肿瘤标志物发现过程中的生物标本选择

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（收稿日期：２００９－１２－１６）

肿瘤标志物发现过程中的生物标本选择

刘　新综述，李建远审校（烟台毓璜顶医院中心实验室，山东烟台　２６４０００）

【关键词】　生物标本；　肿瘤标志物；　发现过程；　标本选择

中图分类号：Ｒ４４６．１文献标志码：Ａ文章编号：１６７２－９４５５（２０１０）０９－０８６９－０３

肿瘤生物标志物领域的研究目标是发展简单、无创的检测方法，应用于癌症风险评估、早期诊断、肿瘤分类以及监测病情的发展、消退和复发。基因组学的发展推动了生物医学发现的兴起。Ｗｏｏｄ等［１］通过对基因突变研究进而确定患乳腺癌和结肠癌的风险，而Ｒｏｓｓ等［２］在转录组水平上对人癌细胞系的基因表达模式进行研究。尽管基因组研究在癌症风险评估中取得了较快发展，但是作为生物功能的直接执行者（蛋白质）更适合作为生物标志物。由于转录表达水平与蛋白质表达水平并不相关，所以基于蛋白质组学技术的生物标志物发现途径成为首选，而生物标本的选择又是第１步。

目前，更多的研究仍然集中在基于血液样本的肿瘤生物标志物发掘。其基本假设是正常组织能够分泌特异的蛋白质（包括各种翻译后修饰的衍生物），构成一个分子指纹谱反映其生理状态；而疾病状态下的血液样本组分则能够反映相应的病理状态。因此，通过对血液特异分子指纹谱的研究可以揭示疾病的本质和进程。由于存在癌症组织不能将特异的蛋白质分泌到血液的可能，所以除血液标本外，合理的肿瘤生物标志物的生物标本来源应该包括肿瘤组织、组织液和肿瘤细胞系等［３］。本文针对上述主要生物标本来源进行综述，探讨各种生物样本的优缺点，目的在于为合理选择生物标本进行肿瘤生

物标志物的发现提供帮助。

１　血液样本

血液样本的无创采样方式直到现在仍然被认为是最理想的生物标志物发现来源。血液样本中的蛋白质丰度动态范围超过了１２个数量级，并且血液中２２种高丰度蛋白质含量占血液蛋白质总量的９９％以上。血液样本蛋白质的高动态范围和高复杂性都成为生物标志物发现过程的瓶颈。尽管蛋白质组学技术的快速发展促进了低丰度蛋白质的鉴定，但是仍然未能满足对更低丰度蛋白质鉴定的需求，例如２ＤＥ分离技术分辨４个数量级的蛋白质［４］和液相色谱分离技术分辨５个数量级的蛋白质［５］。另外一种策略是通过免疫亲和去除高丰度蛋白质和特异性的生物富集进而对低丰度蛋白质进行鉴定。免疫去除高丰度蛋白质的效率可以达到９６％甚至９９％，但是残留的清蛋白的浓度仍然高达５０μｇ／ｍＬ，是血液中癌胚抗原浓度的１０×１０３倍和白细胞介素－６浓度的５×１０６倍［６］；同时免疫亲和也会造成某些低丰度蛋白质的非特异去除，其中包括一些细胞因子的丢失［７］。

此外特异性富集的方法也被广泛应用，例如凝集素亲和色谱富集（糖蛋白和富含半胱氨酸的蛋白）。广泛使用策略，例如分析糖蛋白的凝集素亲和色谱法和酰肼耦联法［８］，分析富含半胱氨酸蛋白的半胱氨酸捕获法［９］等多种技术手段。通过这些方法已经成功鉴定了血浆低丰度蛋白质，例如管紧张素原（５０～７０μｇ／ｍＬ）、表皮生长因子受体（１．３～３．５μｇ／ｍＬ）及肝细胞生长因子激活蛋白（４００ｎｇ／ｍＬ）。但这些方法需要进一步验证是否适合临床应用。

血液中的肽组也被用于肿瘤生物标志物的发现。肽组主要是血液中蛋白质酶切片段或者多肽片段被称为血液中的肽组，其相对分子质量大都小于２０×１０３。基于肽组的分析手段是增强激光解析电离质谱（ＳＥＬＩＤ）技术，它可以使肽段离子化，而离子化强度与肽段组成相关。ＳＥＬＤＩ技术通过对体内血液蛋白质酶切片段、肿瘤来源的低丰度蛋白质及肿瘤来源蛋白酶的酶切产物进行质谱分析，根据谱图匹配情况及多肽质谱峰的强度区别疾病组和正常组。但由于ＳＥＬＤＩ技术是非鉴定型分析，即不能对蛋白质或肽段组成解析，因此很难对差异进行解释［１０］。

直接对血浆样本研究仍然存在生物学上的困难：由于基因遗传的多态性造成血浆蛋白质变性多，性别、年龄、种族、生活习惯、饮食习惯及健康状况都会影响血液蛋白质组的组成；另外血浆采集方法、处理时间、样品预处理流程、保存温度及血小板含量也都是将血液作为生物标志物来源必须考虑的因素；此外，潜在的肿瘤生物标志物浓度通过淋巴循环后浓度会降低１５００倍左右，这也是将血液样本作为生物标志物来源必须考虑的问题［１１］。

２　组织液样本

各种体内组织液也日益成为肿瘤生物标志物发现的重要标本来源。各类组织液为来源于肿瘤组织蛋白质提供一个窗口，这些肿瘤蛋白质通过分泌或者肿瘤细胞、组织降解的方式释放到这些组织外液中，在这些与肿瘤相互作用的微环境中潜在的生物标志物浓度最高。这些组织液主要包括：乳腺导管溢液（用于乳腺癌研究）、胸腔积液（用于胸腔肿瘤研究）、腹水（用于腹部肿瘤研究）和脑脊液（用于中枢神经系统肿瘤研究）［１２］。目前研究热点是通过乳头抽吸和灌洗等方法用于鉴定潜在的乳腺癌生物标志物。当前通过组织液发掘肿瘤标志物存在困难：采集样品液的步骤很难标准化；对照组很难严格设置（即使采集于另外一侧假定没有被感染的乳腺，也会受到液体采集量不同和微出血等因素干扰。液体采集体积和微出血受到复杂炎性反应和乳腺细胞或组织不同降解程度影响，因而造成不同对照组溢液的蛋白质组成也是不同的，使潜在生物标志物的发掘更加困难）。对照组和癌症组的胰腺组织和胰液蛋白质组研究结果表明上调和下调蛋白质很不相同，所以很难决定哪个差异蛋白质组研究结果能够用于癌症诊断。尽管如此，目前观点更多倾向于在胰液中发现标志物［１３］。

３　肿瘤组织样本

基于血液样本和组织液样本研究中存在的困难性，肿瘤组织也被认为是一种可操作的方案。为了克服肿瘤组织的不均一性，目前采用手工显微切割或者是激光捕获切割来挑选肿瘤细胞，即便是通过银染，双向电泳仍需要最低的细胞数量是４～７万个（约３０～４０μｇ），繁重的工作量，为深入研究带来不便。近年来发展的荧光差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术克服了这一缺陷。Ｍｅｙｅｒ等将ＤＩＧＥ技术和显微切割技术联合运用，仅使用１０００个细胞（约５μｇ）便成功地进行了胰腺内皮瘤生物标志物研究［１４］。考虑到肿瘤组织活检患者不易接受，也使得将肿瘤组织直接作为生物样本进行研究受到一定程度上的影响。４　肿瘤细胞系样本

肿瘤细胞系可以从肿瘤组织渗出物和降解的肿瘤组织中分离获得，其分泌的可溶性蛋白和自身膜蛋白很有可能释放到血液中，因而也是一种理想的肿瘤生物标志物的研究样本。肿瘤细胞系作为替代物研究生物标志物已有成功的报道。组织蛋白酶Ｄ用于胰腺和直肠癌研究［１５－１６］，组织蛋白酶Ｂ和Ｚ用于白血病研究［１７］。在肺癌潜在生物标志物研究中，人肺鳞癌上皮细胞培养液细胞和正常细胞的比较发现２２个蛋白质与组织转化有关，包括Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、膜联蛋白Ⅰ和Ⅱ［１８］。在乳腺癌细胞系研究中，对在不同条件培养基中培养的乳腺癌细胞系进行蛋白质组研究中，结果揭示了大量分泌蛋白质信息，这些信息可用于构建乳腺癌发展不同时期潜在生物标志物的挖掘［１９］。尽管肿瘤细胞系研究已经取得了进展，但是体外培养的细胞系离开了体内相应的微环境，因而与组织液蛋白质组研究结果进行互补研究是必要的。

５　展 望

可用于临床的生物标志物缺乏，并不是基于蛋白质组学技术发现的潜在生物标志物太少，相反而是太多了，因而需要大量的后期验证，最终确定该潜在生物标志物是否可以商业化。因而如何高效率地筛选可靠的潜在生物标志物成为焦点，而合理的生物样本选择则成为关键。不同的样本选择（血液、组织液、肿瘤组织和肿瘤细胞系）可能会得出不同的结果，因此正确的做法是根据不同疾病特点及综合考虑各种样本优缺点，选择适当样本进行分析，最终提供合理的潜在生物标志物（组），这将为后期研究以及临床应用节省大量的资金和时间。

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