动物细胞培养技术(1)

《动物细胞培养技术》复习思考题
1. 动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果
器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？
答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细
胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌
后的镊子取拿，避免造成污染。③
2. 叙述超净工作台的工作原理？
答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓
风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、
细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。
3. 正压过滤器为何会除菌？
答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层
膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程
4. 各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。
你认为精确配制各种溶液？
答：
5. 配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？
答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），
6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。
6. 用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制
答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的
消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。
7. L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？
答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、
嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细
胞有毒性。
8. HEPES溶液的作用机理？
答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动
9. 平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？
答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH
稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②
作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某
些低分子营养物质； b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源
物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源； d起酸碱度缓冲液作用；
e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。
10. 营养液制备后为什么要小剂量分装？
答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。
营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则
营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长
11. 10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？
答：
12. 细胞培养过程中对无菌的要求很高，你认为该如何操作才能保证培养过程中无微生物污
染？请详细阐述。
答：①实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以
70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作②
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验③进无菌室前要彻底
洗手④使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细
菌的污染。⑤操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。⑥）
吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用⑦⑧

13. 你认为组织块培养成功需哪些条件？你们小组为了实验成功采取了哪些具体的措施？
你在本次实验中做了什么工作？
答：①实验所用的器材必须保证无菌无毒，用胰蛋白酶（浓度适中）消化的时间不宜过长和
过高
14. 组织块培养的基本原理如何？
答：细胞增殖
15. 何时须更换培养基进行传代？可否使用与原先培养条件不同之血清种类来进行后期的
培养？
答：①一般两天换一次,如果细胞贴壁率变化不大,可以适当延长,到细胞贴壁率达到85左右,
可以传代 ②不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对
于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上
都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
16. 培养细胞时不用CO2或使用5 % 或10% CO2是否都可以？说明原因？
答：不是。一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH 的缓冲系统,而培养基中
NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度.当培养基中NaHCO3 含量为每公升
3.7 g时,细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时,则应使用
5 %CO2培养细胞.
17. 你认为心肌细胞培养的基本操作要点是什么？你在其中参与了什么操作？有什么体
会？
答：①要点：1）、首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据
组织是否分散成细胞团或单个细胞，采取终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。
2）、低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计
数并用培养液调整细胞密度。
3）、用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。
4）、将培养瓶放入37℃恒温箱中培养。
5）、每隔2到3天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。

18. 培养瓶移入CO2恒温箱培养时，瓶盖为何要稍松？又如何避免细胞污染？如果细胞污
染有何挽救措施？
答：①拧紧瓶盖无法进行气体交换，瓶盖稍松才能为细胞生长提供必要的氧气和二氧化碳，
尤其是二氧化碳特别重要，细胞在酸性培养液中生长的更好②

19. 胰蛋白酶的消化原理如何？如何初步判断胰蛋白酶的消化时间？
答：①原理：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白；使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起
来.用胰蛋白酶分解这些蛋白质后就可以使它们分开了! ②显微镜下观察细胞：倒置显微镜
下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再链接成片，表明此时细胞消化适度。 2~10
分钟
20. 细胞培养到一定时间为何要进行传代？能一直传代下去吗？阐述其机理。
答：①因为进入衰亡期,细胞发生接触抑制,营养逐渐耗尽,有毒废物积累,细胞变大自溶.这时
就要重新接种培养。②不能。正常细胞每分裂一次端粒会逐渐缩短，分裂次数过多会衰老直
至死亡。但肿瘤细胞除外。