亲水作用色谱理论简介

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μM。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的PH值。但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的PH值会使硅胶溶解，太低的PH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在PH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法

固定相极性高～中中～低

流动相极性低～中中～高

组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。

3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的PH值和离子强度影响。PH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 MMOL/L 的离子对试剂，在一定的PH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其PH值、离子强度有关。

5．排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

色谱法的基本原理

利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。

两相中，固定不动的一相称固定相；移动的一相称流动相。

分类：

根据流动相分—以气体作流动相—气相色谱——固定相为液体气-液色谱

固定相为固体气-固色谱

—以液体作流动相—液相色谱——固定相为液体液-液色谱

固定相为固体液-固色谱

—当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱

根据固定相的附着方式

—固定相装在圆柱管中—柱色谱

—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱（平板色谱）

—液体固定相涂在纸上—纸色谱（平板色谱）

根据分离机理

—分配色谱—样品组分的分配系数不同

—吸附色谱—样品组分对固定相表面吸附力不同

—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开

—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同

根据流动相和固定相相对极性不同，液相色谱分为正相色谱和反相色谱。流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱。非极性键合相色谱可作反相色谱。在现代液相色谱中应用最广泛，现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的。

反相液相色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，反相液相色谱正受到越来越多的关．反相色语法是以表面非极性载体为固定相，面以比固定相极性强的溶剂为流动相的—种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水

基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于 300Å的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍，聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用．

反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大，对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(强)．溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80Å)的表面积约为250m/g，而300Å孔径载体的比表面积约为60m/g。当其他条件相同时，溶质在300Å孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为 80Å孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于强亲水性样品洗脱．样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度．在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值．固定相的不同也可以导致选择性发生变化，氰基、苯基、C8、C18等柱的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱．

反相条件下，大多数蛋白质由于低PH、有机溶剂存在、温度高于室温和疏水键合相等综合原因发生变性，这些化合物可能以两种或两种以上独立或动态平衡的形式存在，它们通过色谱柱的保留速度不同，导致谱峰展宽、变形、甚至出现单一蛋白有多个峰的现象，部分变性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼峰．反相色谱固定相表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大差异，烷基链越长(C8、C22、C30)，固定相疏水性越强，为使蛋白质等生物分子洗脱，流动相合机溶剂的含量较高，疏水性过强，会导致生物分子的不可逆吸附和生物活性损失，因此短链烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分离中表现出优势。对多数小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色谱柱分离，使蛋白完全展开并避免聚集或沉淀，能够得到理想的分离结果．

在低pH流动相条件下进行分离，如(0.1% TFA适合于大多数样品，10~25mmol/L磷酸对疏水性强的蛋白质更有利；以乙腈作有机溶剂，丙醇可能对疏水性强的蛋白质有利；柱温50~80℃；将样品溶于6mol/L尿素或盐酸胍中(只可在室温)进行预处理；用疏水性更强的键合相(长链与短链烷基键合相)；加两性表面活件剂分离大分子和疏水性强的蛋白质等实验条件有利于蛋白质样品完全变性或尽可能降低变性。