电针内关穴对大鼠体外循环后心肌线粒体超微结构及氧化应激的影响

・１３２２・　广东医学２０１５年５月第３６卷第９期　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｍａｙ．２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．９　电针内关穴对大鼠体外循环后心肌线粒体超微　结构及氧化应激的影响　

涂杰，李涛，梁东科，刘国锋，刘菊梅，韦秋英，张炳东　广西医科大学第一附属医院心血管病研究所手术麻醉室（南宁５３００２１）　

【摘要】　目的探讨电针内关穴对大鼠体外循环（ＣＰＢ）后心肌线粒体超微结构和氧化应激反应的影响。　方法成年ＳＤ大鼠６０只，４～６月龄，体重３２０～４２０　ｇ，雌雄不限，采用随机数字表法，将大鼠随机分为４组（ｎ＝　１５）：假手术组（ｓ组）、模型组（Ｍ组）、内关穴组（ＥＡ组）和非穴组（ＥＡＮ组）。采用尾动脉插管灌注，右颈静脉插　管引流建立ＣＰＢ模型。ｓ组仅行麻醉和动静脉插管；Ｍ组行ＣＰＢ　２　ｈ；ＥＡ组和ＥＡＮ组行ＣＰＢ　２　ｈ，且在ＣＰＢ期间　实施电针刺激，其中ＥＡ组取双侧内关穴，ＥＡＮ组取双侧内关穴旁开０．５　ｃｍ处。麻醉复苏后２　ｈ，处死动物留取左　心室心肌组织。透射电镜下观察心肌组织超微结构，行线粒体损伤程度评分；采用黄嘌呤氧化法检测心肌超氧化　物歧化酶（ＳＯＤ）活性，硫代巴比妥酸法检测心肌丙二醛（ＭＤＡ）含量，高效液相色谱法测定心肌三磷酸腺苷（ＡＴＰ）　含量；采用差速离心法分离线粒体后，用二氯双氢荧光素染色，在激光共聚焦显微镜下检测线粒体活性氧簇　（ＲＯＳ）水平。结果与ｓ组比较，其余３组线粒体损伤评分升高，心肌ＳＯＤ活性和ＡＴＰ含量下降，心肌ＭＤＡ含量　和线粒体ＲＯＳ水平升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与Ｍ组比较，ＥＡＮ组线粒体损伤评分，心肌ＳＯＤ活性、　ＭＤＡ和ＡＴＰ含量，线粒体ＲＯＳ水平差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），ＥＡ组线粒体损伤评分下降，心肌ＳＯＤ活性和　ＡＴＰ含量升高，心肌ＭＤＡ含量和线粒体ＲＯＳ水平下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ＥＡＮ组比较，ＥＡ组线粒　体损伤评分下降，心肌ＳＯＤ活性和ＡＴＰ含量升高，心肌ＭＤＡ含量和线粒体ＲＯＳ水平下降，差异有统计学意义　（Ｐ＜０．０５）。结论电针内关穴可减轻大鼠ＣＰＢ后心肌线粒体超微结构损伤，改善缺血心肌的能量代谢，其机制　可能与减轻心肌线粒体氧化应激水平有关。　【关键词】　电针；内关穴；体外循环；线粒体；氧化应激　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ　ａｔ　Ｎｅｉｇｕａｎ　ｐｏｉｎｔ　ｏｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｕｎｄｅｒ－　ｇｏｉｎｇ　ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｂｙｐａｓｓ．ＴＵ　Ｊｉｅ，ＬＩ　Ｔａｏ，ＬＩＡＮＧ　Ｄｏｎｇ—ｋｅ，ＬＩＵ　Ｇｕｏ—ｆｅｎｇ，ＬＩＵ　Ｊｕ—ｍｅｉ，ＷＥ１　Ｑｉｕ—ｙｉｎｇ，　ＺＨＡＮＧ　Ｂｉｎｇ一如　．Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＆Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ　Ｒｏｏｍ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３００２１，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＮＧ　Ｂｉｎｇ一如，　．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｂｄｏｎｇ２００７＠１６３．ｃｏｒｎ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ　ａｔ　Ｎｅｉｇｕａｎ　ｐｏｉｎｔ　ｏｎ　ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ　ｕｌｔｒａ—　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ　ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｂｙｐａｓｓ（ＣＰＢ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｉｘｔｙ　ａｄｕｌｔ　Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗ－　ｌｅｙ　ｒａｔｓ，ａｇｅｄ　４—６　ｍｏｎｔｈｓ　ａｎｄ　ｗｅｉｇｈｉｎｇ　３２０～４２０　ｇ，ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４　ｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝１５　ｅａｃｈ）：ｓｈａｍ　ｏｐｅｒａ－　ｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（Ｇｒｏｕｐ　Ｓ），ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｇｒｏｕｐ　Ｍ），ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ　ａｔ　Ｎｅｉｇｕａｎ　ｐｏｉｎｔ　ｇｒｏｕｐ（Ｇｒｏｕｐ　ＥＡ），ａｎｄ　ｅｌｅｅｔｒｏａ—　ｃｕｐｕｎｅｔｕｒｅ　ａｔ　ｎｏ　ｐｏｉｎｔ　ｇｒｏｕｐ（Ｇｒｏｕｐ　ＥＡＮ）．ＣＰＢ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｃａｎｎｕｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔａｉｌ　ａｒｔｅｒｉｅｓ　ａｎｄ　ｒｉｇｈｔ　ｊｕｇ—　ｕ］ａｒ　ｖｅｉｎ．Ｒａｔｓ　ｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｃａｎｎｕｌａｔｅｄ；ｒａｔｓ　ｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｍ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ＣＰＢ　ｆｏｒ　２　ｈ；ｒａｔｓ　ｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　ＥＡ　ａｎｄ　Ｇｒｏｕｐ　ＥＡＮ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ＣＰＢ　ｆｏｒ　２　ｈ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ＣＰＢ（ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅｄ　ａｔ　Ｎｅｉｇｕａｎ　ｐｏｉｎｔ　ｏｒ　ａｔ　ｔｈｅ　ｐｏｉｎｔ　０．５　ｅｍ　ｎｅａｒｂｙ　Ｎｅｉｇｕａｎ　ｐｏｉｎｔ　ｗｅｒｅ　ｇｉｖｅｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｆｒｏｍ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎ—　ｔｒｉｅｌｅ　２　ｈ　ａｆｔｅｒ　ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ　ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｕｈｒａｓｔｒｕｅｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｅ—　ｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｆｏｒ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｄａｍａｇｅ　ｓｃｏｒｅ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｍａ１ｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）ｗｅｒｅ　ａｓｓａｙｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｘａｎｔｈｉｎｅ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ＡＴＰ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｓｓａｙｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　２　，７　一ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ　ｕｓｉｎｇ　ｌａｓｅｒ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｇｒｏｕｐ　Ｓ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｃｏｒｅ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｉｎｊｕｒｙ，ｒｅｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＳＯＤ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＴＰ，ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎ—　ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＤＡ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＯＳ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｃｏｒｅ　ｏｆ　ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ　ｉｎｊｕｒｙ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＳＯＤ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＭＤＡ　ａｎｄ　ＡＴＰ，ｏｒ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＯＳ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｍ　ａｎｄ　ＥＡＮ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｇｒｏｕｐ　Ｍ　ｏｒ　

｝广西自然科学基金资助项目（编号：２０１３ＧＸＮＳＦＢＡ０１９１２４）　△通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｂｄｏｎ　ｇ２００７＠１６３．ｃｏｎ　广东医学２０１５年５月第３６卷第９期　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｍａｙ．２０１５，Ｖｏ１．３６，Ｎｏ．９　ＥＡＮ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｓｃｏｒｅ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｉｎｊｕｒｙ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＳＯＤ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＴＰ，　ａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＤＡ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＯＳ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　ＥＡ（Ｐ＜　０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ　ａｔ　Ｎｅｉｇｕａｎ　ｐｏｉｎｔ　ｃａｎ　ａｌｌｅｖｉａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｊｕｒｙ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ａｍｅｌｉｏ—　ｒａｔｅ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｅｎｅｒｇｙ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ　ＣＰＢ，ｖｉａ　ｔｈｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｅｌｅｃｔｍａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ；Ｎｅｉｇｕａｎ；Ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｂｙｐａｓｓ；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ；ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　

体外循环（ＣＰＢ）过程中有多种促进氧自由基骤然　增加的因素，如吸人高浓度的氧、血液与ＣＰＢ管道直　接接触、肠道内毒素的转移和心肌缺血再灌注损伤　等…。过量氧自由基引起的脂质过氧化反应，使得心　肌细胞的氧化与抗氧化能力失衡，导致ＣＰＢ后出现心　律失常和心功能下降等严重并发症　。内关穴属手厥　阴心包经，素有“内关主刺气快攻，兼炙心胸肋痛疼”　的古训，大量基础和临床研究　。　证实电针刺激内关　穴具有抗心律失常、抗心肌缺血和抗缺血再灌注损伤　等作用，但其具体机制仍不清楚。２０１４年２—８月本研　究拟观察电针内关穴对大鼠ＣＰＢ后心肌线粒体超微　结构和氧化应激反应的影响，探讨其产生心肌保护作　用的机制。　１材料与方法　１．１　主要仪器和试剂　ＢＬ一４２０Ｅ型生物机能实验系　统（成都泰盟科技有限公司）；ＴＫＲ一２００Ｃ型动物呼吸　机（江西特力麻醉呼吸设备公司）；Ｓｔｏｅｋｅｒ　ＩＩＩ型双头滚　压泵（德国Ｓｔｏｃｋｅｒｔ公司）；ＨＡＮＳ一２００型电子穴位治　疗仪（北京华运安特科技有限责任公司）；ＵＶ一７５０４Ｃ　型紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；Ｈ一５００　型透射式电子显微镜（日本日立公司）；ＦＶ１０００一ＩＸ８１　型激光共聚焦显微镜（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）。超氧化物　歧化酶（ＳＯＤ）检测试剂盒、丙二醛（ＭＤＡ）检测试剂盒　和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）含量检测试剂盒均购自南京建成　生物工程研究所；二氨基联苯胺蛋白定量（ＤＡＢ）试剂　盒购自上海碧云天生物技术有限公司；二氯双氢荧光　素（２　，７　一ｄｉｃｈｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ—ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＤＣＦＨ—ＤＡ）　购自美国Ｓｉｇｍａ公司。　１．２　实验动物与分组本动物实验经广西医科大学　动物委员会批准，并符合国家科技部《关于善待实验动　物的指导性意见》的规定。清洁级健康ＳＤ大鼠６０只，　４～６月龄，体重３２０～４２０　ｇ，雌雄不限，由广西医科大　学实验动物中心提供。采用随机数字表法，将６０只大　鼠随机分为４组：假手术组（ｓ组）、模型组（Ｍ组）、电　针内关穴组（ＥＡ组）和电针非穴组（ＥＡＮ组），每组１５　只。ｓ组仅行麻醉和动静脉插管；Ｍ组行ＣＰＢ　２　ｈ；ＥＡ　组和ＥＡＮ组行ＣＰＢ　２　ｈ，且在ＣＰＢ期间实施电针刺激，　其中ＥＡ组取双侧内关穴，ＥＡＮ组取双侧内关穴旁开　０．５　ｅｍ处。　１．３　ＣＰＢ模型制备参照文献［６］制作大鼠ＣＰＢ模　型。腹腔注射１０％乌拉坦１０　ｍＬ／ｋｇ麻醉，１６Ｇ静脉导　管行气管插管后机械通气，潮气量８～１０　ｍＬ／ｋｇ，呼吸　－１３２３・　频率６０～７０次／ｍｉｎ。经右前肢和左后肢皮下插入心　电图（ＥＣＧ）电极，行ＥＣＧ监测，右股动脉置２４Ｇ套管　针，经压力换能后实时监测血压，右颈总动脉插入球囊　直径３．５　ｍｍ的双腔球囊扩张导管至大鼠升主动脉，以　备主动脉阻断和心肌停跳液灌注。采用尾动脉插管灌　注，右颈静脉插管引流建立ＣＰＢ。无血预充，灌注流量　约为每分钟１００　ｍＬ／ｋｇ，ＯＬ稳态管理血气。ＣＰＢ开始　后逐渐降温，１５　ｍｉｎ后大鼠鼻温接近３２℃，充气升主动　脉内双腔球囊扩张导管套囊，阻断升主动脉，并灌注　Ｓｔ．ＴｈｍｏａｓⅡ型心脏停跳液１５　ｍＬ／ｋｇ，使心脏停跳。　在心脏停跳１５　ｍｉｎ后逐渐复温，并于心脏停跳３０　ｍｉｎ　时套囊放气，开放升主动脉，恢复心脏供血。ＣＰＢ转　流２　ｈ后停机。待自主呼吸恢复平稳后停止机械通　气，拔除气管导管，并密切观察大鼠麻醉复苏后生命　体征。　１．４　电针方法ＥＡ组于尺骨和桡骨的骨缝问，距腕　关节约３　ｍｍ处取内关穴，定位方法参照文献［７］；　ＥＡＮ组取双侧内关穴旁开０．５　ｃｍ处。两组电针刺激　均在ＣＰＢ开始后实施，用０．３　ｍｍ×１５　Ｉｎｍ毫针刺入皮　下２　ｍｍ，接电针仪，疏密波，频率２　Ｈｚ／１５　Ｈｚ，强度１　ｍＡ，ＣＰＢ结束时拔针。　１．５标本制备麻醉复苏后２　ｈ，将大鼠颈椎脱臼处　死，剖胸留取左心室心肌组织。部分心肌迅速置于　４ｏ【二的２％戊二醛溶液内，置入４℃冰箱以备用；余下心　肌组织置于液氮保存，然后置入一７０￣Ｃ冰箱备用。　１．６观察指标　１．６．１　心肌组织超微结构观察和线粒体损伤评分　取２％戊二醛固定后的心肌组织，经漂洗、固定、染色、　包埋和切片后，在透射电镜下观察线粒体损伤程度并　评分。评分方法参考文献［８］：每份电镜标本随机选　择１０个视野，每视野随机选２０个线粒体，观察线粒体　损伤情况。０分，线粒体结构正常；１分，线粒体结构基　本正常，基质颗粒少量丢失；２分，线粒体肿胀，基质透　明；３分，线粒体峭断裂，基质凝固；４分，线粒体膜降　解，嵴消失，空泡样变。　１．６．２心肌组织ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含量和ＡＴＰ含量的　测定取一７０℃冰箱内冻存的心肌组织，称取重量后　制成５％的组织匀浆，严格按照试剂盒说明书，采用黄　嘌呤氧化法检测ＳＯＤ活性，硫代巴比妥酸法检测ＭＤＡ　含量，高效液相色谱法检测ＡＴＰ含量。　１．６．３　线粒体活性氧簇（ＲＯＳ）水平的测定　采用差　速离心法提取心肌线粒体：取一７０￣（２冰箱内冻存心肌