western实验步骤
WB实验步骤详解
之巴公井开创作Western实验步伐Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测卵白的重要方法之一.Western可以参考如下步伐进行把持. 1. 收集卵白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品.对某些特定的亚细胞组份卵白,例如细胞核卵白、细胞浆卵白、线粒体卵白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份卵白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核卵白与细胞浆卵白抽提试剂盒(P0028). 收集完卵白样品后,为确保每个卵白样品的上样量一致,需要测定每个卵白样品的卵白浓度.根据所使用的裂解液的分歧,需要采纳适当的卵白浓度测定方法.因为分歧的卵白浓度测定方法对一些去垢剂和还原剂等的兼容性分歧很年夜.如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液,可以使用BCA卵白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012). 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A).该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方. (2) 样品处置在收集的卵白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE卵白上样缓冲液.例如2X或5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液.使用5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的卵白样品.5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE卵白上样缓冲液(5X)(P0015). 100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充沛变性卵白. (3) 上样与电泳冷却到室温后,把卵白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可. 为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断卵白分子量年夜小,最好使用预染卵白质分子量标准(P0066). 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B). 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳.对Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右.SDS-PAGE可以采纳普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采纳碧云天的多功能电泳仪(带按时)(EEP102).为了电泳方便起见,也可以采纳整个SDS-PAGE 过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定按时时间为90－120分钟.设置按时可以防止经常发生的电泳过头. 通常电泳时溴酚蓝达到胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染卵白质分子量标准的电泳情况,预计目的卵白已经被适当分离后即可停止电泳.3. 转膜(Transfer) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33).硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用,但硝酸纤维素膜比力脆,在把持过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开.膜的使用请参考生产商的推荐使用步伐. 通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟.也可以在15-20mA转膜过夜.转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带按时)(EEP102).具体的转膜时间要根据目的卵白的年夜小而定,目的卵白的分子量越年夜,需要的转膜时间越长,目的卵白的分子量越小,需要的转膜时间越短. 在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜. 转膜的效果可以观察所使用的预染卵白质分子量标准,通常分子量最年夜的1-2条带较难全部转到膜上.转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色,以观察实际的转膜效果.也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察卵白的残留情况. 4. 封闭(Blocking)转膜完毕后,立即把卵白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液.从转膜完毕后所有的步伐,一定要注意膜的保湿,防止膜的干燥,否则极易发生较高的布景. 用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液,加入Western封闭液(P0023B),在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟.对一些布景较高的抗体,可以4℃封闭过夜.在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似仪器,侧向摆动速度比力缓慢,而且也容易让溶液覆盖卵白膜. 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书,依照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗. 用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时.如果一抗孵育一小时效果欠安,可以4℃缓慢摇动孵育过夜.或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间. 回收一抗.加入Western洗涤液(P0023C),在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟.共洗涤3次.如果结果布景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数. 注：Western结果通常需要提供内参作为对比,通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128),进行内参检测. 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)参考二抗的说明书,依照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标识表记标帜的二抗. 二抗需根据一抗进行选择,例如,一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗,如辣根过氧化物酶标识表记标帜山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216).碧云天有多种二抗提供. 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时. 回收二抗.加入Western洗涤液(P0023C),在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟.共洗涤3次.如果结果布景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数.7. 卵白检测(Detection of proteins)参考相关说明书,使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测卵白.压片可以采纳专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行. 洗片时可以使用X光片自动洗片机.如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片.X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片(FF057/FF081). 8. 膜的重复利用(Membrane recovery)如果卵白样品非常贵重,可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处置卵白膜,以重复利用卵白膜.。
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳注意： （1）所有蛋白样品定量一致，体积以一致，不够的用裂解液补满，样品两 侧 的 泳 道 用 等 体 积 的 1×loading buffer 上 样 ， Marker 也 用 1×loading buffer调整至与样品等体积，这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散， 使最边上的孔道电泳出现误差。 （2）Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、 上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸 条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背 景也就出来了。 （3）浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离 胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而 在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好，浓缩胶80v，分离胶100v 就能跑得很好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻 地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。
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Western Blot基本实验步骤
1、蛋白质提取：WIP或RIPA裂解细胞或研磨组织，离心，收集上清。 2、蛋白定量：先总蛋白定量，western后在依据内参定量。 3、电泳：依据需要检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。 4、转膜：半干或湿转，应用半干法转膜需防止短路。 5、封闭：5%脱脂奶粉或BSA封闭过夜或室温1小时。 6、一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4 度过夜，1x TBST洗膜3次，每次5分钟。 7、二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时， 1x TBST，洗膜3次，每次5分钟。 8、显影(ECL法)：将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜 膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝 光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定 影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。 9、图片分析：标定Marker，进行分析与扫描 。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
Western blot实验步骤
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
western blotting的基本操作过程
western blotting的基本操作过程Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。
它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。
本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。
一、材料准备在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。
首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。
此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。
此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。
二、电泳分离Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。
在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。
将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。
在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。
当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。
分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。
三、转膜将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。
转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。
加入转移缓冲液、荷载样品和过硫酸铵，启动转移。
转膜电源把电流传递到电极板上，导致电子从内极板流向外极板。
这个过程产生的电流足以推动带电粒子（即蛋白质）从凝胶中转移到聚氟乙烯膜上。
由于膜具有不吸水的特性，其吸附的蛋白质能够保持原来的位置和形式。
借助荧光染料可以对蛋白质进行原位成像，并进一步进行分析。
四、免疫分析Western blotting的第四个步骤是免疫分析。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
Western blot 试剂配制及实验步骤
Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤.doc
Western Blot( 免疫印迹法 )实验方法步骤发布日期 :2008-8-25热门指数:4360Western Blot( 免疫印迹法 )主要包括以下 4 个基本步骤：n样品制备n电泳分离n蛋白的膜转移n免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) nModified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate:0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn1X SDS样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8于25°C), 2%w/v SDS, 10% 甘油 ,50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝n转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸 , 20% 甲醇(pH 8.3)n10X Tris 缓冲盐(TBS)准备 1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; 用 1N HCl 调 pH 为 7.6n脱脂奶粉或 BSAn 甲醇n TBS/T 缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n封闭缓冲液（ TBS/T ）1X TBS, 0.1% Tween-20加5%w/v 脱脂奶粉或BSAn一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20加5% BSA(多抗 )或 5% 脱脂奶粉 (单抗 )Note: 一般来说 , BSA 被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n预染的蛋白质 Marker ，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
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western实验步骤
Western实验步骤
西方实验法（Western blotting）是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来检测目标蛋白在复杂混合物中的存在以及其相对丰度。
本文将介绍Western实验的步骤。
1. 样品制备
需要从细胞或组织中提取蛋白质。
可以使用细胞裂解液或蛋白质提取缓冲液来裂解细胞，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，使用离心等方法将细胞碎片与其他细胞组分分离。
最后，将得到的蛋白质溶液进行浓缩和纯化，以获得高质量的蛋白样品。
2. SDS-PAGE电泳
将样品中的蛋白质按照其分子量大小通过SDS-PAGE电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在加热后进行电泳。
电泳时，将样品注入凝胶孔中，并在电场作用下进行分离。
蛋白质在凝胶中的移动速度受到其分子量的影响，较小的蛋白质迁移得更远。
电泳结束后，用染色剂染色来可视化蛋白带。
3. 转膜
将电泳后的蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便进行后续的免疫检测。
通常使用半干法或湿法转膜的方法。
在半干法中，将电泳片与膜和吸收纸堆叠在一起，用电流将蛋白质转移到膜上。
在湿法中，将电
泳片和膜分别浸泡在缓冲液中，并通过电流进行转膜。
转膜完成后，可以通过Ponceau染色来验证转膜效果。
4. 阻断和抗体处理
为了减少非特异性结合，需要在膜上进行阻断处理。
常用的阻断剂包括非脂类干乳或BSA。
将膜浸泡在阻断液中，以阻断未结合的蛋白质结合位点。
然后，将膜与目标蛋白特异性的一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验的目的和样品的特点来确定。
将膜与抗体孵育一段时间后，用缓冲液洗涤膜以去除未结合的一抗。
5. 二抗检测
在处理完一抗后，需要使用与一抗来源物种不同的二抗来检测目标蛋白的存在。
二抗一般是与酶或荧光标记结合的抗体。
将膜与二抗进行孵育，并再次用缓冲液洗涤膜以去除未结合的二抗。
然后，使用适当的检测方法来可视化目标蛋白。
6. 结果分析
根据实验目的和所用的检测方法，可以使用化学发光、荧光成像或酶标记等技术来检测和量化目标蛋白的存在。
根据蛋白带的强度和位置，可以判断目标蛋白的相对丰度和分子量。
可以使用图像处理软件来分析和比较不同样品中目标蛋白的表达水平。
Western实验是一种常用的蛋白质分析技术，通过样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、阻断和抗体处理、二抗检测以及结果分析等步
骤，可以检测和分析目标蛋白在复杂混合物中的存在和相对丰度。
这种技术在生命科学研究中具有重要的应用价值。