oryzae ）［2］，所以，研究重点对甜面酱种曲中的米霉菌进行分离鉴定和培养条件的优化，为对其进一步研究打下一定的理论基础。 1 材料与方法 1．1 材料酱样品：于江苏省溧阳市收集的民间酱种曲样品。培养基：菌落分离采用PDA 培养基，菌种鉴定采用察氏培养基；霉菌发酵培养基（麸皮培养基）为 250mL 三角瓶中加入8g 麸皮、2g 豆粕、10mL 水，传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化黄红霞1，2，刘彩香1，康旭1，2，汪超1，2，陈雄1，2，王志1，2，李冬生1，2 （1．湖北工业大学生物工程学院，武汉 430068；2．湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068）摘要：采用形态学观察对传统甜面酱中分离得到的米曲霉（Aspergillus oryzae ）进行了初步鉴定，并对其培养条件进行了优化。首先，采用单因素试验确定米曲霉在培养时间56h 、湿度90％、曲料温度30℃的条件下，霉菌的产酶能力最高；接着采用响应面试验的Box－Behnken 设计原理对单因素试验筛选出的显著影响因素进行三因素三水平的分析试验，使用SAS 9．1软件对试验数据进行二次多项式的回归拟合和方差分析，确定其关键影响因素的最终优化值，并且预测蛋白酶和糖化酶的最高酶活。通过响应面试验可知，当培养时间为54h 、曲料湿度为90％、温度为31℃时，米曲霉中蛋白酶和糖化酶的酶活总和为1 764．34U ／g ，与优化前相比，酶活提高了17．33％。关键词：甜面浆；米曲霉（Aspergillus oryzae ）；形态学观察；培养条件；响应面试验中图分类号：TS264．2＋4 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2013）02－0408-04 Separation of Aspergillus oryzae from Traditional Sweet Flour Paste and Optimization of Its Cultivation Conditions HUANG Hong－xia 1，2，LIU Cai－xiang 1，KANG Xu 1，2，WANG Chao 1，2，CHEN Xiong 1，2，WANG Zhi 1，2，LI Dong－sheng 1，2 （1．College of Bioengineering ，Hubei University of Technology ，Wuhan 430068，China ； 2．Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei ，Wuhan 430068，China ） Abstract ：The Aspergillus oryzae separated from traditional sweet flour paste was primarily identified by morphological obser-vation ；and then its cultivation conditions were optimized．Firstly ，the results of single factor tests showed that when culturing at 90％humidity and 30℃for 56h ，the enzyme production ability of A．oryzae was the highest．Subsequently ，Box－Behnken designed principle of response surface experiment was applied to analyze the significantly influencing factors selected by single factor tests using three factors－three levels design ，of which the data was analyzed by SAS 9．1software for second polynomial regression and variance analysis to determine the key factors ，the final optimum value as well as predict the highest enzyme activity of protease and saccharifying enzyme．According to response surface experiment ，when cultivating with humidity of 90％and temperature of 31℃for 54h ，the total enzyme activity of protease and saccharifying enzyme in A．oryzae was 1764．34U ／g ，which was 17．33％higher than that before oplimization. Key words ：sweet flour paste ；Aspergillus oryzae ；morphological observation ；culture conditions ；response surface experiment

微生物分离培养及在传统发酵技术中的应用

专题21微生物分离培养及在传统发酵技术中的应用 [请根据当地教学实际和高考要求选用] 1．果酒制作用到的微生物是酵母菌，其代谢类型为异养兼性厌氧型，重要反应：C 6H 12O 6――→酶 2C 2H 5OH ＋2CO 2，最适温度为 18～25℃。 2．果醋制作用到的微生物是醋酸菌，其代谢类型为异养需氧型，重要反应：C 2H 5OH ＋O 2――→酶 CH 3COOH ＋H 2O ，最适温度为 30～35℃。 3．果酒、果醋的制作流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵 ↓↓果酒果醋 4．腐乳制作涉及的主要微生物是毛霉，其代谢类型为异养需氧型，重要反应：蛋白质――→蛋白酶多肽、氨基酸。 5．泡菜制作用到的微生物是乳酸菌，其代谢类型为异养厌氧型，重要反应：C 6H 12O 6――→ 酶 2C 3H 6O 3，最适温度一般为 18～20℃。 6．培养基按物理状态分为液体培养基和固体培养基；按功能分为选择培养基和鉴别培养基。 7．常见的两种接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。 8．三种常用的灭菌方法有：①灼烧灭菌，如接种环、接种针；②干热灭菌，如玻璃器皿和金属用具等；③高压蒸汽灭菌，如培养基等。 9．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数过程：土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→筛选能生长的微生物菌落。 10．分解纤维素的微生物的分离实验原理：刚果红纤维素 →红色复合物红色消失，出现透明圈 1．(2012·北京高考)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是( ) A ．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中

B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上 C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上 D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上 [命题立意]本题主要考查几种常见生物学实验的无菌操作要求。 [知识依托]①无菌操作对实验结果影响大小决定于杂菌对实验结果的影响。②植物组织培养成功的关键在于无菌操作，否则将导致实验失败。 [解析]选C A项，将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中进行酿酒时，在缺氧、酸性环境下其他杂菌不能生长，故不严格灭菌对其影响不大；B项，腐乳制作中将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上，毛霉生长繁殖快且抗杂菌能力强，故不严格灭菌对实验结果影响不大；C项，进行植物组织培养时，植物材料体积小、抗性差，而微生物繁殖快、生长迅速、会争夺培养基中的营养，产生的代谢废物还会毒害培养材料，故培养材料一旦被微生物(如细菌)污染，将严重影响实验结果；D项，选择培养基中已经加入了某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长，另外土壤浸出液本身也含有一定量的微生物，因此将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上时不进行严格的无菌操作，对实验结果影响不大。 2．(2012·江苏高考)下列关于制作果酒、果醋和腐乳的叙述，合理的是(多选)() A．在果酒发酵后期拧开瓶盖的间隔时间可延长 B．条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸 C．果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小 D．将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量 [命题立意]本题主要考查果酒、果醋和腐乳制作的知识。 [知识依托]①传统发酵技术操作中，要提供适合所用微生物生长发育的适宜条件，同时严格进行无菌操作，抑制其他杂菌生长。②实验操作过程中减少不安全因素的发生。 [解析]选ABC果酒发酵后期，因营养物质的消耗、pH改变等原因，酵母菌呼吸产生CO2的量变少，所以可延长拧松瓶盖的间隔时间，A项正确；当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸，B项正确；果酒发酵过程中不断消耗葡萄糖产生酒精，导致发酵液的密度逐渐减小，C项正确。制作腐乳时，对长满毛霉的豆腐加盐腌制时，需逐层加盐，并随层数加高而增加用盐量，在近瓶口表面要铺得厚一些，D项错误。 3．(2012·浙江自选模块)幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因