目的基因的克隆转化及重组子筛选

目的基因的克隆、转化及重组子筛选

一．实验目的：

(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。

(2)学习DNA连接的有关技术。

(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。

(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

(5)掌握质粒提取的基本方法。

(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

二．实验原理：

(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。

(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。

(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。

三．实验材料：

大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2DNA割胶回收试剂盒，试管，Amp/IPTG/X-Gal，三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1μl pMD19-T Vector、质粒提取试剂盒。

四．实验步骤、现象、结果及分析：

(1)cDNA电泳及胶回收

1. 提取总RNA，反转录cDNA，用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。

2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。

表一：cDNA琼脂糖凝胶重量

空管2管3管

重量（g）0.9045 1.2280 1.2961

净重（g）0.3235 0.3916

3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）；

4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液；

5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液；

6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液；

7.10000g 离心1min（去乙醇）；

8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。

9.检测DNA 的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。

表二：cDNA 吸光度测定

（2）感受态细胞制备

1.从新鲜培养的LB 平板上挑单个DH5a 大菌落接种到3mlLB 培养液中，37 ℃ 剧烈振荡培养过夜（教师准备）。

2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a 按 1：50 取1ml 菌液接种到 50ml LB 培养基中，37 ℃ 振荡培养，1hr 后用分光光度计测其OD 值为0.182，1.5 hr 后再测其OD 值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期 OD 600 为 0.2-0.4）。

3.分别取1ml 菌液至1.5 ml 离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置 10 min ，5000 r/min ，离心 2 min ，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。

4.分别加入500μl 预冷的 0.1 mol/L CaCl 2 ，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的 CaCl 2 中，冰上放置10分钟。

5.离心机5000r/min ，离心 2min ，用枪头吸取弃上清，分别加入100μl 预冷的 0.1 mol/L CaCl 2，小心用枪头吹散，0℃ 保存 3hr 。

（3）连接和转化 组别 实验组 正对照组

负对照组 操作 连接：从2号胶回收DNA EP 管中取4μl ，加入1μl pMD19-T Vector 、5μl Solution Ⅰ组成10μl 连接反应体系，在16℃下进行连接反应；

转化：30min 后加入1号100μl 感受态细

胞EP 管中，以手指轻轻触碰混匀，冰中

放置30min 进行转化，接着42℃热激

45sec ，再在冰中放置1min ，最后加入

390μl LB 液体培养基于37℃振荡培养50min 。

取1μl(5ng/μl)

质粒加入2号

100μl 感受态细

胞EP 管中。 无需取任何物质加入3号100μl 感受态细胞EP 管中。 样品组-100μl ：

从上述500μl 体

系中取100μl 加入

LB/Amp/IPTG/X-G

al 平板，最后加入

玻璃珠，摇动混匀，

于37℃倒置、过夜

培养。 样品组-200μl ： 从上述500μl 体系中取200μl 加入LB/Amp/IPTG/X-G al 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。 从上述101μl 体系中取50μl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。 从上述100μl 体系中取100μl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。

注：LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板配制：

取固体LB 培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55℃左右，加入80μl 氨苄青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：样品组100μl 、样品组200μl 、

2组 3组 A260/A280 1.864 1.867 浓度（ng/μl) 146.718 128.242

正对照组、负对照组，然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布X-Gal 40μl和IPTG 10μl。

Ⅱ10月25号

(1)取出过夜培养的4个平板，拍照并计数。结果如下图所示：

图一：样品组-100μl

图二：样品组-200μl

图三：正对照组

图四：负对照组

从上述四图可以看出，图三正对照组出现大面积蓝色菌落，证明空载质粒转化成功，平板边缘菌落呈白色，是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal ，导致边缘不含或少含X-Gal 。图四负对照组无菌落出现，因培养基中含氨苄青霉素，而感受态细胞无抗性，因而不能生存。图一样品组-100μl 出现白色和蓝色菌落，证明重组质粒转化成功，图二样品组-200μl 也出现白色和蓝色菌落，但密度比图一高。

白色菌落密度偏高(与其他组相比)的原因：

空载质粒的摩尔数=660g/mol

×2692/g 10×1μμ×μl /ng 5-9ng =3×10-15mol

插入DNA 片段的摩尔数=mol

g ng g /660×460/10×μl /ng 718.146×μl 49-=1.933×10-12mol 空载质粒的摩尔数：插入DNA 片段的摩尔数≈1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范围，待插入DNA 片段过多，当时未稀释待插入DNA ，直接进行了转化实验，导致重组白色菌落密度偏大。

对图三正对照组蓝色菌落进行计数，将平板划均分为8块扇形，计数2块扇形部分内菌落数分别为850、650，平均为750，总计6000，空载质粒转化效率计算如下：

1μl5ng/μl 即5ng 的质粒加入2号100μl 感受态细胞EP 管中，取50μl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/1

10050 5ng=2.4×103cfu/ng=2.4×106cfu/μg 质粒

（2）在超净工作台中，从样品组-100μl 中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400μl LB-amp 培养基中，挑选4个菌落，分别接种于1号、2号、3号、4号试管中，于37℃振荡摇菌5hr 。

（3）配制10μl 反应体系，进行PCR 。

10μl 反应体系如下：

菌液 DNA 2 μl

引物1（10 μM) 0.4 μl

引物2（10 μM) 0.4 μl

2 ×PCR Reaction Mix 5 μl

Taq 聚合酶（2.5 U/μl ） 0.2 μl

超纯水 2 μl

由于全班共配置100个反应体系，每组50μl ，从老师处领取后，自行分装8μl/管，分别标号1、2、3、4，再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养EP 管并从中取出2μl 作模板加入，后进行PCR 反应。

PCR 反应条件如下：94 ℃变性3 min ；

94 ℃ 30 sec ，60℃ 30 sec ，72 ℃ 1 min ，35 个循环；

72 ℃ 5 min 。

（4）电泳：桌面薄膜依次点上marker 及1、2、3、4号PCR 产物各4μl ，再分别加入1μl SYBR Gold ，充分混匀，于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。

（5）电泳完毕，取出凝胶，在紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图五所示：

Marker 1 2 3 4

bp

2000

1000

750

500

250

100

图五：菌落PCR产物电泳示意图

由上图可以看出，1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右，证明转化成功。

（6）随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号，将菌液倒入1号、2号3ml LB-amp培养管中，37℃摇床过夜培养。

Ⅲ10月26号

（1）质粒提取：

1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管，分别从中取1.5ml 的菌液加入1号、2号EP 管，于室温下10，000 xg离心1min 以沉淀菌种，由于菌液超过3ml，本实验步骤重复2次。

2.倒出培养基，往沉淀中加入250 μl SolutionⅠ/ RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。

3.往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7次。避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。

4.往上述混和液中加入350 μl Solution III ，温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。室温下，13，000 x g 离心10min.。（提高离心速度有利于沉淀贴壁更加紧密）

5.取两干净的HiBind ? Mini Columns (I) 各装在一个2 ml 收集试管上。小心转移上清液至柱內，室温下10，000 x g 离心 1 min ，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液。

6.把柱子套在5所用的收集管上，加入500 μl Buffer HB 到柱子中，室温下10，000 x

g 离心1min 洗涤柱子，除去残余的蛋白质。

7.弃去收集管中的滤液，加入700 μl DNA Wash Buffer ( 用无水乙醇稀释) 至柱子，室温10，000 x g离心1min ，弃去洗涤液。再用700 μl DNA Wash Buffer 洗涤一次。

8.室温下10，000 x g 离心空柱2min 以甩干柱子基质( 除去乙醇) 。

9.把柱子置于一干净的1.5ml 离心管上，加入30 μl 无菌去离子水到柱子基质上，室温下静置2min 。10，000 x g 离心2 min 以洗脱出DNA 。

10.检测质粒DNA 浓度。取1μl 质粒DNA样品，直接加在检测仪的加样板其中一个孔上，吸头不能碰到加样板，以水为空白对照，测定浓度及A260/A280。

表三：质粒DNA吸光度测定

试管1号2号

A260/A280 1.820 1.768

140.873 34.898

浓度

(ng/μl)

与其他小组相比，１号组浓度正常，２号组浓度偏低，原因是２号组转柱时不小心将白色沉淀转录，因而又将液体从柱上倒入另一离心管去离心，然后再将离心后的上清液转回柱子，可能是在转移过程中导致量的减少。