SELEX法筛选鼻咽癌核酸适配子的研究

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SELEX 技术-指数富集配体的系统进化过程

适配体
• 一般由几十个核苷酸(20 — 60 nt) 组成,可以是RNA或单链DNA ( ssDNA) 。 Aptamer 与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性,它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠,形成一些稳定的三维空间结构,如发卡(hairpin) 、假结 (pseudoknot) 、凸环(stem loop) 、G2四分体 (G2quartet) 等。
• VEGF是一种蛋白物质，它在新生血管形成以及增强渗透性过程中起关键作用； • 主要用于治疗年龄相关性湿性黄斑病变（AMD），这是导致发达国家50岁以上老龄人口视力出现损伤的主要原因。
德国默克公司（Merck KGaA）
• 向美国私营 Archemix 生物技术公司投资2980万美元，共同开发基于 aptamer 的癌症治疗技术； • Aptamers是化学合成的核酸，比单克隆抗体生产方法要便宜许多； • Merck Serono 的董事 Bernhard Kirschbaum 认为 Aptamers 将在下一代的治疗药物中起着非常关键的作用；
指数富集配体的系统进化过程 SELEX
systematic evolution of ligands by exponential enrichment
原理
• SEL EX 技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库,用它与靶物质混合,形成靶物质与核酸的复合物,洗掉未与靶物质结合的核酸,分离与靶物质结合的核酸分子,以此核酸分子为模板进行PCR 扩增,再进行下轮的筛选过程。 • 通过重复的筛选与扩增,一些与靶物质不结合或与靶物质具有低亲和力、中亲和力的DNA 或 RNA 分子被洗去,而称之为“适配子”的,与靶物质有高亲和力的DNA 或RNA分子从非常大的随机库中分离出来,且其纯度随SEL EX 过程的进行而增高,从μmol 到nmol ,有的甚至到pmol ,最后占据库的大多数(约> 90 %)

利用SELEX技术筛选获得结核患者血清IgG抗体适体

04
利用SELEX技术筛选IgG抗体适体的应用前景

在结核病诊断中的应用
快速诊断
通过筛选IgG抗体适体，能够快速、准确地检测结核病，缩短诊断时间。
灵敏度高
利用SELEX技术筛选出的IgG抗体适体具有高灵敏度，能够检测出低浓度的结核病抗体。
特异性好
通过特异性识别结核病抗体，IgG抗体适体能够降低交叉反应，提高诊断的准确性。
在结核病治疗和疫苗研发中的应用
辅助治疗
01
通过筛选出的IgG抗体适体，可以辅助治疗结核病，提高治疗效
果。
疫苗研发
02
利用IgG抗体适体的特异性，可以研发针对结核病的疫苗，提高
预防效果。
药物筛选
03
通过筛选出的IgG抗体适体，可以用于药物筛选，寻找潜在的治
疗结核病的药物。
在其他疾病研究中的应用和跨领域合作
03
结核患者血清IgG抗体适体的性质和功能
IgG抗体适体的结构和特性
高度稳定性
IgG抗体适体具有较高的热稳定性和化学稳定性，能够在各种环境中保持稳定。
易于合成和改造
IgG抗体适体可以通过固相合成法快速、高效地制备，并且易于进行化学修饰和基因工程改造。
高亲和力
IgG抗体适体能够高亲和力地结合靶标分子，具有较高的特异性和灵敏度。
随机寡核苷酸库的构建
设计并合成一个包含大量不同序列的随机寡核苷酸库。
寡核苷酸库与IgG抗体的结合
将寡核苷酸库与IgG抗体混合，通过物理吸附或化学交联的方式使二者结合。
洗脱与分离
通过洗涤和分离步骤，将未结合的寡核苷酸从结合的寡核苷酸中分离出来。
扩增与检测
对结合的寡核苷酸进行扩增和检测，以确定其序列和亲和力。

核酸适配体识别原理

核酸适配体识别原理核酸适配体识别原理是基于生物化学原理，通过适配体的选择性亲和性识别目标核酸序列的一种技术。

本文将从以下几个方面介绍核酸适配体的原理和相关知识。

一、核酸适配体的基本定义和作用核酸适配体是一种单链的DNA或RNA分子，它们具有特定的空间结构和亲和性，可以与目标核酸的特定位点结合，实现对目标核酸的无标记检测、定量和成像等。

二、核酸适配体的选择方法核酸适配体的选择可以通过体外进化技术，如选体法、SELEX法等。

选体法是利用化学标记的核酸诱导选择反应，筛选出具有亲和性的核酸适配体。

SELEX法则是通过多轮体外进化演化产生高亲和力的核酸适配体。

这两种方法的主要区别在于，选体法通过将两个核酸结合起来，筛选出与目标核酸结合最紧密的分子，而SELEX法要求在体外化学和物理环境下不断利用多轮筛选获得高亲和力的分子。

三、核酸适配体的结构和特点核酸适配体的结构通常是单链的DNA或RNA分子，具有平面或马鞍形。

它们能够通过空间结构方法识别目标核酸的特定序列，同时还具有高亲和力和选择性。

此外，核酸适配体的合成成本低，易于制备，因此被广泛应用于生物医学、生物技术等领域。

四、核酸适配体的应用核酸适配体的应用非常广泛，主要包括生物分析、诊断、药物传递和治疗等领域。

常见的应用，如荧光标记技术，可以通过搭配不同颜色的标记使实验结果更加直观。

此外，核酸适配体还可用于分析单个分子，对单个分子进行检测，避免了外部信息对分子系统的影响。

五、核酸适配体的发展前景核酸适配体作为一种新兴的生物技术，拥有广阔的应用前景。

目前在生物医学和生物技术领域的应用中，核酸适配体技术已经成为了切实可行的分析方式之一。

未来，随着逐渐成熟的技术和更加精细的研究，核酸适配体技术无疑会为更多领域的发展带来新的可能和机遇。

综上所述，核酸适配体技术的发展让人们看到了一个全新的生物接口，它将以自身独特的方式推动生物学和医学的研究。

未来，我们有理由相信，核酸适配体技术将在更广泛的领域得到应用。

核酸适配体药物的研究进展

生命科学仪器2020第18卷/12月刊综述核酸适配体药物的研究进展刘珊，肖楠，王睿，邓玉林，李玉娟+(北京理工大学生命学院北京100081 )摘要：核酸适配体（A ptam er)通常是利用指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，能够与其靶标特异性结合，核酸适配体可用作药物，核酸适配体特异性结合其靶标如蛋白质、多肽、小分子等，从而抑制其生物学功能，影响其活性，达到治疗疾病的效果=近年来，核酸适配体药物应用于眼部疾病、肿瘤、血液类疾病、心血管类疾病等诸多领域本文对已进人临床期或上市的多种核酸适配体药物进行综述，期望为后续核酸适配体药物研发、临床试验等提供参考。

关键词：核酸适配体；药物；临床试验；疾病中图分类号：R917 文献标识码：A D O M O.11967/2020181202Research Progress of Aptamer DrugsLiu Shan, Xiao Nan, Wang Rui, Deng Yulin, Li Yujuan(School o f L ife Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)Abstract: Aptamer is an oligonucleotide fragment selected from the nucleic acid molecular library by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamer can be used as drugs, it also can bind to its target specifically, such as proteins, peptides, and small molecules. Aptamer can inhibit the biological function of the target, affect its activity, and ultimately treat the diseases. In recent years, aptamer drugs have been used in many fields such as eye diseases, tumors, blood and cardiovascular diseases. We have summarized aptamer drugs entering the clinical stage, hoping to provide some references for the subsequent research and clinical trials of aptamer drugs.Key Words: Aptamer; Drugs; Clinical trials; DiseaseICLC Number] R917 [Document Code] A DOI: 10.11967/20201812021、引言核酸适配体（A p t a m e r)通常是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,S E L E X)，从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，能够与其靶标特异性结合，图1。

核酸适配体筛选技术研究进展

核酸适配体筛选技术研究进展许涛;彭智辉;王泽峰;周佳琪;邓乐【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2018(029)001【摘要】核酸适配体是一段特殊的寡核苷酸配基,对靶标有亲和力和特异性.核酸适配体发展十分迅速,但筛选方法的研究相对来说还不能满足适配体应用的需求.笔者从筛选过程出发,针对近年来较为新颖热门的非天然核苷酸替代传统核苷酸、镜像核酸库代替核酸库等核酸库优化方法,毛细管电泳筛选、微流控芯片技术、微阵列芯片、粒子展示等筛选策略改进技术,高通量测序等次级文库序列分析,碱基突变与修饰、序列截短等适配体结构优化等具体内容进行总结,探讨各种方法的研究进展及应用前景.【总页数】7页(P134-140)【作者】许涛;彭智辉;王泽峰;周佳琪;邓乐【作者单位】湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,湖南长沙410081【正文语种】中文【中图分类】Q75【相关文献】1.核酸适配体筛选技术快速检测重金属超标 [J], ;2.用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立[J], 李慧;邵宁生;赵强;梁超;丁红梅;李洁;黄皑雪;苏雪婷;张令强;李少华3.核酸适配体技术在食品危害因子检测中的应用研究进展 [J], 徐婧婧;纪晗旭;李雨枫4.核酸适配体技术在食品重金属检测中的应用研究进展 [J], 莫永福5.核酸适配体技术在食品危害因子检测中的应用研究进展 [J], 徐婧婧;纪晗旭;李雨枫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

核酸适体的技术

• 药物设计和临床治疗 • 由于核酸适体与蛋白特异性结合后往往能抑制蛋白的功能,而且它缺乏免疫原性,体内渗透力强,因此是一种很有发展前途的药物分子,可用于直接干扰疾病的发生发展过程。迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、氨基糖类抗生素的适体已在治疗中展示了良好的应用前景。
SELEX技术
SELEX是指数富集配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment)的简称,其筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程,分别是自发突变、自然选择和大量增殖。
一“自发突变”
• 利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有10
• 此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发,荧光几乎完全被猝灭。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝灭分子距离增大。杂交后,信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。
研究核酸与蛋白质的相互作用的方法 ----核酸适体技术
• 核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术 SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着广泛的用途。
这一步起到达尔文进化论中自发突变的作
用。
二“自然选择”
• 单链的随机寡核苷酸序列,容易形成可与蛋白质、核酸等配体特异性共价结合的二级结构。在这一高亲和力特异性结合的基础之上,配体如进化论中的自然选择作用。

基于Cell-SELEX的核酸适配体在生化分析与生物成像中的应用

基于Cell-SELEX的核酸适配体在生化分析与生物成像中的应用堵玉林;莫柳婷;易娅莎;邱丽萍;谭蔚泓【摘要】Aptamers are single-stranded oligonucleotides ( DNA or RNA ) selected through a technology termed "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment" ( SELEX ) . In addition to high affinity and high specificity for their target molecules, aptamers have some advantages such as low molecular weight, easy synthesis, high chemical stability, low immunogenicity, and convenient modification. Based on the Cell-SELEX technique, a panel of aptamers which can specifically recognize target cell lines has been generated. By targeting specific membrane proteins in their native state, these aptamers can identify subtle molecular differences among different cell lines, thus have attracted a broad interest in biomedical research. In this review, we summarized the development of aptamers and their use in detection, profiling and imaging of tumor cells. Also, their perspectives were discussed.%基于Cell-SELEX的核酸适配体是指以活细胞为靶标物,通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的单链寡核苷酸.它能够与靶标细胞高亲和性、高特异性结合,具有分子量低、合成简单、化学稳定性好、免疫原性低、易于功能化修饰等优点,已广泛应用于生命科学研究领域.本文综述了基于Cell-SELEX技术筛选的核酸适配体在肿瘤细胞检测、分析和成像方面的研究进展,并对核酸适配体研究的发展前景和趋势进行了展望.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2017(045)012【总页数】9页(P1757-1765)【关键词】核酸适配体;Cell-SELEX;生化分析;生物成像;肿瘤细胞【作者】堵玉林;莫柳婷;易娅莎;邱丽萍;谭蔚泓【作者单位】分子科学与生物医学实验室,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南大学化学化工学院,生命科学学院,核酸适配体湖南省工程实验室,长沙410082;分子科学与生物医学实验室,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南大学化学化工学院,生命科学学院,核酸适配体湖南省工程实验室,长沙410082;分子科学与生物医学实验室,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南大学化学化工学院,生命科学学院,核酸适配体湖南省工程实验室,长沙410082;分子科学与生物医学实验室,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南大学化学化工学院,生命科学学院,核酸适配体湖南省工程实验室,长沙410082;分子科学与生物医学实验室,化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南大学化学化工学院,生命科学学院,核酸适配体湖南省工程实验室,长沙410082【正文语种】中文近年来，癌症的发病率和死亡率不断上升，已成为我国居民最主要的死亡原因之一。

SELEX技术及应用

2. 可行性分析乙,再经SELEX筛选,可得到其适配子
3.技术流程(见图2)
乙肝病毒株
切取ps1基因
加引物
PCR
分离纯化目的蛋白
目的基因表达
DN亲和力的适配子
结果分析
细胞试验
制备适配子
3.扩展筛选功能的技术改良
a.消减SELEX技术 b.切换SELEX技术 c.表达盒SELEX技术 d.复合靶解析SELEX技术
六,我的初步想法用SELEX筛选乙型肝
炎病毒前S1蛋白 1.产生该想法的原因乙型肝炎病毒前S1蛋
白在黏附感染肝细胞过程中起主要作用,若能找到该蛋白的适配体,封闭其黏附感染肝细胞的作用, 理论上可减少乙型肝炎病毒感染肝细胞
合成的ssDNA库最后克隆,测序 PCR cDNA (RNA)TRPCR (DNA) PCR PCR dsDNA库转录 RNA库 ssDNA库
适配体靶分子复合物
适配体分离
去除未结合的寡核苷酸
适配体靶分子结合物
图1 SELEX原理图
四,防核酸酶降解的化学修饰
1. Aptamer 的分子骨架修饰即将影响
SELEX技术及应用
一,selex全称二,selex特点:
1.范围广 2.亲和力高 3.特异性强 4.筛选周期短 5.稳定性好 6.与靶分子的结合条件可调控 7.应用灵活
三,selex技术基本原理:
1.设克隆,测序
aptamer在体内稳定性的基团,用另一些相应的基团取代
2. Aptamer的分子外修饰即连接无活性
的大分子
五,SELEX技术改良
1.提高筛选效率的技术改良 a.荧光磁珠法
b.毛细管电泳法 c.自动化筛选技术

Cell-SELEX技术研究进展

Cell-SELEX技术研究进展赵仲麟;李燕;袁超【摘要】适配子是通过SELEX技术,即指数富集配体系统进化技术,经反复放大筛选得到的、与目标分子有高度亲和性的分子.SELEX技术常使用纯化的靶分子,目前活细胞也可用于筛选目标,这种技术称为细胞指数富集配体系统进化技术(Cell-SELEX),其优点是产生的适配子可以与活细胞中的靶分子的天然构象发生作用.细胞表面的跨膜蛋白也可作为适配子的目标.此外,在不知道任何细胞表面分子的情况下也可以得到细胞特异性适配子.对Cell-SELEX技术的应用及研究进展进行综述.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】5页(P52-56)【关键词】Cell-SELEX;生物标记物;癌症研究;核酸;适配子【作者】赵仲麟;李燕;袁超【作者单位】河南农业大学理学院,郑州450002;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,郑州450002;河南农业大学理学院,郑州450002【正文语种】中文适配子是从组合核酸库中筛选到的、与靶分子具有高度亲和性的分子［1] 。

与抗体类似，适配子对目标分子具有高度亲和性和特异性。

然而适配子还有很多额外的优点，如可以抵抗还原条件和热变性等。

典型的适配子一般少于40个核苷酸，同时还要易于化学合成。

另外，适配子可以在一些生理条件下，可通过反义寡核苷酸杂交使其失活。

因此，可以用于设计解毒剂。

适配子在分子生物学和医学已经被广泛应用［2] 。

适配子通过SELEX技术，即指数富集配体系统进化技术，经反复的放大筛选得到的［3，4] 。

这个过程中，单链核酸库与靶分子孵育，单链核酸包括DNA、RNA和修饰的核酸，库由30-100个核苷酸的随机序列组成，约含1014-1015变异体。

与目标有结合活性的变异体将被回收，然后通过RT-PCR进行文库富集扩增，然后利用富集的PCR产物，通过模板链除去或体外转录重建单链库。

该过程将重复几轮至20轮不等，最终找到目标适配子。

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ｒｕｄ．Ａｔｅｓｅｅｄｉｅｔｔｅｍｉｅｌｓｒｇａａｓ，ｎｏｉｅｅｔｅ，ｍｌｓｂ — ｏｎｓｐａｒｗｒｉｄｄｉｏｈｅｆｌｓｃｔｉｎｌｉａｄｍｔｓｗｒｉｎｉｄｉ１２ｆｉｅｙａｍｖｎｒａｉｂｕｅｎｙｙｓｆｅｄｆｎｉａｉ
摘要：目的建立鼻咽癌细胞核酸适配子库，为鼻咽癌的分子诊断、生物治疗奠定基础。方法
体外合成长度以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选，Ｅ以Ｂ病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行１０轮筛选。采用流式细胞仪检测判断核酸适配子库的特异性和亲合力，ｌｓｌＸ软Ｃｕｔａ
关键词：指数式富集的配体系统进化技术；咽肿瘤，鼻鼻咽癌；适配子
中图分类号：７９６Ｒ３．文献标志码：Ａ文章编号：０－６Ｘ（０２２－３－３１２２６２１）３０ＡｐａｔｄｎｓｌｃｉｆＤＮａｔｍｅｓｔａｏｈｒｎｅｌａｃｎｍａｃｌｂＬＸｏｒｏｎｓｐａｙｇａｒｉｏｅｌｙＳＥＥｃ
ｑｅｅｓＷＳａａｙｅｙｃｕｔｌＸ．ＲｅｕｔＴｅｓｂｏｌｂｎｉｇａａｎｔＮＣｃｌｎｒａｅｌｎｔｅｅｔｎｕｎｅａｎｚｄｂｌｓａｌｓｌｓｈｕｐｏｓｉｄｎｇｉｓＰｅｌｉｃｅｓｄａｏｇｗｉｓｌｃｉｓｈｏ
ｗｓｕｊｃｄｔｓｂｒｔｅｓｌｔｎａａｓｎｒａｎｓｐａｎｐｔｅａｃｌａｄ１ｏｎｓｏｅｃｏｇｉｓＮＣａｂｅｔｕｔｃｉｅｃｏｇｉｔｏｍｌａｏｈｒｘｅｉｌｌｅｎ０ｒｕｄｆｓｌｔｎａａｎｔＰｓｅｏａｖｅｉｎｙｈｉｌｅｉ
ｄｔｏｆＮＰＣｌｃｌｒｄｉｇｏｉｎｏｏｉａｒａｍｅｔＭｅｈｏｓＡｎｉｉｒｙｈｓｚｄ７８ｍｅａｏＤＮＡｉｒｒａｉｎｏｍｏｅｕａａｎｓｓａｄｂｉｌｇｃｌｔｅｔｎ．ｔｄｎｖｔｏｓｎｔｅｉｅｒｒｎｄｍｌｂａｙ
山东医药２１第５０２年２卷第２３
・
基础研究・
ＳＬＸ法筛选鼻咽癌核酸适配子的研究ＥＥ
陈文学，－张煜和邹学森陈岳青李金高一，。，
（１江西省肿瘤医院，南昌３００；南昌大学第一附属医院）３００２
ｃｌｙＳＥＸ．ＢｉｄｎｆｔｅａｔｍｅｏｌｏＮＣｃｌｓｖｓａｉｄｂｏｙｏｔｙｔｃｎｑｅＴｅａｔｍｅｅｅｌｂＥＬｓｎｉｇｏｐａｒｐｏｓｔＰｅｌｗａｉｕｌｅｙｆｗｃｔｍｅｒｅｈｉｕ．ｈｐａｒｓ — ｈｓｚｌ
件分析适配子的增加荧光强度增强。ＥＢ病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库初步建聚类分析显示适配子可以分为３个家族，、１２家族具有保守序列。结论
立成功，可筛选到具有较高亲和力和特异性的核酸适配子；本研究为鼻咽癌的分子诊断、生物治疗奠定了基础。
ｌｎｎ．ＣｏｄｕｉｎＷｅｓｃｅｓｕｌｓａｌｈｄＥｉｓｐｓｉｅＮｐａｒｐｏ，ｗｉｈｃｎｓｐｒｔｉｈａｆｉｉｍｅｔｇｎｔｓｏｕｃｓｆｌｅｔｂｉｅＢｖｒｏｉｖＰＣａｔｍｅｏｌｈｃａｅａａｅｈｇｆｎｔｙｓｕｔｉｙａｄｓｅｉｃｔｐａｒ．ＴｉｓｄａｓｔｅｆｕｄｔｎｏＣｍｏｅｕａｉｇｏｉｄｂｏｏｉａｒａｍｅｔｎｐｃｆｉａｔｍｅｓｈｓｔｙｌｙｈｏｎａｉｆｉｙｕｏＮＰｌｃｌｒｄａｎｓｓａｉｌｇｃｌｅｔｎ．ｎｔＫｅｒｓｙｔｍａｉｖｌｔｎｏｉａｄｙｅｐｎｎｉｌｅｒｃｍｅｔａｏｈｒｎｅｌｃｒｉｏ，ｎｓｐａｙｇａｙｗｏｄ：ｓｓｅｔｅｏｕｉｌｎｓｂｘｏｅｔｎｈｎ；ｎｓｐａｙｇａａｃｎｍａａｏｈｒｎｅｌｃｏｆｇａｉ
Ａｓａｔ０ｂｅｔｅＴｓｂｉａｏｈｒｇａｃｒｉｏｂｔｃ：ｊｃｖｏｅｔｌｈｎｓｐａｎｅａｃｍａ（ＰｒｉａｓｙｌｎＮＣ）ｎｃｉａｉａｔｅｂａｒａｉｇｈｕ－ｕｌｃｃｄｐａｒｉｒｒｆｙｅｏｎｅｍｌｙｏｌｎｔｆ
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