腺病毒重组系统
腺病毒的分子进化和流行病学
腺病毒的分子进化和流行病学腺病毒是一类广泛存在于人类、动物和植物中的病毒，由于其感染力强、传播性广、病程短暂等特点，腺病毒感染在医学和公共卫生领域一直备受关注。
本文将重点探讨腺病毒的分子进化和流行病学，以期对该病毒的防治和治疗提供一定的参考。
一、腺病毒的分子进化腺病毒是一类非包膜RNA病毒，其基因组由单股线性的RNA组成。
腺病毒包含7个不同的基因型，分别为A、B、C、D、E、F、G型。
其中，A、B、C、D型是人类最主要的腺病毒感染病原体，而E、F、G型则主要感染动物。
腺病毒的分子进化主要通过基因重组和点突变进行。
在基因重组方面，腺病毒的基因组非常灵活，可以轻松地进行基因重组以适应环境的改变。
例如，在病毒的品系亚型之间，可能会发生基因重排的现象，使得该病毒产生了新的基因型。
同时，腺病毒还可以通过点突变来适应环境的压力。
研究表明，腺病毒的基因型随着时间的推移，会发生一定的点突变，使得其在基因组上发生变化，对宿主的感染能力也发生变化。
二、腺病毒的流行病学腺病毒的流行病学研究要从其宿主和传播方式入手。
腺病毒在人类的感染很普遍，感染的方式有很多，可以通过空气、水、食物等多种方式传播。
腺病毒的感染主要分为肠道感染和呼吸道感染两种类型。
其中，肠道感染主要通过食物、饮水等途径传播，呼吸道感染则主要通过空气传播。
此外，腺病毒还可以在动物中传播，不同基因组的腺病毒可以感染不同类别、不同物种的动物，包括人类、猕猴、类人猿、啮齿类动物、鸟类等。
人类除了是腺病毒的主要宿主之一，还是许多病毒接种计划的接种对象。
总之，腺病毒的流行病学研究是极其重要的，不仅可以对腺病毒的防治起到积极的作用，还能通过对研究不同基因型、传播途径、病毒定量等方面的数据进行综合分析，探究腺病毒分子进化的规律及趋势。
三、腺病毒的防治及治疗腺病毒的防治和治疗是一个复杂的过程，需要通过多种方法来进行。
首先，要加强环境卫生和个人卫生，防止腺病毒的传播。
其次，针对不同基因型的腺病毒，可以开发不同类型的疫苗进行防治。
重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析
返回
Q8.重组腺病毒的推荐存储条件是什么？
返回
Q2.怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？
答：腺病毒有很广泛的宿主范围。它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染。一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性，因此需要大量的病毒来感染细胞。为了客户的方便，我们提供含有报告基因的病毒，如Ad-CMV-B-gal和Ad-CMV-GFP从而方便的进行您的预实验。
终点稀释实验的生物学原则类似于空斑形成实验，尽管二者过程和测量是不同的，而该法计算病毒滴度的公式则较之复杂。
尽管空斑形成实验和终点稀释实验给出了有感染能力或者有作用的病毒的滴度，但它们是通过人眼给出分值的，并受人及过程的变化的影响。对于相同的病毒源，不同人给出显著不同的滴度读值是很普遍的。
返回
Q7.对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？
答：对于长期存储，病毒应该被保存在-80°C，特别是在经过CsCl或层析柱纯化后。在-80°C,病毒可以稳定保存6个月到一年，在某些情况下甚至可以达到2年。如果病毒是在添加血清或BSA的DMEM中储存在-80°C,它能够稳定储存更长的时间并可以经受多次冻融过程。
另外，如果病毒经过CsCl纯化并被保存在PBS或Tris溶液(10mM Tris PH8.0, 2-3%甘油或蔗糖),应该避免反复冻融，因为这将导致滴度显著下降。
Q7.对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？
重组腺病毒Ad-P2G-DCN的构建及在HEK-293细胞中的表达
・
１９ ０ ８－
广东医学 ２ １ 年 ４月 第 ３ 卷第 ８ ０２ ３ 期 Ｇ ａ ｇ ｏ ｇ ｄ ａ ｕ ｎ ｌ ｐ． ０ ２ Ｖ １ ３ ， ｏ ８ ｕ ｎ ｄ ｎ Ｍｅ ｉ ｌ ｏ ｒ ａ ｃ Ｊ Ａ ｒ ２ １ ， ｏ ３ Ｎ ． ．
列 （ Ｍ ０６ ９ ５ 设 计 了 １对 ５端经 Ｋ ｎＩ 切 ， Ｎ ００ ０ ． ） ｐ 酶 ３ 端经 Ｎ ｔ 酶切 的 ２条互 补 Ｓ Ｆ一１ 号肽 序列 ， ｏＩ Ｄ 信 Ａ链
酶切 、Ｉ Ｐ酶去磷酸化 、 氯仿抽 提后 乙醇沉 淀线性 ＣＡ 酚／ 化的 质 粒 ， 电穿 孔 转 化 含 骨 架 质 粒 ｐ ｄ ａｙ一１的 Ａ Ｅｓ
Ｂ ５ ８ 感 受 态 菌。抽 提重 组 质 粒 ｐ ｄ—Ｓ Ｊ１ ３ Ａ Ｐ—Ｐ Ｇ— ２ Ｄ Ｎ，ａ 酶切鉴 定重 组质 粒 ， 脂糖 凝胶 电泳分 析 Ｃ ＰｃＩ 琼 酶切 图谱 ， 实 Ｓ 证 Ｐ—Ｐ Ｇ—Ｄ Ｎ基 因正 确重组 入腺病 ２ Ｃ 毒载体 ， 将阳性克隆转化至 Ｄ ５ｔ Ｈ ｏ 中进行大量扩 增 ， 抽 提制 备大量重组质粒 。
ＰＧ— Ｃ ２ Ｄ Ｎ蛋 白在 Ｈ Ｋ一 ９ 胞 中 的表 达 。 Ｅ ２３细
２ 结 果
Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ一 ２条单 链退 火 形成 互 补 双链 ， Ｃ Ｃ ｒＣ Ｃ Ｇ ５，
连入重组穿 梭质 粒 ｐ ｄ ｒｃ Ａ Ｔａｋ—Ｃ Ｖ Ｐ Ｇ—Ｄ Ｎ的相 Ｍ ／２ Ｃ 应酶切位点 ， 构建携带人 Ｓ Ｆ一１ Ｄ 信号肽序列 的重组穿
特异性受体 Ｃ Ｃ ４是促 进乳 腺癌 等恶 性肿 瘤转 移 的 ＸＲ 关键 因子 ； 表皮生 长因子受体 （ Ｇ Ｒ 在众 多肿瘤 细胞 ＥＦ ） 高水平表达 ， 与其配体表皮生长 因子 （ Ｇ ） 转化 生长 ＥＦ、
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）1、目的及适用范围该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿3、操作步骤3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度(PFU的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1:汉恒生物腺病毒载体附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要!!!*1腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别内操作。
2操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。
6病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。
7实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳;如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。
注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%,因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装(200 μl/tube,收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴度测定方法。
2腺病毒的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
重组腺病毒具有以下几个显著优点:感染范围广,几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织;感染效率高达100%,可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染;对外源基因容载能力大(可以高达8Kb;不整合基因组;滴度高,操作方便。
腺病毒-tk基因同源重组系统构建的研究
腺病毒-tk基因同源重组系统构建的研究周军;宋新明;徐鋆耀;王磊;兰平;汪建平【期刊名称】《岭南现代临床外科》【年(卷),期】2007(7)2【摘要】目的研制能快速高效地构建携带外源目的基因tk的重组腺病毒细菌内同源重组系统.方法将pBluescriptⅡKDR-tk、ptrack与ptrackCMV质粒转化感受态细菌后扩增,通过PmeⅠ酶线性化穿梭载体ptrackCMV-tk,然后将线性化的穿梭载体ptrackCMV-tk与pAdeasy-1进行重组构建成重组腺病毒质粒;利用整合入重组病毒质粒中的绿色荧光蛋白分别筛选重组后的腺病毒质粒.结果 PCR和RT-PCR分析外源基因的表达证实tk基因在DNA和mRNA水平上均能有效表达;荧光显微镜下观察计数GFP阳性细胞数,计算病毒滴度为1.1 × 1011pfu/L.结论细菌内同源重组系统能快速高效地构建携带外源目的基因tk的重组腺病毒;绿色荧光蛋白方便早期证实腺病毒的产生.【总页数】4页(P81-84)【作者】周军;宋新明;徐鋆耀;王磊;兰平;汪建平【作者单位】中山大学附属第二医院胃肠胰外科,广州,510120;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080;中山大学附属第二医院胃肠胰外科,广州,510120;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080【正文语种】中文【中图分类】R342.3【相关文献】1.带HSV—tk基因的重组腺病毒治疗小鼠实体瘤的研究 [J], 耿雨红;孟德鸣2.重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK基因靶向杀伤胃癌细胞的体外实验研究 [J], 李强;黄宗海;厉周;俞金龙3.带HSV—tk基因的重组腺病毒基因治疗小鼠B16黑色素瘤的实验研究 [J], 徐人欠;应蓓蓓4.带HSV-tk基因的重组腺病毒治疗肿瘤的初步研究 [J], 耿雨红;孟德鸣;吴昊泉;徐人尔;刘全海;李昌本5.细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用 [J], 刘自明;严律南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别？腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。
这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，包括分裂和非分裂细胞，而无需与宿主基因组整合。
它们两之间有几个主要区别：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。
腺病毒简介腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。
表达的发作时间可早于感染后16-24小时。
腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。
尽管如此，由于它们对大多数组织有高效转导作用，仍被广泛用于研究中。
腺病毒不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达。
它可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低，表达水平还是比较高的。
腺病毒优势宿主范围广：能够感染分裂期细胞与静止期细胞；对上皮细胞有高度嗜性，尤其适用于感染原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞类型感染效率高：优于其他病毒载体和转染系统的高感染能力，能达到近100%的效率包装容量大：最高可插入7.5 kb的外源片段表达水平高：1-2d即开始高水平表达安全系数高：去除病毒蛋白编码序列，降低细胞毒性和免疫反应；双质粒转染系统，生物安全性高无整合风险：无插入致突变性腺相关病毒简介AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。
AAV的趋向性也可以通过不同的血清型增强。
AAV的主要缺点是其对目的基因的包装容量较小，并且表达起效较晚（体外2-7天，体内3-21天），然而，该传递系统所产生的免疫应答水平却非常低。
腺相关病毒可以稳定整合至宿主基因组，并且可以在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点。
它能对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1013TU/mL，片段越大，滴度越低。
腺相关病毒可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平也是比较高的。
腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。
本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。
同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。
同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。
/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。
当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则54.2.2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞64.4.1 细胞铺板64.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色115.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒165.7.1 不连续密度梯度离心175.7.2 连续密度梯度离心175.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法205.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。
为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。
重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。
迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。
1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。
此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。
腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。
但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。
昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。
现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。
重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。
AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。
这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。
AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。
第二章应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。
腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。
2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。
腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。
腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。
此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA 稍大的DNA分子（105%）。
这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。
5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。
大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。
而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。
在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7. 能在悬浮培养液中扩增293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。
大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。
最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
第三章AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。
在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。
将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。
在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。
相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。
在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。