微卫星技术筛选大黄鱼耐低温标记
微卫星标记及其在贝类中的应用
微卫星标记及其在贝类中的应用
刘瑾;舒妙安
【期刊名称】《水利渔业》
【年(卷),期】2007(27)2
【摘要】微卫星广泛存在于真核生物基因组中,具有多态性高、共显性遗传、实验操作简单和结果稳定可靠等优点.微卫星标记是一种DNA分析手段,是种群遗传学
研究中广泛应用的分子遗传标记.微卫星标记技术已经应用于贝类遗传多样性评估、种质资源保护、群体遗传结构分析以及遗传连锁图谱的构建等方面.
【总页数】3页(P17-19)
【作者】刘瑾;舒妙安
【作者单位】浙江大学动物科学学院,杭州,310029;浙江大学动物科学学院,杭
州,310029
【正文语种】中文
【中图分类】Q33;Q75
【相关文献】
1.水稻细菌性条斑病抗性微卫星(SSR)标记的筛选及其在标记辅助选择中的应用 [J], 陈志伟;吴为人;周元昌;景艳军
2.微卫星标记在海洋经济贝类中的应用 [J], 姚红伟;陈国栋;宋晶
3.微卫星标记及其在贝类遗传选育研究中的应用 [J], 刘芳;刘卫东;王强;刘晓慧;赫
崇波;侯林
4.海洋贝类微卫星DNA标记的开发及其在遗传学研究中的应用 [J], 李琪
5.微卫星标记在贝类遗传学研究中的应用还处于初级阶段 [J], 钱锦
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【开题报告】龙头鱼微卫星标记的开发及筛选
开题报告生物科学龙头鱼微卫星标记的开发及筛选一、论述龙头鱼微卫星多态标记研究现状，说明选题的依据和意义目前，国内对龙头鱼的研究主要集中在属间的远缘杂交等方面，但是尚未研究成功。
对龙头鱼微卫星多态标记的开发目前尚未见报道，而本文主要是通过对龙头鱼微卫星进一步研究，希望能够利用远缘杂交所带来的杂交优势获得具有优良性状子代，那在生产上或遗传学上都将有重大意义。
微卫星标记技术是基于基因组DNA水平的差异进行检测，不受组织，器官种类、环境条件等因素影响，因此可作为水生动物种质鉴定、亲缘关系及种质分类等研究的理想标记。
龙头鱼俗称狗母鱼，属于脊索动物门,硬骨鱼纲,灯笼鱼目,狗母鱼科,龙头鱼属。
其形体柔软，长形，略侧扁，头背稍圆。
吻短，钝圆，口甚大。
龙头鱼生活于暖温性海洋的中下层。
运动能力不强。
常栖息于浅海泥底的环境中。
每年春季为产卵期。
杂食性，以小鱼、小虾、底栖动物为食。
分布于印度洋和太平洋、我国南海、东海和黄海南部均产之、尤以浙江的温、台和舟山近海以及福建沿海产量较多。
属暖水性底层近岸鱼类，缓潮时常到上层。
一般只在近海作短距离移动。
属捕食性鱼类，生长甚快。
以3～4月和9～12月渔获为大。
鉴于恢复与保护野生龙头鱼资源的需要,有必要对龙头鱼的种质遗传基础和种质资源鉴定开展深入的研究。
目前,有关龙头鱼群体遗传背景方面的研究很少,仅见于部分学者对龙头鱼野生群体和养殖群体进行了RAPD 分析。
然而,迄今为止,尚未见有关龙头鱼微卫星标记研究方面的报道,这严重制约了微卫星标记在龙头鱼遗传学研究中的应用。
因此,筛选多态信息含量丰富的龙头鱼微卫星标记,分析龙头鱼群体遗传结构用于标记选择育种等,具有重要的理论意义和应用价值。
然而,利用微卫星标记最关键的一步就是微卫星位点的分离和富集。
目前,常用的富集微卫星标记的方法主要有3 种: ①构建目标生物小片段插入基因组DNA 文库,通过含有重复序列的探针筛选含有微卫星的阳性克隆; ②通过生物素探针结合链霉亲和素包被的磁珠进行微卫星DNA 片段的富集; ③从公共核酸序列数据库资源中筛选微卫星。
微卫星分子标记技术及其在水产动物研究中的应用
微卫星分子标记技术及其在水产动物研究中的应用作者：黎玉元姚一彬孙念来源：《湖南饲料》 2013年第2期黎玉元姚一彬孙念（湖南农业大学水生生物学实验室长沙410128）摘要：微卫星分子标记与普通分子标记相比，它具有更多的优点，因其重复性好，多态性高，含量丰富且呈共显性遗传的特点，已成为目前最受欢迎的分子标记之一，并且得到了广泛应用。
本文结合国内外的研究，主要对微卫星的形成机理、特点，以及在水产动物中的应用等方面进行综述，并对其前景进行了展望。
关键词：微卫星标记：水产动物：应用微卫星(Micro-satellite)是一种比小卫星DNA具有更短重复单元的DNA序列，它是由少数几个核苷酸（多数为2-4个）为单位多次串联重复的DNA序列，因此又被称之为简单重复序列(SingleSequence Repeats，SSR)、简短串联重复序列(ShortTandem Repeats，STR)或简单序列长度多态性(Simple sequence length Polymorphism,SSLP)。
在对微卫星的构成与分布的研究中发现重复单元的构成与分布是不一致的，因此可以将微卫星DNA序列分为3种类型：间断型(interrupted)、单一型(pure)和复合型(compound)，由于微卫星具有诸多优点，因此很快就发展为一种新兴的分子标记技术，并得到了广泛应用。
1 微卫星形成的机理关于微卫星形成的机理存在着多种说法，其中主流说法有两种：第一种形成机理是DNA聚合酶滑动，在一个或多个重复单位未配对的构型中，DNA复制期间模板链和新生链瞬间分离，如果由不配对的重复序列引起的变性不断修复，则导致一个或多个重复单位的增加或丢失：第二种形成机理是DNA重组过程中，由于与不同DNA分子简单重复单位，以错位排列的构型配对和发生遗传变换导致重复单位的增加或减少。
2微卫星分子标记的特点微卫星分子标记是一种中性”标记，受生物发育时期和环境”的影响非常小，所以能够更加客观地反映生物之间的本质差异及种群结构和进化历史，微卫星作为一种新兴的分子标记主要具有以下特点：2.1 分析操作简单易行因为微卫星分子标记采用了单位点DNA指纹技术，所以它使取样的范围得到了一定程度的扩大，同时也相应地减轻了取样工作的困难和对研究对象的影响，再加上它具有检测容易、方便，重复性较好的特点，因而使其应用更加大众化。
微卫星标记在水产动物遗传研究方面的应用
微卫星标记在水产动物遗传研究方面的应用陈万光1,贾晓慧2(1.洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;2.洛阳理工学院环境与化学工程系,河南洛阳471023)摘要 微卫星标记具有分布广、多态性高、数量丰富、等位基因检测方便等优点,在亲缘关系分析、种质资源鉴定、物种遗传多样性检测等方面被研究者广泛采用。
笔者简要介绍了微卫星标记在水产动物遗传方面的研究进展,以期为水产动物遗传研究提供参考。
关键词 微卫星标记;水产动物;遗传;应用中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)12-05659-02作者简介 陈万光(1964-),男,河南洛阳人,教授,从事水产动物遗传育种方面的研究。
收稿日期 2009-02-0620世纪80年代,M a rsh fie ld 医学研究基金会(M a rsh fie ld M ed ica l R esea rch F ound a tion)的J am es 和俄勒冈健康科学大学(O regon H ea lth S cien ces U n ive rs ity)的W is 等人分离出一种比小卫星DN A 具有更短重复单元的DN A 序列,被称为微卫星(M icrosa tellite)。
由于其是几个(1～6bp)核苷酸为单位,多次串联重复N DA 序列,因此又被称之为简单重复序列(S in g le S equence R ep ea ts ,S SR )、简短串联重复序列(S hor t T a ndem R e-pea ts ,S TR)或简单序列长度多态性(S i m p le S equ ence L eng th P o lym o rp h is m,S S LP )[1]。
根据重复单元的构成与分布,微卫星DN A 序列被分为3种类型:单一型(pu re)、复合型(com p ound)和间断型(in terrup ted)。
大黄鱼EST微卫星标记初步筛选
大黄鱼EST微卫星标记初步筛选谢芳靖;张子平;邹志华;周鹏;王艺磊【期刊名称】《福建水产》【年(卷),期】2011(033)005【摘要】通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4．24％；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53．3％。
在这些微卫星序列中，（TG／GT／AC／CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG／AGG／GGA／CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26％和14％。
选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR扩增，2．0％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12．9％。
本研究为开发大黄鱼EST微卫星分子标记和大黄鱼基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。
%A normalized gonad cDNA library of Larimichthys crocea was constructed, from which 3535 EST were obtained by sequencing clones. The frequency and density of 2 -6 bp SSR were analyzed from these ESTs. Amount of 150 SSR （4.24%） were obtained, among which there were 64 dinucleotide,80 trinucleotide, 5 tetranucleotide and 1 pentanucleotide sequences. The trinucleotide repeats motifs were the most abundant motif in these SSR （53.3%）. Among the dinucleotide and trinucleotide sequences（TG/GT/AC/CA） n and （GAG/AGG/GGA/CCT） n repeats were thedominant motifs, which accounted for 26% and 14%, respectively. 62 pairs of primers were designed from EST sequences containing SSR. And 8 of them showed polymor- phic PCR products by electrophoresis on 2. 0% agarose gel. Polymorphism rate was 12. 9%. The results will contribute to the development of EST - SSR marker and the research of genes which contain SSR in coding regions.【总页数】6页(P9-14)【作者】谢芳靖;张子平;邹志华;周鹏;王艺磊【作者单位】集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021;美国西东大学生物系,新泽西州,美国07079;集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021;集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021;集美大学水产学院,福建省水产科学技术与食品安全重点实验室,厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.大黄鱼群体遗传多样性分析及耐低温性状相关微卫星标记的筛选 [J], 王惠儒;柳敏海;油九菊;罗海忠;许益铵;傅荣兵2.鮸鱼EST序列中微卫星标记的初步筛选及特征分析 [J], 孙典巧;孙悦娜;王日昕;徐田军3.微卫星技术筛选大黄鱼耐低温标记 [J], 穆方申;苗亮;李明云;胡谋;陈炯;张浩4.从棉花ESTs数据库中筛选微卫星标记的初步研究 [J], 李华盛;范术丽;沈法富5.凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选 [J], 王艳红;胡超群;张吕平;夏建军;任春华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大黄鱼微卫星标记的开发及其遗传方式分析_叶华
第36卷 第6期水生生物学报Vol. 36, No.6 2012年11月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICANov., 2 0 1 2收稿日期: 2012-04-19; 修订日期: 2012-08-22基金项目: 国家自然科学基金(30771663); 国家公益性行业(农业)科研专项(200903029-04); 集美大学创新团队科研基金(2011A001)资助作者简介: 叶华(1981—), 女, 四川广元人; 博士; 主要从事水产动物遗传育种与生物技术研究。
E-mail: yhlh2000@ 通讯作者: 王志勇(1963—), 男, 福建安溪人; 教授, 博导; 主要从事水产生物遗传育种与生物技术研究。
E-mail: zywang@DOI: 10.3724/SP.J.1035.2012.01156大黄鱼微卫星标记的开发及其遗传方式分析叶 华1, 2 任 鹏2 刘 洋2 刘贤德2 王志勇2(1. 西南大学, 鱼类繁育与健康养殖研究中心, 重庆 402460; 2. 集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室, 厦门 361021)摘要: 采用FIASCO 方法构建大黄鱼(AC)n 微卫星富集文库, 从文库中随机挑选90个白色克隆, 经过菌液PCR 筛选得到60 (66.7%)个阳性克隆进行测序, 其中有56个克隆(93.3%)含有 CA/GT 重复数大于5的微卫星序列。
56个微卫星序列中, 二核苷酸微卫星51个(91.1%), 三核苷酸微卫星5个; 二核苷酸重复中有48个为(AC)n 重复, 占二核苷酸总数的94.1%。
根据Weber 的微卫星分类规则, 完美型占75.0%, 非完美型占8.9%, 复合型微卫星占16.1%。
共设计引物52对, 在1个大黄鱼家系中35对引物所在位点具有多态性, 28个(80.0%)位点子代基因型为1∶1∶1∶1(AB × CD/AB × AC )分离类型, 6个位点属1∶1分离类型, 1个位点属1∶2∶1 (AB× AB)分离类型。
水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用
水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用一、本文概述随着现代生物技术的飞速发展，微卫星标记技术（Microsatellite Markers）已成为水生生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述水产生物微卫星标记技术的最新研究进展，包括其在水生生物遗传多样性分析、种群遗传结构解析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、基因定位以及辅助育种等多个领域的应用。
本文还将探讨微卫星标记技术在未来水产生物学研究中的发展趋势和潜在挑战。
我们将对微卫星标记技术的基本原理和特点进行简要介绍，以便读者对该技术有一个清晰的认识。
随后，我们将重点回顾近年来微卫星标记技术在各类水产生物（如鱼类、甲壳类、贝类等）中的研究应用，以及所取得的重要成果。
在此基础上，我们将分析当前研究中存在的问题和不足，并对未来发展方向进行展望。
通过本文的阐述，我们期望能为从事水产生物学研究的学者和技术人员提供有益的参考和启示，推动微卫星标记技术在水产生物学领域的应用和发展。
二、微卫星标记技术的基本原理和方法微卫星标记技术，也称为简单序列重复（Simple Sequence Repeats, SSRs）或短串联重复（Short Tandem Repeats, STRs），是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术。
其基本原理是利用生物基因组中广泛存在的微卫星DNA序列，这些序列由1-6个碱基组成的重复单元串联而成，重复次数在不同个体或品种间存在差异，从而表现出多态性。
微卫星位点的筛选和引物设计：通过生物信息学方法，从已知的基因组序列中筛选出微卫星位点，然后利用这些位点的序列信息设计特异性引物。
PCR扩增：以基因组DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR 扩增，扩增产物即为包含微卫星序列的DNA片段。
电泳检测和数据分析：将PCR产物进行凝胶电泳，根据DNA片段的大小差异进行分离，然后通过凝胶成像系统观察并记录结果。
通过对电泳图谱的分析，可以计算出微卫星序列的重复次数，从而得到不同个体或品种间的多态性信息。
黄鳍棘鲷微卫星标记开发及其在鲷科鱼类中的跨物种扩增
和 ０．１７７～０．９６３（均值为 ０．７４１），多态信息含量（ＰＩＣ）为 ０．１６６～０．９４６（均值为 ０．７０５）。经 Ｂｏｎ
ｆｅｒｒｏｎｉ校正后，有 ４３个位点符合哈迪温伯格平衡（ＨＷＥ），其余 ４个位点偏离 ＨＷＥ。这些多态性
微卫星标记为黄鳍棘鲷遗传资源研究提供新的有效分子标记。跨物种扩增结果显示，共有 ３１个黄
收稿日期：２０１８０９０６ 基金项目：公益性行业（农业）科研专项资助项目 （２０１４０３００８）；广 东 省 科 技 计 划 资 助 项 目 （２０１７Ａ０３０３０３０７７）；广 东 省 海 洋 和 渔 业 发 展 专 项
（科技攻关与研发）资助项目（Ａ２０１７０８Ｄ０７）；国家自然科学基金资助项目（３１３７２５３２） 作者简介：吴仁协（１９８１—），男，博士，副教授；Ｅｍａｉｌ：ｗｕｒｅｎｘｉｅ＠１６３．ｃｏｍ
鳍棘鲷微卫星标记可在 ９种鲷科鱼类中成功扩增。其中 １７个标记在太平洋棘鲷（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓ
ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）、黑棘鲷（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）和澳洲棘鲷（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ）中具有较好的通用
性，这些标记可为棘鲷属（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓ）的系统进化和种群遗传学分析提供新的标记来源；另有 ３
３期
吴仁协，等：黄鳍棘鲷微卫星标记开发及其在鲷科鱼类中的跨物种扩增
· ３５７·
借助高通量测序平台来识别和筛选出大批量、多碱 基重复的黄鳍棘鲷微卫星位点，以促进其种群遗传 背景调查、种质资源评估和分子标记辅助育种等相 关研究。
ＳＬＡＦｓｅｑ（ＳｐｅｃｉｆｉｃＬｏｃｕｓ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎＡ中 ＳＬＡＦ标 签序 列 的 简 化 基 因 组 测 序 技 术 。 ［１６］ ＳＬＡＦｓｅｑ技 术 具 有 实 验 成 本 低 、开 发 周 期 短 、获 取 标 记 数 量 和 类型丰富等 优 点，是 一 种 高 效 且 经 济 的 分 子 标 记 开发方法，已 成 功 应 用 于 多 种 鱼 类 的 微 卫 星 标 记 开发 。 ［１７２０］ 鉴于此，本 研 究 采 用 ＳＬＡＦｓｅｑ技 术 来 筛选黄鳍 棘 鲷 基 因 组 ＤＮＡ中 高 多 态 性 的 微 卫 星 位点，以期为 该 物 种 的 种 质 资 源 评 估 提 供 新 的 有 效分子 标 记。同 时，将 所 开 发 的 微 卫 星 标 记 在 ９ 种鲷科鱼类 中 进 行 跨 物 种 扩 增，以 检 测 开 发 标 记 在近缘种中的通用性。
大黄鱼耐低温性状相关微卫星标记的筛选
大黄鱼耐低温性状相关微卫星标记的筛选高国强;常玉梅;韩启霞;池炳杰;李明云;薛良义;梁利群【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2010(32)3【摘要】鱼类的耐低温性状是一种重要的经济性状.为了初步分析大黄鱼的耐低温性状,文章采用15对荧光微卫星标记,以SSR-PCR方法对大黄鱼低温耐受组和正常对照组F_1代共40个个体进行了耐低温性状遗传差异分析.结果显示,标记LYC0002在两组样品中共扩增出5个等位基因(片段大小分别为112 bp、110 bp、108 bp、106bp和104 bp),其中LYC0002_(112 bp)等位基因在低温耐受组的出现频率达60%,而在正常对照组中的频率为零,表明该等位基因对大黄鱼的温度敏感特性有较明显的偏好性,可能与某种耐低温基因存在一定的连锁关系.此外,对LYC0002_(106 bp)、LYC0002_(108 bp)、LYC0002_(110 bp)和LYC0002_(112 bp)4个等位基因分别进行了回收、克隆及测序.序列比对结果显示,LYC0002_(112 bp)等位基因含有10个(CA)重复单元,而其他3个等位基因依次缺失1个(CA)重复单元,说明LYC0002在本研究样本中的突变方式为微卫星逐步突变模型(Stepwise mutation model,SMM).【总页数】6页(P248-253)【作者】高国强;常玉梅;韩启霞;池炳杰;李明云;薛良义;梁利群【作者单位】中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨,150070;上海海洋大学水产与生命学院,上海,201306;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨,150070;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨,150070;上海海洋大学水产与生命学院,上海,201306;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨,150070;上海海洋大学水产与生命学院,上海,201306;宁波大学生命学院,宁波,315211;宁波大学生命学院,宁波,315211;中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨,150070【正文语种】中文【相关文献】1.大黄鱼群体遗传多样性分析及耐低温性状相关微卫星标记的筛选 [J], 王惠儒;柳敏海;油九菊;罗海忠;许益铵;傅荣兵2.暗纹东方鲀生长性状相关微卫星标记筛选 [J], 马爱军;邹杰;孙建华;王婷;王广宁;崔文晓;王新安;刘大勇;郭正龙3.酿酒酵母糠醛耐受性状相关微卫星标记的筛选 [J], 李莎莎;张梁;石贵阳4.微卫星技术筛选大黄鱼耐低温标记 [J], 穆方申;苗亮;李明云;胡谋;陈炯;张浩5.中国明对虾单个家系中与生长性状相关微卫星标记的初步筛选 [J], 董世瑞;栾生;孔杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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微卫星技术筛选大黄鱼耐低温标记穆方申;苗亮;李明云;胡谋;陈炯;张浩【摘要】In this study , the large yellow croakers Donghai No.1 was divided into cold-tolerant and cold-sensitive two groups by reduc-ing water temperature from 15℃to 6℃gradually , and then the molecular marker which linked to the resistance to low temperature was screened by microsatellite markers (SSR) analysis.The results showed that 39 alleles were amplified using 10 SSR primers, and only the alleles frequence of locus KPC 43 had significant difference between the cold-tolerant group and the cold-sensitive group .In the three alleles of KPC43, the occurrence frequency of KPC43170bp was 80.0%in the cold-tolerant group, while its occurrence frequency was only 23.33% in the cold-sensitivegroup .Correlative analysis showed that there was a significant positive correlation between KPC43170bp and cold-tolerant trait (P<0.01), and the correlation coefficient was 0.498.In the cold-sensitive group, the frequency of the KPC43150bp (76.67%) was significantly higher than that in the cold-tolerant group (30.0 %) .And there was a significant negative association with the KPC43150bp and cold-tolerant related character (P<0.01), and the correlation coefficient was -0.417.Sequence alignment showed that the microsatellite flanking regions of KPC 43170bp and KPC43150bp were the same, while the repeat sequence was (TG)12 in KPC43170bp and (TG)2 in KPC43150bp.It can be speculated that SSR marker KPC 43 may be linked to some cold tolerant gene of large yellow croaker , and the repeat numbersof ( TG) may affect these gene′s expressing activity , which is associated to the ability of cold tolerance .%为筛选大黄鱼耐低温性状相关分子标记，对大黄鱼进行降温实验（15℃降至6℃）后用SSR标记对低温敏感个体和低温耐受个体进行扩增分析。
结果显示：10对SSR引物共扩增到39个条带，仅标记KPC43的扩增条带在低温敏感和低温耐受个体间的出现频率存在显著差异。
标记KPC43共扩增到3个等位基因，其中KPC43170bp在低温耐受组中出现的频率（80.0％）显著高于低温敏感组（23.33％），该条带与大黄鱼耐低温能力存在极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.498；KPC43150bp在低温敏感组中出现的频率（76.67％）显著高于低温耐受组（30.0％），与大黄鱼耐低温能力存在极显著负相关（P＜0.01），相关系数达到－0.417。
序列比对显示KPC43170bp仅核心序列比KPC43150bp多了10个（TG）重复。
推测SSR标记KPC43可能与大黄鱼耐低温性状相关基因连锁，其核心序列的重复次数可能与该基因的表达活性有关，从而影响大黄鱼个体的耐低温能力。
【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2017(034)001【总页数】5页(P34-38)【关键词】大黄鱼;耐低温;微卫星标记【作者】穆方申;苗亮;李明云;胡谋;陈炯;张浩【作者单位】宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211;宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波315211【正文语种】中文【中图分类】Q958.8;S917.4大黄鱼是一种暖水性鱼类，是浙江、福建两省的重要海水养殖经济鱼类之一。
近年来，我国东南沿海在冬季常受寒潮侵袭，并多次出现特大寒潮，降温幅度大、持续时间长，养殖海域水温持续偏低，导致大黄鱼被大量冻死，经济损失严重[1-2]。
因此有必要研究低温对大黄鱼的影响，选育耐低温能力强的大黄鱼。
随着现代生物技术的发展，分子标记辅助育种成为培育具有优良性状新品种的一种重要方法。
例如在鲤鱼抗寒新品种荷包红鲤的选育及其后续研究中，梁利群等[3-5]利用RAPD技术获得6个与鲤鱼耐寒相关的标记，并且将其中1个标记定位在鲤鱼的第5号连锁群上；潘贤等[6]筛选出2个与鲤鱼抗寒性状相关的SSR标记，这些标记的开发与应用在鲤鱼抗寒新品种的选育中起到了重要作用；黄海水产研究所的研究人员[8]在开发了半滑舌鳎雌性特异性AFLP标记的基础上，研究了培育单性群体的方法。
微卫星标记(Simple sequence repeat, SSR)是进行遗传分析和鉴定的有力手段之一，具有分布广泛、呈孟德尔共显性遗传、多态性丰富等特点[9]，目前已经筛选到了罗非鱼体重与体长性状[10-11]、虹鳟抗肝胰脏坏死病性状[12]、褐牙鲆耐热性状[13]相关的多种SSR标记。
在大黄鱼的研究中，高国强等[14]、王惠儒等[15]分别发现微卫星标记LYC002和LYC0015可能与大黄鱼的耐低温能力有关。
这说明大黄鱼耐低温性状可能受基因的控制，使用SSR筛选大黄鱼的耐低温标记是可行的。
笔者所在课题组先后通过分析低温下大黄鱼血清生化、抗氧化水平、肝脏蛋白质组、脂肪酸含量的变化探讨了大黄鱼低温应激和适应的机理[16-19]，并且双向电泳分析显示经过低温选择后大黄鱼肝脏蛋白质组中与抗细胞凋亡、能量供应等功能相关的蛋白质表达显著上调[20]。
课题组运用群体选育技术、经连续5代选育获得的新品种大黄鱼“东海1号”不但生长速度快，而且耐低温能力也大幅提高[21]，但我们认为大黄鱼的耐低温能力仍有较大提高余地，有必要做进一步、更有针对性的遗传育种。
本研究利用10对微卫星引物对降温实验中的“东海1号”大黄鱼低温敏感和低温耐受个体进行扩增分析，旨在寻找与大黄鱼耐低温性状相关的分子标记，以期为耐低温品系选育提供依据。
1.1 实验材料实验用“东海1号”大黄鱼200尾，于2012年12月取自浙江省象山港湾水产苗种有限公司养殖网箱，实验鱼健康无伤，体重43.5～45.5 g，体长13.2～15.6 cm。
实验开始前，将鱼置于0.86 m2×1.3 m 的水泥池中，在水温(15.0±0.5)℃下暂养1周，避免其他应激因素对实验造成干扰。
用THD-1006型低温恒温槽(宁波天恒仪器厂)进行降温和控温，对实验鱼以0.5℃/48 h速率降温，直至6℃。
温度降到6℃后，持续5 d。
实验用水为象山港大黄鱼养殖海区的沙滤海水，鱼暂养与试验期间，早晚各换水1次，每次换水量1/3，换水前新水先预冷，并保持换水前后温差在±0.2 ℃范围之内，对温度降到9℃之前对低温不能耐受的个体(低温敏感)和降至6 ℃且维持5 d后仍能良好存活的个体(低温耐受)进行采样，剪取鳍条液氮速冻后-80℃保存，用常规酚/氯仿法提取基因组DNA。
1.2 微卫星分析采用An等[22]开发的10对大黄鱼微卫星引物，序列及扩增参数见表1，引物由生工生物工程有限公司合成。
PCR反应总体积20 μL，包括10 μL 2XTaqpremix-Dye(上海博彩生物科技有限公司)、上下游引物各1 μL、DNA模板1μL、超纯水7 μL。
反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，58℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次;最后72 ℃再延伸10 min。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤主要参照张秀华等人的实验 [23]。
PCR扩增产物首先用1.5 %琼脂糖凝胶进行电泳分离，以100 bp DNA Ladder作为分子量标准，电泳结束后，EB溶液染色，凝胶成像系统进行观察、拍照进行检测。
然后进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
先将玻璃板使用乙醇擦拭干净后固定，灌入8% 变性聚丙烯酰胺凝胶，灌完胶后立即将齿梳插入胶面，室温放置2 h或密封于4 ℃冰箱过夜聚合。
800 V电压进行0.5 h的预电泳。
样品处理如下：PCR产物与变性上样缓冲液按1∶1体积混合均匀，95 ℃变性5 min后，放于冰上冷却3 min复性后点样，再使用1000 V电压电泳3～4 h。
电泳完毕后使用100%冰醋酸摇床固定30 min后漂洗，硝酸银染色30 min，染色结束使用预冷的显色液显色，出现条带后放入冰醋酸终止显色。
使用Quantity One 4.62 (Bio-Rad公司)凝胶成像后统计、分析条带。
1.3 数据分析使用SPSS15.0软件对微卫星扩增等位基因片段与大黄鱼耐低温性状这两个变量进行皮尔逊检验(Pearson correctlation)，检测有差异的等位基因片段与大黄鱼耐低温性状是否具有相关性。