刺五加多糖提取纯化工艺的优化
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precipitation time
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乙醇 浸 提液( C) Ethanol
extract
31
沉淀 pH 值( D) Preci pitation
pH value
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4
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- 20
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2 结果与分析 2. 1 刺五加多糖水提醇沉条件的确定及优化 2. 1. 1 提取时间对刺五加多糖得率的影响。由图 1 可知, 随 着提取时间的延长, 刺五加多糖得率逐渐增大; 当提取时间 为 150 min 时, 多糖得率达到 30. 69 mg/ g。之后随着提取时间 的延长, 刺五加多糖得率增幅趋于平缓。因此选定 150 min 为最适提取时间。 2. 1. 2 提取温度对刺五加多糖得率的影响。不同提取温度 对刺五加多糖得率的影响如图 2 所示。由图 2 可知, 在试验 温度范围内, 随着温度的升高, 多糖的得率也逐渐升高, 温度 达到 100 时, 多糖得率最大, 为 25. 12 mg/ g。但温度从 90 升到 100 时, 多糖得率的增幅趋势明显小于从 70 升至 90
分别称取 10 g 粉碎好的刺五加 4 份, 放入 4 只烧杯中, 各加 200 ml 蒸馏水, 摇匀, 水浴加热 60 min, 加热温度分别设 定为 70、80、90 和 100 , 比较不同浸提温度下的多糖得率。
分别称取 10 g 粉碎好的刺五加 6 份, 放入 6 只烧杯中, 按水料比( ml/ g) 为 10 1、14 1、18 1、22 1、26 1 和 30 1 的要求 分别加入蒸馏水, 摇匀, 80 水浴加热 90 min, 比较不同水料 比条件下的多糖得率。
基金项目 作者简介 收稿日期
河北省自然 科学基金 ( C200800155) ; 河 北省教 育厅科 学研 究重点 项 目 ( ZH2007107 ) ; 河 北 师 范 大 学应 用 开 发 基 金 ( L2004K02) 资助项目。 李天金( 1967- ) , 男, 河北张家界人, 硕士, 高级 讲师, 从事 生物化 学的教学 与研究。* 通讯作者, 教授, E mail: Wlian 1965@ 126. com。 2009 03 17
时的增幅, 并且温度太高, 会导致多糖降解甚至失活, 不利 于保持多糖的活性; 再结合工艺中节能的需要, 采用 90 作 为热水浸提的适宜温度。
1. 3 刺五加多糖的纯化工艺 1. 3. 1 去除刺五加多糖蛋白、色素工艺。参考文献[ 6- 7] , 选择树脂 860021、DM2、330、D941 和 D202R 去除刺五加多糖提 取液的蛋白、色素, 并对其效果进行比较。同时以传统活性 碳法、双氧水法为对照, 进行效果比较。
称取 100 g 粉碎好的刺五加置于烧杯中, 加蒸馏水 2 000 ml。摇匀, 于 80 水浴加热 3 h。真空抽滤, 得第 1 次多糖提 取液与滤渣; 对滤渣在同等条件下进行第 2 次、第 3 次浸提,
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安徽农业科学
20源自文库9 年
比较浸提次数对多糖得率的影响。 将上述条件下获得的多糖提取液 100 ml 加 4 倍体积的
笔者以获得纯多糖为目的, 对水提醇沉工艺的每一环节 进行优化, 采用树脂脱色、去蛋白, 并采用柱层析技术进行纯 化, 实现了对刺五加多糖制备工艺的整体优化, 对工业化制 备纯多糖具有重要指导意义, 同时为进一步开展刺五加多糖 的生化特性、生理功能研究奠定基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 刺五加: 石家庄乐仁堂药店。树脂 860021、DM2、 330、D941、D202R 购自山东鲁抗公司。DEAE Sepharose F. F, Sephadex G200 为 Pharmacia 产品。 1. 2 刺五加粗多糖的提取工艺 刺五加粉碎 热水浸提 离心或过滤 浸提液浓缩 乙醇沉淀 离心 沉淀物干燥
1 和As 2 2 个多糖组分。[ 结论] 该研究结果为进一步确定刺五加多糖的生化特性、生理功能奠定基础。 关键词 刺五加; 多糖; 提取; 纯化; D941 树脂
中图分类号 Q 539 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611(2009) 17- 07977- 04
Studies on the Extraction and Purification Techniques of Polysaccharides from Acathopanax senticosus LI Tian jin et al ( Zhangjiakou Institute of Education, Zhangjiakou, Hebei 075000) Abstract [Objective]The purpose of this research was to optimize extraction and purification techniques of Polysaccharides from Acathopanax sentico sus . [Method] The extraction and purification conditions of polysaccharides from Acathopanax senticosus were studied by single factor tests and orthogonal design tests. [ Result] The results indicated that the conditions of extraction and purification techniques of Polysaccharides from Acathopanax senticosus were as follows: the optimal water extraction conditions of polysaccharides were confirmed that the water temperature for extractionwas 90 for 150 min, 2 times extraction, and the ratio of material (g) to water ( ml) was 1 18. The optimal alcohol sedimentation conditions of polysaccharides were ascertained that the alcohol temperature was - 20 for 36 h, the ratio of alcohol ( ml) to water extraction portion ( ml) was 4 1, and the suitable pH value was 7. The effect compares of decolorization and deprotein from the crude polysaccharides among different resins suggested that the D941 resin was of the best ef fect on decolorization and deprotein. The polysaccharides were further purified by DEAE Sepharose and Sephadex G 200 chromatogram column, then As 1 and As 2 of polysaccharides portionwere obtained. [ Conclusion]This study will help research the biochemical characteristic and physiological function of Acathopanax senticosus polysaccharide. Key words Acathopanax senticosus ; Polysaccharide; Extraction; Purification; D941 resin
摘要 [ 目的] 优化刺五加多糖的提取纯化工艺。[ 方法] 以药用植物刺五加为材料, 采用单因素试验和正交试验法对多糖提取、纯化的
工艺进行优化。[ 结果] 结果表明, 热水浸提的最佳温度为 90 , 浸提时间为 150 min, 水料比为 18 1, 提取次数 2 次; 醇沉温度为- 20 , 时间 36 h, 乙醇与浸提液比例为 4 1, pH 值为 7 时多糖产率最高。采用树脂动态吸附法筛选不同树脂去除多糖色素和蛋白的效果, 结果 显示, D941树脂最好。经树脂处理的多糖采用 DEAE Sepharose 阴离子交换柱和 Sephadex G200 层析柱进一步纯化, 得到了纯度较高的 As
刺五加粗多糖。 1. 2. 1 刺五加粗多糖热水提取条件的选择。采用中药粉碎 机将刺五加粉碎, 分别称取 10 g 粉碎好的刺五加 5 份, 放入 5 只烧杯中, 各加 200 ml 蒸馏水, 摇匀。80 水浴加热 60、90、 120、150 和 180 min。随后分别进行筛网过滤和真空抽滤, 去 除残渣得刺五加多糖提取液。苯酚- 硫酸法测其多糖含量, 比较不同提取时间条件下的多糖得率。
水平 L ev el
1 2 3
表 1 L9(34) 正交试验因素与水平
Tabl e 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test
醇沉温度( A ) Ethanol
precipitation temperature
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醇沉时间( B) h Ethanol
研究表明, 刺五加多糖为分子量不大的水溶性多糖。酸 浸提法和碱浸提法很容易使部分多糖发生水解, 从而破坏活 性多糖的结构, 因此, 多糖的提取工艺常用水提醇沉法[ 4] 。 但由于植物中的成分比较复杂, 多糖常与其他成分共存, 采 用此工艺制备的粗多糖含有大分子蛋白质、色素、无机盐及 其他小分子等杂质, 影响多糖的纯度和应用。进一步纯化的 方法有多种, 如: 利用多糖在乙醇中的溶解度不同进行分级; 根据多糖阴离子电荷密度的不同, 利用季铵络合物的生成、 离子交换色谱和电泳进行分级分离; 根据多糖的分子量大小 不同, 用凝胶色谱、超滤等技术进行分级分离[5] 。得到纯的 多糖或单一组分是测定多糖分子量, 糖链结构和筛选出某一 分子量范围的高活性多糖组分的前提。
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2009, 37(17) : 7977- 7980, 8029
责任编辑 李玮 责任校对 卢瑶
刺五加多糖提取纯化工艺的优化
李天金1, 翟树平2, 李 洁2, 王立安2*
(1. 张家口教育学院, 河北张家口 075000; 2. 河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050016)
95% 食用酒精, 体积大的用旋转蒸发器浓缩至 100 ml, 置于 4 冰 箱沉淀 24 h。离心 收集沉 淀, 沉 淀真空 冷冻干 燥后
称重。 多糖得率= ( 多糖质量/ 刺五加原料质量) 100%
1. 2. 2 刺五加多糖醇沉的正交试验。以乙醇与浸提液体积 比、沉淀 pH 值、醇沉温度、醇沉时间为考察因素, 进行 L9( 34) 正交试验( 表 1) 。以多糖得率为考察指标, 筛选出最佳提取 条件。
刺五加( Acathopanax senticosus)为落叶灌木, 与人参同属 于五加科, 亲缘关系较近, 含有的有机化学成分也具有一定 联系, 其主要有效成分是刺五加多糖和黄酮类活性物质, 此 外, 还含刺五加皂甙、异嗪皮啶、丁香甙、胡萝卜甙和芝麻素 等[ 1] 。其中刺五加多糖的药理作用广泛, 参与人体细胞的各 种生命过程及生理功能的调节, 并以独特的活性和低毒性的 特点使其在临床应用中具有很大的潜力, 具有调节免疫、抗 癌、抗病毒、抗衰老、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等 生理功能[ 2- 3] 。目前, 主要从刺五加的根、根皮及果实中提 取分离得到刺五加多糖。
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乙醇 浸 提液( C) Ethanol
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沉淀 pH 值( D) Preci pitation
pH value
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2 结果与分析 2. 1 刺五加多糖水提醇沉条件的确定及优化 2. 1. 1 提取时间对刺五加多糖得率的影响。由图 1 可知, 随 着提取时间的延长, 刺五加多糖得率逐渐增大; 当提取时间 为 150 min 时, 多糖得率达到 30. 69 mg/ g。之后随着提取时间 的延长, 刺五加多糖得率增幅趋于平缓。因此选定 150 min 为最适提取时间。 2. 1. 2 提取温度对刺五加多糖得率的影响。不同提取温度 对刺五加多糖得率的影响如图 2 所示。由图 2 可知, 在试验 温度范围内, 随着温度的升高, 多糖的得率也逐渐升高, 温度 达到 100 时, 多糖得率最大, 为 25. 12 mg/ g。但温度从 90 升到 100 时, 多糖得率的增幅趋势明显小于从 70 升至 90
分别称取 10 g 粉碎好的刺五加 4 份, 放入 4 只烧杯中, 各加 200 ml 蒸馏水, 摇匀, 水浴加热 60 min, 加热温度分别设 定为 70、80、90 和 100 , 比较不同浸提温度下的多糖得率。
分别称取 10 g 粉碎好的刺五加 6 份, 放入 6 只烧杯中, 按水料比( ml/ g) 为 10 1、14 1、18 1、22 1、26 1 和 30 1 的要求 分别加入蒸馏水, 摇匀, 80 水浴加热 90 min, 比较不同水料 比条件下的多糖得率。
基金项目 作者简介 收稿日期
河北省自然 科学基金 ( C200800155) ; 河 北省教 育厅科 学研 究重点 项 目 ( ZH2007107 ) ; 河 北 师 范 大 学应 用 开 发 基 金 ( L2004K02) 资助项目。 李天金( 1967- ) , 男, 河北张家界人, 硕士, 高级 讲师, 从事 生物化 学的教学 与研究。* 通讯作者, 教授, E mail: Wlian 1965@ 126. com。 2009 03 17
时的增幅, 并且温度太高, 会导致多糖降解甚至失活, 不利 于保持多糖的活性; 再结合工艺中节能的需要, 采用 90 作 为热水浸提的适宜温度。
1. 3 刺五加多糖的纯化工艺 1. 3. 1 去除刺五加多糖蛋白、色素工艺。参考文献[ 6- 7] , 选择树脂 860021、DM2、330、D941 和 D202R 去除刺五加多糖提 取液的蛋白、色素, 并对其效果进行比较。同时以传统活性 碳法、双氧水法为对照, 进行效果比较。
称取 100 g 粉碎好的刺五加置于烧杯中, 加蒸馏水 2 000 ml。摇匀, 于 80 水浴加热 3 h。真空抽滤, 得第 1 次多糖提 取液与滤渣; 对滤渣在同等条件下进行第 2 次、第 3 次浸提,
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安徽农业科学
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比较浸提次数对多糖得率的影响。 将上述条件下获得的多糖提取液 100 ml 加 4 倍体积的
笔者以获得纯多糖为目的, 对水提醇沉工艺的每一环节 进行优化, 采用树脂脱色、去蛋白, 并采用柱层析技术进行纯 化, 实现了对刺五加多糖制备工艺的整体优化, 对工业化制 备纯多糖具有重要指导意义, 同时为进一步开展刺五加多糖 的生化特性、生理功能研究奠定基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 刺五加: 石家庄乐仁堂药店。树脂 860021、DM2、 330、D941、D202R 购自山东鲁抗公司。DEAE Sepharose F. F, Sephadex G200 为 Pharmacia 产品。 1. 2 刺五加粗多糖的提取工艺 刺五加粉碎 热水浸提 离心或过滤 浸提液浓缩 乙醇沉淀 离心 沉淀物干燥
1 和As 2 2 个多糖组分。[ 结论] 该研究结果为进一步确定刺五加多糖的生化特性、生理功能奠定基础。 关键词 刺五加; 多糖; 提取; 纯化; D941 树脂
中图分类号 Q 539 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611(2009) 17- 07977- 04
Studies on the Extraction and Purification Techniques of Polysaccharides from Acathopanax senticosus LI Tian jin et al ( Zhangjiakou Institute of Education, Zhangjiakou, Hebei 075000) Abstract [Objective]The purpose of this research was to optimize extraction and purification techniques of Polysaccharides from Acathopanax sentico sus . [Method] The extraction and purification conditions of polysaccharides from Acathopanax senticosus were studied by single factor tests and orthogonal design tests. [ Result] The results indicated that the conditions of extraction and purification techniques of Polysaccharides from Acathopanax senticosus were as follows: the optimal water extraction conditions of polysaccharides were confirmed that the water temperature for extractionwas 90 for 150 min, 2 times extraction, and the ratio of material (g) to water ( ml) was 1 18. The optimal alcohol sedimentation conditions of polysaccharides were ascertained that the alcohol temperature was - 20 for 36 h, the ratio of alcohol ( ml) to water extraction portion ( ml) was 4 1, and the suitable pH value was 7. The effect compares of decolorization and deprotein from the crude polysaccharides among different resins suggested that the D941 resin was of the best ef fect on decolorization and deprotein. The polysaccharides were further purified by DEAE Sepharose and Sephadex G 200 chromatogram column, then As 1 and As 2 of polysaccharides portionwere obtained. [ Conclusion]This study will help research the biochemical characteristic and physiological function of Acathopanax senticosus polysaccharide. Key words Acathopanax senticosus ; Polysaccharide; Extraction; Purification; D941 resin
摘要 [ 目的] 优化刺五加多糖的提取纯化工艺。[ 方法] 以药用植物刺五加为材料, 采用单因素试验和正交试验法对多糖提取、纯化的
工艺进行优化。[ 结果] 结果表明, 热水浸提的最佳温度为 90 , 浸提时间为 150 min, 水料比为 18 1, 提取次数 2 次; 醇沉温度为- 20 , 时间 36 h, 乙醇与浸提液比例为 4 1, pH 值为 7 时多糖产率最高。采用树脂动态吸附法筛选不同树脂去除多糖色素和蛋白的效果, 结果 显示, D941树脂最好。经树脂处理的多糖采用 DEAE Sepharose 阴离子交换柱和 Sephadex G200 层析柱进一步纯化, 得到了纯度较高的 As
刺五加粗多糖。 1. 2. 1 刺五加粗多糖热水提取条件的选择。采用中药粉碎 机将刺五加粉碎, 分别称取 10 g 粉碎好的刺五加 5 份, 放入 5 只烧杯中, 各加 200 ml 蒸馏水, 摇匀。80 水浴加热 60、90、 120、150 和 180 min。随后分别进行筛网过滤和真空抽滤, 去 除残渣得刺五加多糖提取液。苯酚- 硫酸法测其多糖含量, 比较不同提取时间条件下的多糖得率。
水平 L ev el
1 2 3
表 1 L9(34) 正交试验因素与水平
Tabl e 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test
醇沉温度( A ) Ethanol
precipitation temperature
20
醇沉时间( B) h Ethanol
研究表明, 刺五加多糖为分子量不大的水溶性多糖。酸 浸提法和碱浸提法很容易使部分多糖发生水解, 从而破坏活 性多糖的结构, 因此, 多糖的提取工艺常用水提醇沉法[ 4] 。 但由于植物中的成分比较复杂, 多糖常与其他成分共存, 采 用此工艺制备的粗多糖含有大分子蛋白质、色素、无机盐及 其他小分子等杂质, 影响多糖的纯度和应用。进一步纯化的 方法有多种, 如: 利用多糖在乙醇中的溶解度不同进行分级; 根据多糖阴离子电荷密度的不同, 利用季铵络合物的生成、 离子交换色谱和电泳进行分级分离; 根据多糖的分子量大小 不同, 用凝胶色谱、超滤等技术进行分级分离[5] 。得到纯的 多糖或单一组分是测定多糖分子量, 糖链结构和筛选出某一 分子量范围的高活性多糖组分的前提。
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2009, 37(17) : 7977- 7980, 8029
责任编辑 李玮 责任校对 卢瑶
刺五加多糖提取纯化工艺的优化
李天金1, 翟树平2, 李 洁2, 王立安2*
(1. 张家口教育学院, 河北张家口 075000; 2. 河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050016)
95% 食用酒精, 体积大的用旋转蒸发器浓缩至 100 ml, 置于 4 冰 箱沉淀 24 h。离心 收集沉 淀, 沉 淀真空 冷冻干 燥后
称重。 多糖得率= ( 多糖质量/ 刺五加原料质量) 100%
1. 2. 2 刺五加多糖醇沉的正交试验。以乙醇与浸提液体积 比、沉淀 pH 值、醇沉温度、醇沉时间为考察因素, 进行 L9( 34) 正交试验( 表 1) 。以多糖得率为考察指标, 筛选出最佳提取 条件。
刺五加( Acathopanax senticosus)为落叶灌木, 与人参同属 于五加科, 亲缘关系较近, 含有的有机化学成分也具有一定 联系, 其主要有效成分是刺五加多糖和黄酮类活性物质, 此 外, 还含刺五加皂甙、异嗪皮啶、丁香甙、胡萝卜甙和芝麻素 等[ 1] 。其中刺五加多糖的药理作用广泛, 参与人体细胞的各 种生命过程及生理功能的调节, 并以独特的活性和低毒性的 特点使其在临床应用中具有很大的潜力, 具有调节免疫、抗 癌、抗病毒、抗衰老、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等 生理功能[ 2- 3] 。目前, 主要从刺五加的根、根皮及果实中提 取分离得到刺五加多糖。