生物物理自由基医学

自由基和医学

一、自由基概念和基本特性

1.概念：自由基（free radical ) ：能独立存在的，具有不配对电子的原子、原子团、离

子或分子。

按照自由基定义，元素周期表中的过渡金属，除锌外，其它元素均属自由基, 他们的离子很多也是自由基。

2.电子在原子核外排布规则：

1 首先占据能量较低的轨道

2 每个轨道最多允许2个自旋方向相反的电子

3 在同能量的轨道有多个（不止一个）时，电子要首先分占不同的轨道，且自旋方向相同

3.基本化学性质：孤电子夺取或失去一个电子配成对

(1)活泼

(2)稳定自由基(取决于自由基的结构）

4.基本物理性质：（孤电子）顺磁性

电子顺磁（自旋）共振(SPR/SER)

(1)自旋-自旋状态用自旋角动量(M)描述－－指示自旋的大小和方向；电子自旋速度的大小

相同；电子自旋角动量的方向：无外加磁场时：方向任意；有外加磁场时：方向不任意，限制性取向（受量子力学限制只能取一些特定的方向）；电子自旋在磁场中所允许的方向由电子的自旋磁量子数ms决定（电子的自旋磁量子数ms=1/2,-1/2）；在外加磁场中电子将进行取向，电子的自旋方向只有2类允许方向。

(2)存在自旋的电子相当于一个小磁体(具有磁矩μ);外加磁场后，顺磁场与逆磁场的不成对电子具有不同的能量，此现象即为塞曼能级分裂;未加外部磁场时，物质所含孤电子的自旋（磁矩）是随机取向的，能量相同，物质净磁矩为零；加了外部磁场后，孤电子的自旋（磁矩）方向不是任意的了，自旋（磁矩）在外加磁场方向的投影大小受到限制，只允许1/2，1/2大小相等方向相反的两类，两类自旋的孤电子间存在能量差别。根据Boltzmann分布孤电子处于这两种自旋的几率也有差别。这样含孤电子的物质在磁场方向的净磁矩不再为零，此称为磁化（magnetization）;

(3)顺磁共振现象:在外加磁场中，孤电子发生了塞曼能级分裂，若此时向该体系施加某种频率v的电磁波，当电磁波的能量刚好等于塞曼分裂的能级差时：处于低能级的电子就会吸收能量跃迁到高能级——顺磁共振（电子自旋共振）现象。能量吸收信号可被检测纪录

顺磁共振现象发生的条件:孤电子（不成对电子），含不成对电子的物质(顺磁性物质);外加磁场；外加电磁波。

电子自旋共振（ESR）技术在生物医学中的应用：ESR技术对生物体系的研究按其方法学可分为三个方面：1：直接检测研究生物自由基（包括生物体内的自由基，过渡金属离子复合物）；2：借用自旋捕获技术检测研究生物自由基；3：使用自旋标记（探针）技术将适合的自由基物质（探针）引入生物体，通过探针的ESR信号研究无顺磁中心的生物体系。(4)自由基(自旋)捕获技术：生物体内能直接用ESR技术检测研究的自由基很少，因为体内绝大多数自由基的反应活性非常高，半衰期很短，使其浓度很低（10-8M- 10-10M），不能达到目前ESR技术的检测水平（10-6M -10-7M），解决这一困难的重要方法之一是自由基捕获技术。

特异自旋捕获剂：捕获某种特殊自由基，所形成的自由基加合物有特异ESR谱。

通用自旋捕获剂：可捕获任何自由基，典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基，通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感。

举例说明：体内原位实时监测NO

NO是目前认识到的生物体内最重要的自由基，它能松弛平滑肌，阻止血小板粘着，参与神经细胞传导，近年来又发现了NO与线粒体存活与凋亡之间的关系，能够原位实时监测NO的生成具有重要的意义。但基础生理情况下，NO的生成量很小，很难进行定量监测，这一问题因为二十世纪九十年代中期发现了较理想的NO的捕获剂，在体监测NO有了重大突破。其一的捕获剂为N-甲基葡萄糖胺（N-methyl-D-glucosamine, MGD）-铁复合物，（MGD）-Fe（Ⅱ）与NO发生螯合作用，处于螯合物中的NO稳定性大为增强，室温下给出氮氧化2

物三线的ESR谱。如果把组织暴露于外源性富含铁硫的复合物，NO的自旋捕获效率会被大大加强。

应用举例：NO成像

硝基化合物有舒张血管的作用，长期以来一直用它治疗心绞痛和充血性心力衰竭，硝基化合物的血管舒张作用主要是由它所释放的NO引起，自由基成像技术研究血管舒张药物所产生的NO在体内的分布。自旋捕获剂：Fe-DTCS[Fe 与N-(dithiocarboxy)sarcosine的复合物] ，将自旋捕获剂经皮下将其注入大鼠体内，30分钟后再皮下注射[14N]ISDN或[15N]ISDN，Fe-DTCS将捕获ISDN释放的NO形成自由基加合物[NO-Fe(DTCS) 2]2-，动物麻醉后就可放入谐振腔中记录ESR 谱，施加空间梯度磁场后就可得到自由基成像。

(5)自旋标记技术：将某些含孤电子的物质——自旋标记物（spin labels）连接或掺入到那些本身不具有不成对电子的物质体系中，所纪录到的自旋标记物的ESR谱能反映与其连接或临近的本身不具有不成对电子的物质体系的某些性质，使得本身不具有不成对电子的物质体系也可用顺磁共振技术研究现象，此即为自旋标记技术。许多重要的生物大分子如脂、糖、蛋白等本身并不含有顺磁中心，正是依靠自旋标记技术，才能够用EPR进行研究获得了关于生物大分子结构、功能等很多信息。自旋标记技术极大地扩展了EPR技术的应用范围，为EPR 技术的发展作出了重要贡献。

自旋标记物（spin labels）：第一个稳定的化学自由基氮氧化物特点:

(1)，它的不成对电子被几个甲基基团遮蔽，使其它物质不易接近，因而该自由基比较稳定；

(2)，它的EPR 谱比较简单；

(3)，该自由基的EPR 谱对环境非常敏感，谱线的形状与其周围环境的粘度、极性、结构密切相关；

(4)，它是小分子物质，引入其它体系后不会给原体系带来多少影响。由于具备上述特点，氮氧化物是较理想的自旋标记物。

应用举例：

报告膜的流动性：将自旋标记物加入到膜脂悬液中时，一部分标记物进入膜内，另一部分则留在液相，进入膜内的标记物与留在液相的标记物所邻环境十分不同，二者的ESR谱存在差异。

(6)EPR血氧定量法：

氧分子本身是顺磁性物质，溶解入血液的氧分子能对引进体内的顺磁物质（探针）的弛豫时间产生很强（通常可逆）的影响。弛豫时间会随着报告分子环境中氧浓度的增加而增加。EPR血氧定量法是基于氧分子由于有两个未成对电子而本身是顺磁性物质，而且具有很快的弛豫时间变化率。它会通过Heisenberg自旋交换相互作用给其他自旋型物质施加弛豫影响。因此，养的存在影响自旋探针的自旋-晶格和自旋-自旋弛豫时间(t1和t2)。另外，氧浓度的增加可以增加EPR谱线宽度，降低超精细结构的分辨率，而且也会降低EPR吸收线出现饱和时的微波能量。这些指标都可以由EPR检测到。

氧效应：

受照射的组织、细胞或生物大分子的辐射效应随周围介质中氧浓度升高而增加，这种现象称为氧效应(oxygen effect)。氧效应是放射生物学和放射肿瘤学中的一个重要问题。

氧效应的确切作用机理尚不完全了解，而且看法也有不同，但认为氧作用在自由基上这一点是一致的。

肿瘤化疗与氧气：

较大的肿瘤组织往往新生自己的血管，而且中心肿瘤细胞发生死亡，周围细胞则可以得到充足氧气供应。在中心和周围之间是氧供应不足的肿瘤组织，但仍保持存活。对于这类肿瘤的化疗对于周围特别有效，因为充足的氧气可以有助于形成肿瘤性的ROS。氧供不足的中心则会受到较小程度的损伤。中心的死细胞无论如何已经不会再生存，中心和周围之间氧供不足但仍然存活的细胞可以在安全剂量的放疗下仍然生存，因此在放疗之后会看到局灶性的复发。这就是很多较大的肿瘤需要把手术切除和放疗结合起来的主要原因，手术切除就是要切除可能放疗无法杀死的危险细胞。

特定的化疗与氧气：

组织氧气是按比例分布的，因此充足氧气供应的组织更容易使药物进入。除此之外，有些有些化疗药会对富氧细胞产生不同的缺氧毒性。这个特性可以被利用到化疗中，通过对肿瘤的缺氧细胞使用选择毒性的药物，从而在缺氧环境下产生毒性产物。

二、体内自由基的来源

自由基可以由外源性物质产生，也可能是体内代谢过程的副产物。

1.氧自由基和活性氧

氧自由基(oxygen free radical) :

超氧阴离子（superoxide anion radical, ?Oˉ2）

羟自由基（hydroxyl radical,?OH）

烷氧基(alkoxyl radical, R- O?)

烷过氧基（alkylperoxyl radical, R- O O?）

过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）

单线态氧(singlet oxygen，1?gO2 )

活性氧（ROS, reactive oxygen species）=氧自由基＋过氧化氢＋单线态氧

2.活性氮（reactive nitrogen species, RNS 或reactive nitrogen oxide species, RNOS）是NO 及其在体内的一系列氧化产物

一氧化氮（nitric oxyde, ? NO)

二氧化氮(nitrogen dioxyde, ? NO2 )

亚硝酸(nitrous acid, HNO2 )

三氧化二氮(dinitrogen trioxide, N2O3 )

过氧亚硝酸(盐) (peroxynitrite, ONOO ˉ)

烷过氧亚硝酸(盐) (alkyl peroxynitrites, ROONO)

硝酰基阴离子（nitroxyl anion, NOˉ)

3.自由基的产生：

(1)外源性物质生成：日光，其他形式的射线，污染

ionizing radiation(电离辐射)-电离辐射放射线在靶分子内产生电离，在物质吸收能量后一系列复杂的变化导致不少化学键断裂，自由基离子及自由基都可以破坏正常分子结构而使生物靶受伤；如没有氧存在，很多被电离的靶分子可自行修复，如果有氧存在，氧就与自由基R作用而产生有机的过氧化物自由基R00。R00 是靶物质的一种不可修复的形式。从这一意义而言，氧可以被认为能“固定”放射损伤，这就是所谓的氧效应。-辐射病sunlight(日光)-200-800nm,不同波长的光具有不同的能量，诱发不同的生物学效应；315-400 ultraviolet A,能穿过表皮达到真皮，一般不会引起严重的皮肤改变，但能增加因紫外线照射引起的光致损伤，并诱发光敏化作用；280-315 ultraviolet B,它被皮肤的角化层吸收，具有很强的生物学作用，抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，扰乱有丝分裂，造成皮肤烧伤，诱发皮肤癌等。但另一方面它也是合成维生素D不可缺少的光源；短于280 ultraviolet C,它的穿透力很小，具有和UVB类似的生物学作用。在实验中常用人工光源产生。UVA和UVB 照射产生自由基是通过内源性的光敏感性分子吸收质子来实现的，主要有两种途径：Type 1,光解离，激发分子将吸收的能量转移到一个特别的键上，结果产生键的断裂,这种作用称解离，解离的结果是产生自由基，但有时也可以产生稳定的分子；Type 2 电子转移反应，光合作用过程中叶绿素a和醌分子间的电子转移属于这种情况。这种自由基的产生与皮肤癌症，光毒性，光造成的老化相关。

Cigarete smoking(抽烟)-焦油和气体可以产生不同类型的自由基。焦油中的自由基可被SER 直接检测到；气体形式中的自由基不能被直接检测到，需使用自由基捕获技术。

Pollution(污染)-烟雾中主要含有NO,也是主要的活性氮，异戊二烯是烟雾中一种反应性二烯。NO对生物体的作用相对较小，但是在空气中可以缓慢转化为对生物体影响更活跃的NO2。

(2)代谢过程副产物：

氧气的重要作用

除了一些厌氧或者耐氧的物种，所有有机体都需要氧气通过电子传递链去有效的产生能量，并把氧气作为最终的氧气供体，比如说真核生物的线粒体中还有很多细菌的细胞膜中。然而，氧气重要的作用让我们忽略了氧气也可能是有毒，致突变的气体，而且有很危险的致病效应。

1，xanthine oxidase(XO) 黄嘌呤氧化酶

O2-的一个生物性来源是黄嘌呤氧化酶，经常被研究者作为氧自由基的来源来使用。

XO

黄嘌呤＋O2 ＋H2O -- 尿酸＋?O2–＋H2O2

黄嘌呤氧化酶是由组织缺氧后再灌注时黄嘌呤脱氢酶通过蛋白水解切割或者可逆的活性硫

醇的氧化产生的。正常時，内皮细胞中主要以黄嘌呤脱氢酶（XD）形式存在。缺血時，细胞Ca2+浓度增高，使该酶由还原状态XD成为氧化状态XOD。这两种类型酶虽然都降解黄嘌呤，但脱氢酶XD以NAD+为电子受体，氧化酶XOD以O2为电子受体。缺血時细胞中ATP 减少导致AMP增加，后者分解生成次黄嘌呤。次黄嘌呤也是XOD底物。再灌注时，提供O2，因此?O2–大量生成。机体整体性（或局部）较长时间缺血，经输血或输液治疗（再灌注），组织细胞出现缺血后再灌注损伤(post ischemic reperfusion injury)。损伤机制与自由基过量生成密切有关。XD-XOD转换也可以发生在内皮细胞对细胞因子的反应时。

2 ，Neutrophil NADPH oxidase中性粒细胞NADPH氧化酶

NADPH氧化酶是一类分布在来源于中胚层的各种细胞质膜上的酶，在许多功能不同的细胞中，该酶的活性都有表达, 功能广泛。

在吞噬细胞中，NADPH氧化酶的质膜部分为一不寻常的黄素细胞色素b，由于血红素还原态的吸收峰在558nm，故得名细胞色素b558，又由于其还原电位极低，中值为－245V, 又称细胞色素b245。酶的另一部分位于胞浆。O2还原为?O2－。经超氧化物岐化酶作用后，便形成H2O2 。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶催化了生成反应, 该酶的功能就是对O2进行单电子还原，产生?O2－。戊糖旁路生成的NADPH为电子供体。

呼吸爆发(respiratory burst)：

白细胞接受刺激或吞噬病原体后，氧消耗突然增加，称为呼吸爆发(respiratory burst)。中性粒细胞呼吸爆发时耗氧量比静止时增加10－20倍，巨噬细胞增加得略少些。呼吸爆发時胞内糖原消耗增加，但不被氰化物抑制，说明其能量来源与线粒体电子传递无关，是经过戊糖旁路代谢供给能量,戊糖旁路生成的NADPH为电子供体。呼吸爆发与杀菌机制密切有关。呼吸爆发时，质膜上的NADPH 氧化酶产生?O2－，继之形成H202，次氯酸(hypochlorous acid), ?OH，单线态氧甚至ONOO －等氧化剂，起到杀菌作用。HOCl 是中性粒细胞产生的杀菌力最强的非自由基类氧化剂。许多种病原体都能被MPO(髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）) / H2O2 / C1ˉ 体系杀灭。细菌的敏感部位，如铁－硫蛋白、膜运输蛋白、ATP生成系统以及DNA合成与复制部位等都对HOCl敏感。嗜酸性白细胞中含有嗜酸性过氧化物酶，其相应的产物是次溴酸(HOBr) 。次溴酸也有杀菌力。细胞接受刺激或进行吞噬后，中性粒细胞爆发式耗氧，产生·O2–，H2O2 ，HOX。

慢性肉芽肿（CGD）：

慢性肉芽肿性疾病是一组吞噬细胞不能表现出呼吸爆发的遗传性疾病。2／3患者因X染色体上负责编码白细胞膜细胞色素有关蛋白质的基因突变而致。吞噬细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶缺乏或活力降低，CGD患者的白细胞有吞噬动作，因NADPH氧化酶缺陷不能产生?O2－,因而细胞能吞噬而不能杀菌，特别是不能有效杀灭被氧化产物所破坏的细菌如金黄色葡萄球菌和假单胞菌属。实验室杀菌试验显示粒细胞杀菌能力明显降低。男性患儿多在2岁内起病，反复发生严重的难以治愈的感染，皮肤、肝脾、肺部等受累组织可见炎症迁延不愈伴肉芽肿、纤维化形成。患儿常因严重感染（包括霉菌在内）而死亡。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症

G6PD是生成NADPH所必须的。NADPH水平降低则不能满足形成?O2－的氧化酶的需求，中性粒细胞的呼吸爆发功能不全，所以其临床表现常类似于慢性肉芽肿性疾病。当G6PD活力小于正常1％时，杀菌功能有明显障碍。

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）缺乏症

系常染色体隐性遗传，为遗传性粒细胞功能障碍中最常见的。这类患者粒细胞最终能杀灭细菌，但杀灭细菌的时间延长。因而大多数患者并无明显的临床症状。仅易有念珠菌属感染，特别是伴有糖尿病者。

3，细胞色素P450 , endoplasmic reticulum胞浆内内质网

细胞色素P450是肝细胞光面内质网的主要膜蛋白（约占其光面内质网的膜蛋白的20%）1953，最早发现细胞中含有氧化有毒物质的酶系, 该氧化酶系统类似一条呼吸链，由几个成分组成，核心成员是细胞色素P450，这些酶主要起到药物和其他外源性化学物质解毒作用，以及脂肪酸和类固醇的氧化作用。光面内质网的一个独特功能就是能够对外来的有毒物质如农药毒素污染物进行解毒，多数解毒反应与氧化作用有关。使毒性物质由脂溶性转变成水溶性（羟基化）而被排出体外。许多外源性无毒物质，经过肝细胞内质网中细胞色素P450代谢活化后，形成活性中间产物，这一类活性中间产物往往是自由基或带电物质，它们能与生物大分子结合，或引起脂质过氧化，或破坏代谢过程，导致细胞损害或死亡。细胞色素P450系统是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶。包括NADPH-细胞色素P450 还原酶黄素蛋白、细胞色素P450及NADPH。该酶通过单电子还原反应，一方面催化内源性底物反应调节代谢，又一方面活化某些外源性物质，生成亲电成分（包括ROS 等），攻击胞内大分子，损伤细胞，因此，P450系统又称万能的“酶杀手”。

O2-可通过细胞色素还原的p450氧化性复合体的解离，以及细胞色素p450还原酶的自我氧化产生。

CCl4的肝细胞毒性机制就在于它进入细胞后，经P450系统代谢活化，形成?CCl3，后者可与氧结合，形成三氯甲基超氧自由基CCl3– OO?。CCl3– OO?启动脂质过氧化。

许多药物的副作用也与P450系统的作用有关。例如，解热镇痛药扑热息痛可引起严重肝损伤，其原因是它经细胞色素P450系统代谢后形成一种半醌自由基（N－乙酰对苯醌亚胺），后者可致肝坏死。

阿霉素族的药物是有效的抗癌药，但是由于它们的严重副作用使得患者不得不中断治疗。产生副作用的原因就是该药经过P450系统以及其它还原酶还原为半醌自由基，后者再与分子氧反应生成·O2–。反应可再继续进行下去，学者认为通过Haber－Weiss 反应生成··OH，后者启动脂质过氧化。或者半醌自由基直接还原Fe3+,然后启动Fenton反应，生成·OH。也有学者提出，阿霉素与Fe 2+ 形成鳌合物，该鳌合物是脂质过氧化的有效启动剂。

4，氧化磷酸化

呼吸链是由存在于线粒体内膜上的众多酶系和其它分子组成的电子传递链。

（1）复合物I NADH—Q还原酶，催化NADH的2个电子→辅酶Q

（2）复合物Ⅱ琥珀酸—Q还原酶，催化电子从琥珀酸通过FAD和铁硫蛋白传至辅酶Q （3）复合物Ⅲ细胞色素还原酶，催化电子从辅酶Q传至CytC（细胞色素C）

（4）复合物Ⅳ细胞色素氧化酶，将电子从CytC→氧。

需氧生命所吸入的氧分子，在细胞线粒体电子传递链, 在酶的催化下，连续接受4个电子，进行完全还原，最后成为水。该反应实际上是单电子过程,O2即相继接受4个电子，分别形成?Oˉ2、H2O2、?OH 和H2O。在健康的机体中，97－99％吸入的氧就是在线粒体电子传递链被完全还原成水，其余1％～3％的氧被不完全还原，产生了?O2— ,尔后又有了H2O2, ?OH 等中间产物，形成自由基。尽管比例少，但产生的自由基数量仍然十分可观。

5，Haemoglobin and myoglobin血红蛋白和肌红蛋白

血红蛋白和肌红蛋白的氧化可以被NO2-或一些金属离子特别是铜离子所加速。在很多乡村由于大量使用无机肥料使得水中存在过量的氮自由基，从而导致婴儿疾病。水中的NO3-被肠道细菌还原为NO2-，继而被吸收后引起大量甲基血红蛋白的生成从而干扰组织氧化（婴儿青紫综合症）。这种情况会因为新生把甲基血红蛋白转化为血红蛋白的能力较弱而加剧。阴离子可以结合在甲基化的蛋白上，而不能与还原形式相结合。为了防止由于甲基血红蛋白的生成而导致携氧能力的下降，红细胞中的甲基血红蛋白还原酶可以是血红蛋白再生。

6 ，autoxidation of small molecules小分子的自体氧化

thiols巯基化合物

flavins黄素类

quinones醌

Catecholamines儿茶酚胺类

pterins蝶呤

缺血的细胞内，许多小分子（如呼吸链中的醌类物质，黄素等）处于还原态，再灌注时，O2 进入，处于还原态的小分子自氧化，因而产生氧自由基，如醌自氧化为半醌自由基。

缺血时，儿茶酚胺大量分泌，通过交感末梢和血液循环供给心脏及其他器官。儿茶酚胺降解時，伴有ROS生成。由于缺血時心、脑和肾上腺中儿茶酚胺消耗增加，由苯丙氨酸迅速合成以补充，在合成过程中亦伴有?O2–生成。

7, Transition metals, Fenton reaction and ROS过渡金属，Fenton反应和ROS

1894年，Fenton首次报道有机化合物酒石酸被铁盐与H2O2系统氧化。约130年来，一直在讨论反应机制。最可能、最重要的产物是羟自由基? OH生成。在反应体系中任何有机物都会受到?OH 的攻击。

?OH是攻击性极强、与生物大分子反应速度极快的氧自由基（半衰期1纳秒）。机体内尚未发现清除?OH的酶系。

体内有丰富的铁（常见的有两个氧化数Fe2+ 与Fe3+ ），H2O2可来自吞噬细胞及相应的酶对?O2 ˉ 歧化而生成，因此有可能在体内生成?OH。因此机体内有无可被利用生成?OH的游离铁？体内是否有Fenton氏反应? 一直受到关注。肝实质细胞平均体积＞10 - 12 L，因此每个肝细胞每秒生成?OH 的数量是46个，因此体内Fenton反应不可忽视，而且过量铜危害比铁还大（如Wilson氏病）。-Wilson氏病又称肝豆状核变性，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，其临床表现和病理改变是由于铜在许多组织中过度积聚造成。所致为肝硬化和脑变性疾病。它同时可以引起肾脏、心脏、皮肤、内分泌、胰腺、骨关节等组织器官的损害。该病最常见首发症状为儿童肝病, 包括慢性肝炎、急性肝功衰竭和伴有神经精神症状的非活动性肝硬化等。

氧化还原活性金属与AD(阿茨海默症)

患有AD的病人，在AD损伤的海马区，大脑皮质区和基底核以及有铁的大量累积，解剖的AD脑中老年斑和NFT Aβ可以显示羧基内收形成，组氨酸丢失，二酪氨酸交联的氧化修饰，导致这个蛋白水溶性降低，而且也不易被蛋白酶体降解。evidence show that trace levels of zinc, copper, and iron are initiators of an amyloid-β1–42-mediated seeding process and amyloid-β oligomerization and these effects were abolished by chelation of trace metals.证据表明锌，铜和铁是Aβ1–42介导的种植过程和Aβ寡聚化的促发因素，而且这些离子的螯合可以阻断这些过程。

铁是体内含量最多的过渡金属。成年男性体内平均有 4 g，女性有3 g。食物中的铁被吸收后入循环，与运铁蛋白(transferrin)结合。运铁蛋白通过细胞表面相应受体将铁带入细胞。入胞后或被利用，或转至铁蛋白储存, 运铁蛋白，铁蛋白中的Fe为三价，化学较稳定。机体中铁元素结合在百余种蛋白中。这些蛋白包括传递氧的蛋白，合成蛋白质与核酸的蛋白，进行氧化磷酸化及合成能量的蛋白，促生长与促生殖的有关蛋白等。其中2/3的铁集中于红细胞血红蛋白,血红蛋白与肌红蛋白所含的铁为二价铁Fe2+,与吸入的氧结合后仍为二价(在生理情况下不存在高铁(met-)血红蛋白) 。运铁蛋白系一糖蛋白，每分子蛋白有两个铁结合位点。乳运铁蛋白也有两个铁结合位点。在一般情况下，运铁蛋白只有30％负载铁，因此血浆中几乎无游离铁。此外，运铁蛋白在pH＜5. 6、乳铁蛋白在pH＜4.0 时才释放所携带的铁。因此，一般情况下这些蛋白螯合的铁不起催化?OH生成作用。每个铁蛋白分子可结合4500个铁离子。这些蛋白与铁的结合常数达1036，且部分饱和。铁主要存储于铁蛋白中，其中铁为三价Fe 3+。铁蛋白的还原电位极低，难以被胞内还原剂还原，Fe －蛋白复合物

稳定。因此，机体内无游离铁可利用。在一定的实验条件下，血红蛋白与H2O2反应生成?OH，并能直接损伤生物大分子及引起脂质过氧化。有趣的是血红蛋白被限局在红细胞内，红细胞含有丰富的抗氧化酶系。因此，血红蛋白中的铁在正常情况下难以用来启动Fenton反应。结论：健康机体在十分严密地控制游离铁。上世纪80年代初，Gutteridge等用博莱霉素测定体液中的游离铁。在痕量铁盐存在時，博莱霉素使DNA降解。博莱霉素－铁－氧复合物与DNA呈特异性反应，抗氧化剂几乎不能干预。对DNA校准后，加入博莱霉素可检测各种体液中的铁，且敏感性极高( 5 μM)。结果表明，健康人血浆、血清及尿液中几乎无游离铁，但在汗液、脑脊液和部分关节炎患者的关节腔液中可检测到少量铁。控制游离铁浓度, 可能是机体抗氧化机制重要的一环。

8, reactive nitrogen species 活性氮

NO (nitric oxide) 是气体。一直认为它是氮燃烧时所形成的大气中的普通污染物之一，对机体有害。发现哺乳动物细胞合成一氧化氮并用做主要的转导分子使自由基的研究发生了巨大的转变，导致了眼下的观点——自由基不仅仅带来机体损伤，也参与细胞的正常生理功能。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)

1968年被McCord和Fridovich发现，其功能是移除细胞中的?O2 ˉ 。迄今为止，除

?O2 ˉ外还未发现SOD的其它底物，因此认为SOD对清除?O2 ˉ 是特异的酶。真核细胞系统主要有Cu –Zn-SOD和Mn -SOD，原核系统主要有Fe -SOD。

Nos-NO合酶

c NOS活性受Ca2+ 信号途径激活（刺激- Ca2+ 通道开放- Ca2+ 增加- Ca2+ 与CaM结合-cNOS 激活），是Ca2+/CaM 依赖性酶，当c NOS被激活时合成NO。受Ca2+ 信号动力学的影响，酶被激活迅速短展，在相关细胞中产生的信号同样迅速短暂.

iNOS在静止细胞不表达，在活动细胞表达（当细胞受内毒素或细胞因子等刺激后），表达后一直活跃而不需Ca2+ 信号途径激活，NO生成滞后于细胞受到刺激一段时间，合成的NO数量是构建型表达产物的1000倍，能持续维持数小时至数天，取决于iNOS依然存在否，合成NO产生长时的细胞效应。

NO与鸟苷酸环化酶(GC) 的血红素基结合，使GC活化，出现GTP ---→cGMP，再激活各种下游反应，这是NO的主要生理性信号途径，诱导血管壁平滑肌细胞松弛。

免疫系统在受到感染时激活，?O2ˉ大量产生，并行的有由iNOS生成的NO

NO + ?O2ˉ ----→ONOO ˉ

产物为过氧亚硝基(peroxynitric, ONOOˉ)

作为自由基，NO 与?O2ˉ相对来说都不很活泼，但二者的反应很快, 生成的ONOOˉ虽然不是自由基，但ONOOˉ/ONOOH为一强氧化剂，一般认为NO严重的细胞毒性作用就是ONOO ˉ介导的.(在生理情况下，?O2－浓度常常低于n mol/L, 而NO浓度一般为μ mol/L，因此在正常组织细胞中不会有多量ONOO－)。学者们发现巨噬细胞生成的NO对于真菌、细菌、原虫和病毒都有很强的杀伤力，对于利- 杜体，弓形虫和分支杆菌的杀伤力可能比经典的呼吸爆发更有威力。NO在免疫，炎症细胞中能发挥杀灭病原体中的作用，源于NO 的细胞毒性作用，可能与下列二个因素有关：（1）NO能与生物系统中产生的超氧阴离子相互作用生成一种强氧化物即过氧化亚硝基化食物，它是一种自由基且足够稳定可扩散到其他细胞并造成显著的细胞损伤，（2）NO可引起核酸的硝基化反应可使DNA断裂.(因此NO的慢性病理性合成可能是一个致癌性的细胞转化危险因素)。

败血性休克(septic shock)

细菌感染导致的败血性休克(septic shock) 是监护病房的主要死因之一,其病因是白血球的诱发性一氧化氮合成酶(iNOS)制造一氧化氮来消灭细菌.但由於诱发性一诱发便不可收拾,

结果制造过度大量的一氧化氮,而使血管扩张,造成血压下降. (这时可用一氧化氮合成酶抑制剂NMLA 或L-NAME 来治疗,以抑制一氧化氮的大量制造).

氧化应激：由于内源性或外源性因素的刺激，使机体（或局部）自由基生成过多，并超过抗氧化系统的清除能力，或抗氧化系统受损伤，其清除自由基能力减弱，抑或外源性氧化剂的过量摄入，使机体（或局部）氧化/ 抗氧化之间的平衡被破坏，倾向于氧化反应增强的方面，导致自由基在体内（或局部）堆积，出现了细胞毒性过程。这种情况是氧化应激（oxidative stress）。氧化应激往往与组织缺血性损伤、创伤、感染、疾病（特别是动脉粥样硬化症，神经系统变性性疾病等）、金属与毒物中毒等病理情况伴行，造成组织、细胞与生物大分子损伤，并且加重病势。

三、针对自由基的防御

1.最简便的防御形式：尽可能减少O2吸入

2.可以催化减少RS的物质比如SOD, SOR,过氧化氢酶，过氧化物酶。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)

1968年被McCord和Fridovich发现，其功能是移除细胞中的?O2 ˉ 。迄今为止，除

?O2 ˉ外还未发现SOD的其它底物，因此认为SOD对清除?O2 ˉ 是特异的酶。真核细胞系统主要有Cu –Zn-SOD和Mn -SOD，原核系统主要有Fe -SOD。几乎所有红细胞都有Cu -Zn-SOD，含量丰富。在动物细胞Cu -Zn-SOD主要存在于胞浆中，溶酶体,过氧化物酶体，核，线粒体内外膜之间也有一些过氧小体。原核细胞也有Cu -Zn-SOD，经常存在于细胞壁和细胞膜之间的空隙中（periplasmic space）。Mn –SOD广泛存在于细菌，植物和动物中。在动物组织和酵母中，Mn –SOD通常全部位于线粒体基质中( 线粒体内、外两层膜间含Cu -Zn –SOD)。

超氧化物还原酶Superoxide Reductases(SOR)

在厌氧和微小的嗜氧细菌中，SOR被用来清除?O2 ˉ

?O2 ˉ + NADH +2H+ ----→H2O2 + NAD+ (NADPH)

基因组学研究表明SORs可能在缺乏SOD的厌氧菌中存在。

过氧化氢酶(catalase)

多数需氧生物含catalase，多数厌氧生物不含catalase。在哺乳动物，过氧化氢酶存在于各器官中。肝及红细胞中最丰富，脑、心脏及骨骼肌中含量较少。动物植物细胞的catalase activity基本上见于由单层膜围绕的细胞器微体中，该细胞器由此又得名过氧小体(peroxisome)。

谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）

GSH-Px 催化过氧化氢或有机过氧化物还原为相应的醇，同时将GSH 变为GSSH。GSH-Px 含有微量元素硒Se。动物中G-Px 分布广泛，植物和细菌中不常见。由于GSH-Px 的作用，使GSSG增加。但在正常细胞中，GSH/GSSG比例高而恒定，因此有一种机制使GSSG还原为GSH，这便是谷胱甘肽还原酶（GSH-Rx）。因此，足够的NADPH亦为维持机体抗氧化机能所必需。NADPH由磷酸戊糖途径提供。葡萄糖－6－磷酸脱氢酶与6－磷酸果糖脱氢酶均使NADP＋变为NADPH。

3, 被RS优先氧化的用来保护其他重要分子的物质

维生素E (α－生育酚，αT-OH)

脂溶性，能与各种自由基快速反应。αT-OH 是烷氧自由基的主要清除剂。上世纪90年代以来人们认为反应性质是H原子转移，形成色满氧自由基(chromanoxyl radical，αT-O?)。

αT-OH + ?A－---→αT–O? + AHˉ

αT-O?可被抗坏血酸有效地恢复为αT-OH，后者形成抗坏血酸自由基（见后）。其它抗氧

化剂如尿酸、神经细胞中高浓度的5-HT,泛醌等也能将其恢复为维生素E。在无适当电子供体的情况下，αT-O?便进行第二次氧化，经过一个中间反应物变成8α－羟生育酮。8α－羟生育酮可因无还原剂而在H＋或OH－作用下，色满环打开变为生育醌。

维生素C ( 抗坏血酸, ascorbic acid, AH2)

大量离体实验证明，抗坏血酸能与多种自由基起反应，如能对抗ROS 与RNS 损伤（如?02－，H0?）,还能与烷氧基（R-?O ）和以碳为中心的脂质自由基等反应，最后生成抗坏血酸自由基(?A－) 。

A H2 +?O2— ----→?A－+ H2O2

由于在急性风湿性关节炎、呼吸窘迫综合征等患者体内发现抗坏血酸水平降低,推测抗坏血酸因清除炎症時被活化的吞噬细胞生成的大量自由基被消耗。有些学者甚至用ESR检测?A－信号的强度来判断病情。

有些学者认为AH2的主要生理作用是通过电子转移使维生素E自由基恢复还原活性。此外AH2也涉及硫醇的修复(见后)。

?A－是一个不甚活跃的自由基, 后者可通过相应酶的催化(消耗谷胱甘肽) 恢复为AH

。

2泛醌（ubiquinol），亦称辅酶Q (coenzume Q, CoQH2)

泛醌（CoQH2）位于线粒体膜中，也存在于脂蛋白和细胞的膜结构中。体外实验表明CoQH2能清除烷氧基R-O?从而抑制脂质过氧化，其本身被氧化为CoQH?

R-O?+ CoQH2-----→ ROOH + CoQH?

线粒体电子传递链时时在进行CoQH2 / CoQH?循环，通过泛半醌CoQH?自由基中间物进行氧化还原反应。它在线粒体中的作用十分重要，因此认为CoQH2 是线粒体中一个有效的抗氧化剂。Ingold等提出CoQH2可能是对抗LDL氧化修饰的重要因素。还有学者认为CoQH2有抗动脉粥样硬化作用。还有学者提出人血浆中CoQH2/ CoQH?比率可作为氧化应激指标。在膜结构中αT-OH与泛醌含量相差不多，而LDL中的泛醌含量明显少于αT-OH。虽然CoQH2清除R-O?的速率为αT-OH清除R-O?的速率的十分之一，CoQH2能使膜中的αT -O?恢复为αT-OH，CoQH?可自氧化或经胞浆中的醌还原酶（quinone reductae）在消耗两个分子NADH 或NADPH的条件下，还原为氢醌CoQH2

尿酸(uric acid, UH)

是机体内重要的抗氧化剂。尿酸能与?OH, ?O2－/ HO?2，CCl3 OO?，鸟嘌呤自由基等反应。一价阴离子尿酸(U—)失去一个电子成为尿酸自由基(?U) 。

U—＋?R -----→?U ＋RH

虽然尿酸自由基?U不与?O2—反应，它的反应活性也相当强，寿命也比尿酸所淬熄的自由基的寿命要长。尿酸的抗氧化性可被抗坏血酸增强，因此推测尿酸自由基可被抗坏血酸修复。

硫醇(thiols，R-SH)

含巯基的化合物，如谷胱甘肽，半胱氨酸，N - 乙酰半胱氨酸, 硫氧还蛋白等。

R-SH可与各种自由基作用。生物系统中以碳为中心的自由基(如起源于葡萄糖的自由基) ?R及?OH 等皆可被R-SH还原。R-SH本身形成自由基(R-S ?)。

硫氧还蛋白（thioredoxin）

硫氧还蛋白一类含巯基的多肽，主要存在于内质网。近来发现细胞中ROS增高時，该蛋白易位入核。硫氧还蛋白活性部位，有两个半胱氨酸残基（-Cys-Gly-Pro-Cys-）。硫氧还蛋白能使胞浆中各种底物蛋白的二硫键还原为有活性的巯基，而本身形成二硫键。

P1SSP2 + Th(SH)2 → P1(SH) + P2 (SH)+ Th(SS)

氧化型的硫氧还蛋白可被硫氧还蛋白还原酶恢复为有活性的硫氧还蛋白（消耗NADPH）。

氧化型的氧化型谷胱甘肽可被谷胱甘肽还原酶恢复为有活性的还原型谷胱甘肽（消耗NADPH）。

氧化型的硫氧还蛋白可被硫氧还蛋白还原酶（methionine sulfoxide reductase ，Msr）恢复为有活性的硫氧还蛋白（消耗NADPH）。

抗氧化剂之间的作用

协同作用：维生素E被消耗，可被抗坏血酸恢复，尿酸自由基可被抗坏血酸恢复等。

相互代偿：当一个抗氧化剂减少或缺乏时，另一个抗氧化剂会自动地代替性的增强。例如，给小鼠或鸡喂缺Mn饲料，可使组织中MnSOD减少，此时发现肝中的CuZnSOD显著增多。当喂缺Se饲料时，组织中Se依赖的GSH-Px 显著减少，而Se不依赖的GSH-Px 显著增多。当用去缺Se与缺维生素E饲料喂大鼠，肝中过氧化氢酶大增。