噬菌体展示原理和实践：构架篇（上）
噬菌体展示技术的原理及应用
8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结 构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别 和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用 于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指 的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸 序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞 系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干 扰病毒感染插入的片段是从 某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片 段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可 利用M13 噬菌体或其他表 达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬 菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一 个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论 如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质 之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展 示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如 凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 αbungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域， 如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离 到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的 多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的 高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体 信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛 选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史
Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原 决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增 生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机 肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选 溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广泛应用的时代。
噬菌体展示技术及其应用.ppt
Lytic phages specifically kill pathogenic bacteria as an alternative to antibiotics
Example of a successful phage therapy treatment.
接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病 毒感染的抵抗力增强, 噬菌体能上调感染 病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清 α肿瘤坏死因子(TNF-α) 水平, 体外加入 噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-α和 白细胞介素6水平。IL-6 涉及Th2 型应答, 对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。 总之, 这些结果表明噬菌体能作为细胞和 体液免疫的天然佐剂。
In phage display, a heterologous peptide or protein is displayed on the surface of the phage through transcriptional fusion with a coat-protein gene ,producing novel phage particles that have a variety of potential uses.
目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌 体系统有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展 示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示 系统。
T7 噬菌体基因组由39936bp双链线性DNA组成，有 160bp 的突出末端。T7噬菌体衣壳蛋白通常有2 种形式， 10A（344氨基酸）和10B（397氨基酸），10B是在10A的341 个氨基酸的翻译框中产生的(translational frameshift)， 约占衣壳蛋白的10%，功能性衣壳或者由10A、或者由10B、 或者由10A和10B以一定比例构成，这说明T7衣壳蛋白能够 容纳变异体。独特的10B 衣壳蛋白区存在于噬菌体表面， 所以被用作噬菌体展示。不像丝状噬菌体系统，展示在T7 表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其 表面展示多肽和蛋白的范围广。T7展示系统可以高、中、 低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是目前最为理想的展 示系统。
详细叙述噬菌体展示技术的原理与操作流程
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噬菌体展示技术
噬菌体展示技术王浩11307110047摘要：噬菌体展示技术可以将目标蛋白与噬菌体衣壳蛋白结合在一起形成融合蛋白，进而展示于噬菌体表面。
该技术可以较好地保持被展示蛋白质的活性，因而在蛋白质研究中发挥着重要的作用。
目前用于构建噬菌体展示系统的载体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体。
这些系统不仅对构建cDNA 文库很有帮助，还可在随机短肽文库的协助下研究蛋白质之间的相互作用。
关键词：噬菌体展示技术；蛋白质；文库；类型；原理；应用1985年，美国Missouri大学的Smith G P首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程手段改造，他把EcoRⅠ内切酶的部分基因片段与丝状噬菌体的次要衣壳蛋白p Ⅲ(protein Ⅲ)基因融合，获得的重组噬菌体能被抗EcoRⅠ内切酶的抗体所识别，由此建立了噬菌体展示技术(phage displaytechnology)。
1通过近几十年的发展，噬菌体展示技术已经有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体等展示系统，这些系统在在新型疫苗的研制、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相互作用的研究等领域得到了广泛的应用，并显示了良好的应用前景。
1.噬菌体展示系统类型1.1.单链丝状噬菌体展示系统单链丝状噬菌体展示系统是利用了M13噬菌体独特的生命周期及其所表达的几个噬菌体蛋白质。
它的单键DNA基因组由6407个核苷酸残基组成，编码10种不同的蛋白质，并被包装于约有2700~3000个拷贝数的基因编码的蛋白质pⅧ的蛋白衣壳内。
而且M13的尾部有一种3~5个拷贝的基因编码的蛋白质pⅢ。
21.1.1.pⅢ展示系统（3~5个拷贝）pⅢ基因主要编码病毒的次要衣壳尾丝蛋白。
pⅢ的可插入位点很多，所以其为多价展示系统，但这样就会造成蛋白质的异促效应，不易筛选到高亲和力的噬菌体。
为了构建单价展示系统，人们将目的基因转入到噬菌粒（噬菌粒是由质粒与单丝噬菌体结合而构成的载体系列。
噬菌体展示技术的原理及应用
噬菌体展示技术的原理及应用将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合（插入信号肽与衣壳蛋白基因间）后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，每个噬菌体只含1个外源基因，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。
导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。
当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库（展示文库为流动相，被筛蛋白为固定相）时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体，研究该噬菌体所含外源基因的生物学功能。
技术发展噬菌体展示优越性1、将蛋白与其遗传信息之间提供了直接的物理联系，可有效的对所需功能的克隆进行反复筛选并扩增。
2、被展示多肽或蛋白结构功能与天然状态接近，可简便快速筛选得到与靶分子高亲和力的被展示物。
3、筛选过程中，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特意亲和性而不断的得到富集，从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速、有效地从一个大文库中被筛选出来。
4、与其它技术相比，容易对库容量较大的文库进行筛选。
噬菌体展示局限性：1、肽库容量受大肠杆菌转化效率影响，容量一般在109，高于此限制的较多基因将难以表达；2、编码多肽的基因带有一定的密码子偏爱性，限制了肽库的复杂度；3、噬菌体宿主大肠杆菌的生物合成系统有自身的限制因素，如缺乏氨基酸修饰、蛋白糖基化、不能合成D型氨基酸。
4、在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就限制了所建库的分子多样性。
5、不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。
应用范围肿瘤研究及药物靶向治疗诊断用疫苗研发酶抑制剂筛选构建抗体/cDNA文库研究蛋白质与核酸相互作用的生物学过程研究新型的基因导向系统Eg1：从HBx（肝癌相关抗原）单抗细胞中克隆重链可变区基因，重组入M13噬菌体，验证表达产物具有活性，然后表达出单链抗体、单域抗体或嵌合抗体，为肝癌导向治疗研究提供基础。
噬菌体展示技术的原理及其应用
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋 白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。
• pVIII (50aa, ~2700 copies) • pVI (112aa, 5~8copies)
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_artt1ex0t
载体的插入位点
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pIII 和pVIII 噬菌体展示系统
4
特点
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在 同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬 菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术 把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋 白将目的蛋白或多肽挑选出来。
5
Phages
•Filamentous phages
• The combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein
13
选择方法：
淘选（Panning)
而不是
筛选（Screening)
14
非展示系统
展示系统
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淘选系统 淘选方法
固相 完整细胞 组织，器官
常规法 正负法 竞争法
M13 Fd F1
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体
• 应用于血吸虫的研究 •
噬菌体展示技术诊断抗原
• 在细菌病原体检测中的应用
• 利用噬菌体抗体库技术，研究者可以在短期内筛选获得与 病原体抗原特异性结合的重组抗体分子，用于病原体血清 抗原的检测，达到早期诊断价值。 • Nathan等构建了1个针对热带病原菌(类鼻疽杆菌属)的人 鼠嵌合抗体Fab库, 并利用此库筛选出针对蛋白酶的克隆, 分析了其作为蛋白酶抑制剂的功能。 • Saldarelli等应用噬菌体展示技术建立了人源重组抗体库, 从中获得15株对B型葡萄病毒有特异性的重组ScFv 抗体。
噬菌体原理及淘选过程
噬菌体展示技术诊断抗原
• 在寄生虫病原体检测中的应用
• 应用于疟疾的研究 •
Lauterbach 等［6］使用人红细胞膜的疟原虫蛋白。这些蛋白可作为疫苗作用的靶点。 国内也开始应用噬菌体展示技术筛选抗原表位。用纯化 的日本血吸虫保护性单抗筛选噬菌体随机12 肽库，用筛 选出的阳性克隆能诱导小鼠产生高滴度的抗血吸虫特异性 抗体，并获得良好的减虫率和减卵率。
总结
噬菌体展示技术是一种简便、有效、易于控制 的用于表达外源基因的操作系统。目前，噬菌体 展示技术仍处于发展阶段。近几年来该技术显示 出非常好的实用性，之所以该技术能得到迅速发 展，其根本原因在于它可有效地实现基因型和表 现型的体外转换，使研究者可以在基因分子克隆 的基础上较准确地实现蛋白质构象的体外控制， 从而获得具有良好生物学活性的表达产物。 噬菌体展示技术还存在一些不足，但并不妨碍 该技术在生物医学领域的广泛应用和发展，尤其 在微生物病原体检测中发挥更大的作用。
噬菌体展示技术诊断抗原
• 在细菌病原体检测中的应用
• 利用抗体库筛选纯化后的SARS冠状病毒，鉴定了两株 特异性结合的抗体，这些抗体不仅可用于研制SARS冠状病 毒的检测试剂，在免疫预防研究中同样具有重要价值。 • 吴健敏利用T4噬菌体展示系统将猪瘟病毒E2抗原表达 于噬菌体衣壳表面，经Western blot和免疫电镜等检测， 证明展示的猪瘟病毒E2抗原融合蛋白具有免疫学活性。
噬菌体表面展示及其应用
Solid phase selection with immunotubes
Immunotube coated with antigen
coated with
steptavidin and
biotinylated antigen
B
v v
B
B
B
BB
B
Solution phase selection with biotinylated antigen
用于外表展示的噬菌体
• 3种常用于外表展示的噬菌体为 M13, F1 , FD• 利用病毒粒子外表蛋白构建多肽，每 个噬菌体能展示一个任意的多肽
噬菌体外表展示的筛选• 利用筛选技术能从 噬菌固定靶 蛋白/多肽
• 利用DNA测序的优 势，很容易就能鉴 定目的蛋白/多肽的 序列
感染 和扩增
E.coli
噬菌体抗体库的构建
Antibody IgG structure
Fab
VL
CL VH
CH1
Fc
CH2
CH3
Hinge
(Fab’)2
Membrane Extension
Fv
VL
VH
CL
CH1
CH2 CH3
VL
Fv VH
VL
scFv
VH
宿主细胞: 筛选范围 : 107 109 时间: 操作: 单
antigen biotin
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
去除未结合的噬菌体病毒粒子.
洗脱结合的噬菌体
Amplify eluted phage
Repeat selection
噬菌体展示技术PPT精选文档
3
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中
4
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
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噬菌体展示原理和实践：构架篇（上）前言前文概述了噬菌体展示在生物技术新药研发领域广泛的实践应用和价值，此文续接前文聊聊如何去搭建一个噬菌体展示平台以满足新药研发多方面应用，也就是平台构架的问题。
本文以上下两部分简略介绍噬菌体展示的平台构建包括文库的构建，噬菌体文库的扩增展示，淘选方法和筛选方法四个方面，包含信息原理要素，材料要素和过程要素。
一个运转流畅的噬菌体展示平台应该是以噬菌体展示技术各个方面的原理地正确理解为指导进行实践操作的结果，从文库构建到拿到确定有功能的特定的抗体可变区基因为止，每个环节都应该有其特定的目标，检测方法和质量评判标准。
概述噬菌体展示平台实践活动包括文库的构建，噬菌体的扩增展示，淘选方法和筛选方法四个方面，这四个方面是相互关联的，不建议在平台尚未运转流畅的状态下进行信息相对隔离的分工合作，这样会不利于问题的排查。
其中噬菌体的扩增和展示在其他三个方面均有涉及，此文相对于其他文献资料将其单列为一个方面的原因是强调其重要性。
文库的构建，淘选和筛选可简单的描述为以下三段话文库的构建将体外合成或者人/动物的多样化的抗体基因整合到噬菌粒载体或者噬菌体基因组中，使得该基因能够在噬菌体上表达，表达的抗体片段能够和外被蛋白融合得以锚定在噬菌体的表面，形成展示多样性抗体蛋白片段的文库。
淘选利用靶点抗原或者细胞组织和噬菌体文库作用，淘选出能够和靶点特异性结合或者功能的展示噬菌体，洗脱下来扩增，经过两到五轮淘选，富集和扩增阳性噬菌体文库。
筛选对阳性噬菌体文库进行单克隆挑选，通过高通量的测序和功能学实验（ELISA）确定单一的能够和靶点抗原蛋白结合的抗体片段的蛋白序列和基因序列。
文库的构建和噬菌体的扩增展示原理现在普遍应用的噬菌体展示抗体片段的体系称之为3+3体系，3为噬菌体的p3外被蛋白，3+3代表着p3外被蛋白有两个来源，噬菌粒（phagemid）和辅助噬菌体(Helper Phage)。
噬菌粒是一种比较小的质粒载体，在大肠杆菌感受态中有较高的转化效率，并且能够在大肠杆菌中扩增。
如下图所示多样化的抗体可变区基因片段可以通过酶切位点整合到噬菌粒中，并能够在成熟p3的N端融合表达，噬菌粒还包含lacZ启动子以调控抗体片段蛋白在大肠杆菌中的表达，以避免可能出现的抗体片段蛋白对大肠杆菌的毒性作用而导致多样性的丧失；抗性基因（通常为青霉素）以维持噬菌粒的筛选压力，His/myc标签为后续的可溶抗体蛋白片段的纯化和筛选检测做准备，amber 琥珀酸终止子在特定的大肠杆菌中终止表达以获得分泌型的可溶蛋白抗体片段。
常用的噬菌粒载体包括pHAL30, pHEN and pCANTAB等噬菌粒只能表达噬菌体的p3蛋白，该p3蛋白均融合了抗体片段，辅助噬菌体则提供了组装成完整噬菌体的结构蛋白包括p3蛋白，其感染包含噬菌粒的大肠杆菌以后，扩增出来的噬菌体其p3蛋白就有概率展示出抗体片段。
常用的辅助噬菌体有M13KO7，VSCM13，Hyperphage M13 K07ΔpIII等多种商业化的产品，选择的不同的辅助噬菌体融合蛋白在噬菌体上的展示效率是十分不同的，这个关键的信息往往也是被实验人员忽略的。
噬菌体一共有5个p3蛋白，有资料显示最为常用的M13KO7辅助噬菌体其包装出来的噬菌体有90%以上未展示抗体片段蛋白，剩余的10%也仅仅展示1个抗体片段蛋白，为单价态展示；与之相反Hyperphage M13 K07ΔpIII的辅助噬菌体因为敲除了p3蛋白，WB结果显示基本所有包装出来的噬菌体均能够展示抗体片段蛋白，而且基本上均展示3-5，为多价态展示；不同的克隆在相同的辅助噬菌体中有非常大的差异化的展示效率，这些复杂的因素都会对后续的淘选和筛选造成阻碍。
一个噬菌体文库中噬菌体是否均展示，是多价态展示还是单价态展示，会给淘选和筛选方案的设计和结果均会造成较大的影响。
1一般来讲单价态展示适合筛选得到高亲和力的抗体，而多价态展示能够得到更多的亲和力抗体但在筛选阶段其信号和亲和力的相关性较差。
文库构建的简单流程如下图所示，噬菌体文库的构建大致分为以下流程：1.从多个捐赠者的外周血或者淋巴组织中抽取总RNA或者mRNA；2.用随机的六碱基引物将RNA反转录为第一链 cDNA；3.设计多个引物组合从cDNA库中分别将轻链V片段基因和重链V片段基因复制扩增出来，注意引物的选择会对文库的大小和组份产生偏差性影响，根据B细胞的分化成熟进程，一般来讲针对IgM的引物可能更适合天然文库的构建，针对IgG的引物更适合免疫文库的构建；4.在之前的引物基础上增加酶切位点，再次扩增从cDNA库扩增出来的轻链V片段基因和重链V片段基因序列；5.利用overlap PCR 将轻链V片段基因和重链V片段基因序列拼接到一块，包含两者之间的连接的柔性（G4S）n的linker；6.将拼接好的轻重链整合到噬菌粒载体上；7.噬菌粒电转TG1感受态，扩增建立噬菌粒在TG1中的库；8.用辅助噬菌体感染在对数生长期含有噬菌粒的TG1，扩增和纯化得到噬菌体文库。
噬菌体文库的质量评价噬菌体文库的质量评价主要包括文库的大小，文库抗体可变区的多样性，抗体种系（germline）VH, Vκ和Vλ基因片段的频次分布等内容，通常通过带抗性的克隆形成实验，测序和高通量测序的结果来评判。
以下是几个较为出名和有特色的天然或者合成噬菌体文库的大小信息和文献2，3，4，各位读者可根据对应的文献信息对文库的质量评价体系进行了解学习，本文主要对对噬菌体文库的大小评估和多样性保持进行描述。
噬菌体文库大小一般来讲一个天然的噬菌体文库筛选得到的抗体其亲和力和文库的大小成正相关，要筛选得到亲和力为nM级别的成药性抗体其文库大小要大于1E10的数量级别。
噬菌体文库的大小是由噬菌粒电转到大肠杆菌感受态，在未扩增的情况在氨苄琼脂板上测得的克隆形成数目。
需要强调的是商品化的TG1感受态虽然标识的转化效率能够达到>1E10 cfu/ug, 该结果是在特定的质粒载体和10pg质粒电转感受态然后乘以1E5以后得到的数据，实践过程中，根据个人的经验由于单次电转TG1感受态细胞数目和电转后存活的限制，40ul感受态细胞电转最多能够得到的克隆数目在5E7-2E8/次，在噬菌粒的拼接和电转条件均优化较好的情况下构建一个1E10的噬菌体文库需要100次以上的电转。
噬菌体文库多样性保持文库的多样性一般是由高通量测序抗体重链的CDR3的测量结果来评判, 在重链CDR3的重复性非常小的前提下，文库的大小约等于文库的多样性。
相同的道理，包含噬菌粒的大肠杆菌通过感染辅助噬菌体后，扩增后得到噬菌体的数目也不等于文库的多样性，如何保持噬菌粒在TG1中的多样性传递到包装好的噬菌体中并以抗体片段蛋白的展示出来用于后续的淘选?这个需要对噬菌体包装的各个环节进行评估和计算。
如下图所示，笔者对一个文献记载的1.2E10大小的噬菌体文库其噬菌体的包装过程进行解析5，在计算之前需要知道的信息，对数生长期的TG1大肠杆菌1 OD600的菌数目是1E9个/ml, 辅助噬菌体有效的感染TG1大肠杆菌需处于对数生长期（OD600 0.4-0.8）,辅助噬菌体感染TG1的MOI一般为10~20：1。
该论文中将2.5L的TG1摇菌生长到OD0.5左右，其菌的数目是5E8*2.5E3=1.25E12，在辅助噬菌体感染前，如果保证多样性的不丢失，需要感染的TG1应该是文库大小的10倍以上。
鉴于M13KO17辅助噬菌体不到10%的展示效率，在保证噬菌体文库的每个抗体都有10-100个拷贝，在进行淘选时，input进去的噬菌体应该是文库大小的1000倍，即1.2E13。
后续此文为噬菌体展示原理和实践的第二篇，构架篇上部分。
噬菌体展示平台搭建的四个方面中文库构建和噬菌体文库的扩增展示相对联系更加紧密，并在一块进行讨论。
构建文库的大小和多样性需要通过文库的展示和扩增得以保持，需要根据已有的信息原理明确其中的多样性传递关系和选择何种辅助噬菌体进行展示。
其中以M13KO7辅助噬菌体为代表的单价态展示和以Hyperphage M13 K07ΔpIII为代表的多价态展示将深刻的影响后续淘选和筛选条件的选择，存在噬菌粒的TG1菌库可以选择性的用两种辅助噬菌体进行交替式感染将为后续的淘选方案增加更多的可能性。
实验的方案为实验的目的服务，在噬菌体文库的构建过程中如果实验目的需要筛选中和性抗体如（VEGF抗体），或阻断性抗体（PD-L1抗体）或者亲和力成熟，对抗体的亲和力有较高的要求，单价态展示是更好的选择；如果选择激动性交联抗体（如4-1BB抗体），双抗中的CD3抗体，靶点为线性表位多肽抗体，CART的CAR等需要选择合适的亲和力的抗体或者亲和力较弱的抗体时，多价态展示能够将蛋白间的相互作用由亲和力转变为多价态的结合力，筛选出更多的东西提供更多的选择。
噬菌体平台的筛选结果也许在选择辅助噬菌体的时候就已经决定了。
噬菌体展示原理和实践的第三篇，构架篇下部分将从原理和实践中聊聊可供选择的选择压力和如何选择合适的选择压力，设计和优化实验方案以得到满足目的的抗体基因序列。
待续！希望同行从业者彼此之间能够相互交流讨论磨砺技能，有意者可联系********************一起交流讨论成长进步，为从业者提供更为贴近实践的技术信息。
参考文献：1.Rondot S , Koch J , Breitling F , et al. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display[J]. Nature Biotechnology, 2001, 19(1):75-78.2.Tiller T , Schuster I , Dorothée Deppe, et al. A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties[J]. mAbs, 2013, 5(3):26.3.Lloyd C , Lowe D , Edwards B , et al. Modelling the human immune response: performance of a 10 11 human antibody repertoire against a broad panel of therapeutically relevant antigens[J]. Protein Engineering Design & Selection Peds, 2009, 22(3):159-68.4.Schwimmer L J , Huang B , Giang H , et al. Discovery of diverse and functional antibodies from large human repertoire antibody libraries[J]. Journal of Immunological Methods, 2013, 391(1-2):60-71.5.Mingqian F, HejiaoB, et al. Construction and next-generation sequencing analysis of a large phage-displayed VNAR single-domain antibody library from six naïve nurse sharks [J]. Antibody Therapeutics, Volume 2, Issue 1, 1 January 2019, Pages 1–11。