探针药物法评价苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用

探针药物法评价苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用郑造乾;骆瑾瑜;陈燕华;王小军【摘要】Objective To investigate the in vitro inhibition of kudiezi injection (KDZi) on liver microsomal CYP3A4 in rats and the potential herb-drug interaction with drugs metabolized by CYP3A4 enzyme in clinical ap-plication. Methods The test groups included a negative control group, an inhibitor positive control group and a KDZi group. After incubating the rat liver microsomes with testosterone, a probe substrate, the reduction of testos-terone were quantitated with HPLC, and IC50 values were calculated to assess the inhibitory effect of KDZi on rat CYP3A4 enzyme. Ketoconazole was used as a positive control. Results In mixture metabolic system of liver mi-crosome enzymes, the most suitable incubationconc entration of testosterone was 100μmol/L, incubation time was 40 min and concentration of microsome protein was 0.5mg/mL, when the concentration of Tris-HCl buffer was 0.1mol/L (pH7.4) at 37℃. The results showed that the IC50 value of positive inhibitors of CYP3A4 was0.0707μmol/L, which indicated that the incubation system satisfied the demands of CYP3A4 enzyme inhibition activity evaluation. The relative inhibitory rate of CYP3A4 in 9 serial volume concentration of KDZi (0,0.01%, 0.10%, 0.20%, 0.50%, 1.00%, 2.00%, 5.00%, 10.00%) were 0, 2.94%, 16.44%, 22.70%, 31.44%, 37.47%, 46.37%, 51.74%, and 60.40%, respectively. The IC50 value of KDZi on CYP3A4 inhibition was 3.46%, which wasexceeded their daily-dose concentration. Conclusion In ordinary condition, no significant interaction between KDZi and CYP3A4 is de-tected in vitro, which indicates that KDZi might be used with CYP3A4 enzyme substrates.%目的：观察苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用与CYP3A4酶底物合用药时可能产生的相互作用。

方法采用SD大鼠肝微粒体体外孵育法，设阴性对照组、阳性抑制剂对照组和苦碟子注射液组。

利用高效液相色谱法测定底物睾酮的减少量，计算得到IC50,评价苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4酶的抑制活性，以酮康唑为阳性对照药。

结果在体外人肝微粒体孵育体系中，当Tris-HCl缓冲液浓度为0.1mol/L，pH为7.4，温度为37℃时，睾酮最佳反应底物浓度为100μmol/L，最佳孵育时间为40min，最佳蛋白浓度为0.5mg/mL。

阳性抑制剂酮康唑的IC50值为0.0707μmol/L，表明孵育体系满足CYP3A4酶抑制活性的评价要求。

9个不同体积终浓度（0、0.01%、0.10%、0.20%、0.50%、1.00%、2.00%、5.00%、10.00%）的苦碟子注射液对CYP3A4酶的相对抑制率分别为0，2.94%、16.44%、22.70%、31.44%、37.47%、46.37%、51.74%和60.40%，半数抑制率IC50值为3.46%，高于其日用药量浓度。

结论在体外正常剂量下，苦碟子注射液对人CYP3A4无明显抑制作用，可以与其底物联合用药。

【期刊名称】《浙江中西医结合杂志》【年(卷),期】2017(027)002【总页数】4页(P103-106)【关键词】苦碟子注射液;鼠肝微粒体;CYP 3A4;抑制作用【作者】郑造乾;骆瑾瑜;陈燕华;王小军【作者单位】浙江省立同德医院药学部杭州 310012;浙江省立同德医院血液净化中心杭州 310012;浙江省立同德医院药学部杭州 310012;浙江省立同德医院药学部杭州 310012【正文语种】中文苦碟子注射液（kudiezi injection，KDZi）是以菊科苦荬菜属抱茎苦荬菜[ixeris sonchifolia（Bunge）Hance]的全草为原料提取精制而成的静脉注射剂，其主要成分为黄酮、有机酸、倍半萜内酯以及核苷类成分[1-2]，具有改善微循环、抗血小板凝聚、降血脂和抗肿瘤等作用[3]。

临床常用于冠心病、心绞痛、脑梗死治疗。

合并用药非常普遍、复杂[4-5]。

细胞色素P450（CYP450）酶是人体内重要的药物代谢酶，参与临床约75%的药物代谢，其中CYP3A4约占50%，其被抑制或诱导会影响药物的体内过程，从而出现严重的药物相互作用。

本研究采用大鼠肝微粒体混合酶体外代谢体系，以睾酮为探针药物，通过HPLC测定CY P3A4酶探针底物睾酮的减少量，评价KDZi对CYP3 A4酶活性的影响，以评估和预测其与CYP3A4底物合用时产生药物相互作用的可能性和影响。

1.1 动物雄性SD大鼠6只，由浙江省中医药研究院实验动物中心提供，动物许可证号：SXCK（浙）-0010755，清洁级，体质量（200±20）g；实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供，参考GB 14924.1-2001《实验动物配合饲料通用质量标准》[6]；实验动物房使用许可证号为SYXK（浙）2014-0003，温度为23±2℃，湿度为（50±10）%；实验动物实验前在动物房中适应7天，每笼2只，自由进食和饮水。

1.2 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪（Agilent，USA），配有在线脱气机、四元梯度洗脱泵、柱温箱、DAD检测器及ChemStation化学工作站；Spectrum lab 52型紫外分光光度仪（上海棱光技术有限公司）；纯水仪（PURELAB UltraGenetic，英国ELGA公司）；超低温冰箱（-80℃ULT Freezer，Thermo Forma 公司）；涡旋震荡仪GBL-88B（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；台式高速冷冻离心机（Centrifuge 5415，Eppendorf公司）；超高速离心机（OptimaTM MAX-XP Ultracentrifuge，贝克曼库尔特实验系统有限公司）。

1.3 药品与试剂苦碟子注射液（KDZi）（批号：140915，规格：10mL，沈阳双鼎制药有限公司）；苯巴比妥钠注射液（批号140614，规格：0.1g/mL，上海新亚药业有限公司）；睾酮、异枸橼酸、异枸橼酸脱氢酶、氧化/还原型辅酶Ⅱ（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP/β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphatereduced form，NADPH）均购自美国Sigma 公司；牛血清白蛋白购自杭州四季青生物工程材料有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，购自上海凌峰化学试剂公司；其余试剂均为国产分析纯。

2.1 大鼠肝微粒体的制备按照文献[7]方法采用差速离心法制备大鼠肝微粒体。

选取雄性SD大鼠6只，连续3天腹腔内注射102mg/（kg·d）苯巴比妥钠注射液，于末次给药后将大鼠禁食24h并拉颈处死，开腹取出肝脏并用滤纸吸干水分、称重；立即于4℃的蔗糖溶液中清洗并用剪刀剪碎，反复清洗至无血色；按1g∶4mL加入0.25mol/L蔗糖溶液，在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆并超声分散30s；在4℃下，9000×g离心20min，取上清液，19 000×g离心20min，然后100 000×g离心55min；去除上清液，取沉淀用0.15mol/L的KCl悬浮均匀，然后100 000×g离心45min，取沉淀（肝微粒体）；最后将所得肝微粒体悬浮于20mmol/ mL的Tris-sucrose（pH7.4）缓冲液，并置于-80℃保存备用。

以上操作均在4℃以下进行。

用考马斯亮蓝法（Bradford法）测定肝微粒体的蛋白浓度[8]。

2.2 肝微粒体体外孵育体系参照文献[9]方法建立终体积为200μL的孵育体系，包括终浓度为14.9 mmol/L的异枸橼酸（isocitric acid），0.035unit/mL异枸橼酸脱氢酶（isocitric dehydrogenase），0.15mol/L的MgCl2，0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=7.4），0.5mg/ mL的大鼠肝微粒体蛋白，100μmol/L的探针底物睾酮和20μL系列浓度的苦碟子注射液（终浓度为0，0.01%，0.10%，0.20%，0.50%，1.0%，2.0%，5.0%，10.0%）或酮康唑溶液（终浓度0.001，0.010，0.050，0.100，1.0 00，5.000，10.000，20.000μmol/L）。