氧自由基
近年来的研究证实:动脉粥样硬化、脑细胞“衰老”及组织再灌注损害等多种疾病,与体内氧自由基产生过多,或清除功能减退及细胞脂质过氧化有关。
本文重点讨论氧自由基对脑细胞的损害及可能的防治对策。
1 自由基导致的脑及脑血管疾病
1.1 衰老
衰老过程涉及到许多内外因素,与衰老过程有关的最常见的内源性生化因子是自由基。国内外大量研究已证实:老年动物及老年人血清脂质自由基(脂质过氧化物) 水平增高,组织内(尤其脑,肝细胞内) 脂褐素含量增多。组织内脂褐素含量多少可做为衰老的客观依据之一,其形成与脂质自由基有关。脂质自由基的分解产物为醛类,它可与蛋白质、磷质和核酸的氨基起反应,使分子发生交联,交联的结果,使蛋白质变性,使酶失活。这些变性物质被吞噬细胞吞噬,但不能完全消化,结果不断增加细胞内的年色素。Harman 指出,逃脱中和的自由基所积聚的毒性作用,可能是衰老的根本原因。
1.2 动脉粥样硬化及脑血栓
花生四烯酸是细胞膜磷脂的重要组成部分,机体缺血缺氧后,细胞外液中的Ca + + 进入细胞内使细胞膜中的钙依赖的磷脂酶A2 被激活,后者使AA释出,AA 通过环氧化酶途径产生PGH2 (具有自由基性质的活性物质,PGH2 称氢过氧化物) ,后者在血小
板微粒体内,在血栓素合成酶作用下,生成血栓素(TXA2) ;在动
脉血管内皮细胞微粒体内,在前列腺素合成酶作用下,生成前列环素( PGI2 ) 。TXA2 和PGI2 是2 种作用完全相反的血管活性介质,前者主要为强烈的血管收缩剂和血小板聚集剂;后者的作用与之相反,当动脉血管内皮细胞受到损害时,PGI2生成减少,TXA2 的量及作用增多增强,导致血管痉挛和促进血栓形成。此外,AA 通过脂氧化酶途径产生的5 - 过氧化氢花生四烯酸(5 - HPETE) 和脂质自由基强抑制前列环素合成酶的作用,使PGI2 合成减少。5 - HPETE 尚可激活血小板中的血栓素合成酶,导致血栓形成的恶性循环。
1.3 脑的再灌流性损害
缺血后再灌流氧自由基的产生,是脑再灌流性损害的根本。通常情况下,机体自由基的生成与清除能力保持动态平衡。当缺血时,则清除超氧阴离子和过氧化氢的自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD) 和谷胱甘肽过氧化物酶( GSH - PX) 降低,但在再灌流时自由基反应更为明显。郑彩梅等根据动物实验结果确认:脑缺血后在缺血期花生四烯酸代谢与氧自由基反应即已激活,并证实变化高峰在再灌流早期;陈曼娥等的实验也证明,脑再供血后,脑
组织脂质过氧化反应更趋严重。脑缺血后再灌流氧自由基的产生途径有: (1) 脑缺血时ATP 不被利用,依次降解为次黄嘌呤,同时钙离子激活蛋白酶,使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶,后者使大量堆积的次黄嘌呤产生超氧阴离子; (2) 低血氧时酶自由基积累,再灌流时自身氧化产生超氧阴离子及氧化酶;(3) 再灌流时,硫
酸亚铁复合物自身氧化产生超氧阴离子。此外,再灌流后三羧酸循环尚未恢复,而再灌流却提供了糖酵解所需要的葡萄糖,从而加重了酸中毒,使再灌流区H+ 浓度升高,H+ 与超氧基反应产
生H2O2 ,H2O2 在活性铁的催化下产生HO- 。再灌流时产生的些具有强烈生物氧化活性的自由基,具有损害膜不饱和脂肪酸的作用,其机制为:细胞膜是脂质双层结构,其疏水极存在大量不饱和脂肪酸,在不饱和脂肪酸内存在碳与碳之间的不饱和双带,这就削弱了邻近碳原子的碳酸键,由于不饱和双带内的电子离域作用,在很小的能量下,邻近碳氢键就可以发生反应,氧自由基由此使不饱和脂肪部分激活,在金属复合物特别是铁的参与下,进而引起一系列的自由反应,造成膜不饱和脂肪酸的脂质过氧化,导致脂膜局部破坏,直至溶解,这些自由基同时也可造成微血管通透性增加及微循环障碍。HO- 可使磷酸改变活性,膜磷脂释放花生四烯酸,AA 在脂质过氧化酸作用下生成慢反应物质及组织胺,使微血管通透性增强。AA 经过如前述及一系列反应最终生成PGI2 及TXA2 ,缺血后血管内皮自由基阻止PGI2 合成,破坏了PGI2 和TXA2 之间的平衡使TXA2 增高,微血栓形成,微循环出现障碍。
3 清除及终止体内自由基及其合成的几种可能对策
311 钙拮抗剂
抑制Ca + + 内流,防止磷脂酶A2 被激活,从而中断PGS(前列腺素) 及LTS(白三烯) 的合成。中药丹参及莨菪类药物具有这方面的用。
312 超氧化物歧化酶(SOD)
是机体内最有效的自由基清除酶,可分铜- 锌,锰,铁3 种类型,具有清除超氧阴离子的作用,从而阻止由超阴离子启动的自由基连锁反应。
313 谷胱甘肽氧化酶(GSH - PX)
是含硒(Se) 的酶,可以使H2O2 、脂质过氧化物等,还原为无毒或较小毒性的物质,在保护生物膜方面极为重要。反应过程中的必须由GSH(还原型谷胱甘肽) 提供。
314 选择性TXA2 (血栓素)
为合成酶抑制剂。这类药物可选择抑制TXA2合成,使PGH2 转向合成更多的PGI2 ,调整TXA2 与PGI2 的平衡。
315 低分子还原性物质
如维生素E、维生素C 及辅酶Q 等。维生素E能抑制脂质过氧化反应,是有效的生物抗氧化剂,能直接作于脂质,并与膜脂肪酸结合成复合物而稳定膜结构,还可以稳定血循环中血小板和白细胞,保护内皮细胞以维持细胞功能,并能协同其他还原物质起作用;维生素C 具有使单线态氧转变为基太氧作用,对氧阴离子和羟自由基有一定的清除作用;辅酶Q 具有抗过氧化反应的作用。
316 甘露醇
通过渗透压梯度对脑组织起脱水作用。目前证实为体内自由基HO- 的清除剂,实验研究证实:DM2SO 二甲基氧化硫具有较强清除HO- 的作用。
317 别嘌呤醇(羟吡唑嘧啶)
是一种有效的黄嘌呤氧化酶竞争抑制剂,能抑制黄嘌呤氧化酶阻止自由基的产生。另外,还有巴比妥类药物、皮质类固醇、去铁胺等,也具有清除或终止体内自由基合成的作用,但自由基清除剂的清除作用并不是一个简单的反应过程,目前还不十分清楚,需进一步研究探讨。
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
自由基总结
f 也称氧化压力。化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。在化学中，这种现象称为“氧化”。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等等疑难杂症。此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类衰老和患病的根源。 氧自由基：我们生活在富含氧气的空气中，离开氧气我们的生命就不能存在，但是氧气也有对人体有害的一面，有时候它能杀死健康细胞甚至致人于死地。当然，直接杀死细胞的并不是氧气本身，而是由它产生的一种叫氧自由基的有害物质，它是人体的代谢产物，可以造成生物膜系统损伤以及细胞内氧化磷酸化障碍，是人体疾病、衰老和死亡的直接参与者，对人体的健康和长寿危害非常之大。
正常情况下，参与代谢的氧大多数与氢结合生成水，然而有4－5％的氧将被酶所催化形成超氧阴离子，后者又可形成过氧化氢，它们都属于自由基。自由基有多种,如氧自由基和羟自由基 ,是指那些最外层电子轨道上含有不配对电子的原子、离子或分子。自由基具有高度的氧化活性，它们极不稳定,活性极高,它们攻击细胞膜、线粒体膜,与膜中的不饱和脂肪酸反应，造成脂质过氧化增强。脂质过氧化产物（mda等)又可分解为更多的自由基，引起自由基的连锁反应。这样，膜结构的完整性受到破坏，引起肌肉、肝细胞、线粒体、DNA、RNA 等广泛损伤从而引起各种疾病,诸如炎症、癌症、扩张性心肌病、老年性白内障、哮喘等疾患，故自由基是人体疾病、衰老和死亡的直接参与和制造者。 氧自由基的克星------抗氧化剂，（也就是氧自由清除剂或者抑制剂）它对人体的健康可是有着密切的关系。根据医学上的研究，维他命、矿物质及酵素中具保护身体、防止自由基（free radicals）形成功能者，就称作抗氧化剂。 而我们的身体，当然也会有自然产生的自由基清除者来抑制自由基形成，此外，身体自然制造的酵素，也可中和自由基。除了这些酵素，我们还可由饮食中摄取天然的抗氧化剂，例如：维他命A、C、E及硒，以协助体内清除自由基。如果人体系统在自由基的充斥下，而自然产生的自由基清除者无法“应付”时，健康就会亮起红灯。因此，人们在平时就应通过饮食，摄取天然的抗氧化剂，或服用一些补充品，来协助身体破坏自由基。号称第六生命元素的壳寡糖，可完全净化自由基，使自由基失去活性，达到抵御疾病和延缓衰老的作用。在1991年的国际学术会议上，美欧等许多国家的科学家一致把壳寡糖与蛋白质、脂肪、糖类、维生素、矿物质并列誉为人体第六生命要素。壳寡糖能降血脂、降血压、能抗癌，对现代文明病有惊人的防治作用。壳寡糖是机体“清道夫”，能排除体内自由基，提高机体免疫力，减肥美肤，延缓衰老。 我们知道，细胞经呼吸获取氧，其中98％与细胞器内的葡萄糖和脂肪相结合，转化为能量，满足细胞活动的需要，另外2％的氧则转化成氧自由基。由于这种物质非常活跃，几乎可以与各种物质发生作用，引起一系列对细胞具有破坏性的连锁反应。 在一般情况下，细胞不会遭到这种分子杀手的杀害，这是因为我们人体细胞存在着大量氧自由基的克星——抗氧化剂，比如，脂溶性的维生素E、水溶性的维生素C及一些酶类等等，这些天然的抗氧化剂能够与氧自由基发生氧化还原反应，使氧自由基被彻底清除，而只有在某些情况下，氧自由基才会致细胞甚至肌体于死地。 自由基清除剂：至于对付氧自由基的办法，目前已经发现了许多氧自由基的克星，也就是氧自由清除剂或者抑制剂，其作用机理有
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其应用研究
网络出版时间：2012-12-19 08:52 网络出版地址：https://www.360docs.net/doc/ce409627.html,/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0852.010.html 2012-11-20 超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其 应用研究 赵永强1,2，林洪1，李来好2,*，杨贤庆2，郝淑贤2，张牧天3 (1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广 东广州 510300； 3. 北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085) 摘要：该研究以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料，经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针：2-（2’-吡啶 亚胺甲基）吡啶（2-APC），所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认。 利用2-APC与超氧阴离子自由基（O2·-）发生荧光淬灭反应的原理，建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系 产生O2·-的方法，该方法反应体系最佳条件为：反应pH=8.2；反应温度T=40℃；反应时间t=40 min。测 定条件为：λex=295 nm、λem=365nm，狭缝宽度5 nm。邻苯三酚在0.4×10-6~8.0×10-6 mol?L-1浓度范围内 与相对荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=37.567x+55.581，R2=0.9834。应用该方法对L-抗坏 血酸清除O2·-能力进行评价，结果表明L-抗坏血酸清除O2·-的IC50值为0.182 mmol?L-1。 关键词：超氧阴离子自由基；荧光探针；合成；应用 Fluorescence Probe Method for Superoxide Anion Radical Detection and its Application Study ZHAO Yong-qiang 1,2，LIN Hong1，LI Lai-hao2,*，YANG Xian-qing2，HAO Shu-xian2，ZHANG Mu-tian (1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, P.R.China； 2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou 510300, P.R.China； Beijing Normal University-Hong Kong Baptist University United International College, Zhuhai 519085, P.R.China) Abstract：A novel fluorescence probe 2-APC was synthesized by 2-aminopyridine and 2-pyridinecarbaldehyde based on nucleophilic substitution reaction in this study. The reaction product was characterization by melting test, elemental analysis, infrared spectrum and 1HNMR. A fluorescence probe method for superoxide anion radical detection was established. The optimum conditions of this reaction system were as follows, pH, temperature and time of reaction system was 8.2,40 oC and 40 min respectively. The conditions of fluorimetric determination were as follows, λex=295 nm, λem=365nm and the slit width was 5 nm. In the range from 0.4×10-6 M to 8.0×10-6 M, relative fluorescence intensity (y) and pyrogallol concentration (x) were shown a good linear relationship, y=37.567x+55.581，R2=0.9834. Superoxide anion radical (O2·-) scavenging activity of L-ascorbic acid was evaluated using the above mentioned method, the results showed that the IC50of L-ascorbic was 0.182×10-3mol?L-1. Key words：superoxide anion radical, fluorescence probe, synthesis, application 中图分类号：O657.34 文献标识码：A 文章编号： 活性氧是需氧生物细胞进行正常代谢的产物，生物体生命代谢过程中通过非酶反应与酶反应不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide, 收稿日期：2012 基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD28B00)；国家现代农业产业技术体系(CARS-49)；国家海洋局海 洋公益性行业科研专项(201005020；2013418018)；茂名市科技计划项目(2011A01002) 作者简介：赵永强(1985—)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：zhaoyq1122@https://www.360docs.net/doc/ce409627.html, *通信作者：李来好(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail：laihaoli@https://www.360docs.net/doc/ce409627.html,
超氧阴离子产生速率测定
超氧阴离子产生速率测定 羟氨氧化法 (王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57) 一、原理 植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如O2·ˉ、OH·、O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡。 二、材料、仪器设备与试剂 (一)材料 植物叶片、花瓣等器官 (二)仪器设备 低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、 研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架 (三)试剂 (1)0.05 mol·L-1磷酸缓冲液PH=7.8(0.66304g的NaH2PO4.2H2O和16.3849g的 Na2HPO4.12H2O定溶1000mL，校正PH) (2)10m mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到500mL，(冷) (3)17m mol·L-1对氨基苯磺酸(C6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到500mL，(冷，磁) (4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g定溶到500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全) 三、试验步骤 (1)制做亚硝酸根标准曲线 2mL系列浓度的NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入4mL对氨基苯磺酸和4mLa－萘胺于25℃保温20min，然后测定OD530以［NO2－］和测得的OD530值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线 (2)取0.2g植物材料，加入1.0mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.8)于冰浴研磨
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法) 简介： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 3、 研钵或匀浆器 4、 离心管或试管 5、 低温离心机 6、 恒温箱或水浴锅 7、 比色杯 8、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液 30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、配制系列NO2-标准溶液：取出NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水1—— 系列NO2-标准(1-6号管) — 1 — 待测样品——0.25 O2- Lysis buffer ——0.25 羟胺溶液——0.5 混匀，25℃水浴孵育。 氨基苯磺酸显色液0.5 0.5 0.5 萘胺显色液0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育。 4、O2-测定：以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管、测定管530nm处吸光度(A标准、A测定)。 计算： 以系列NO2-标准(1-6号管)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算NO2-含量。根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子
胞内羟基自由基和超氧阴离子自由基测定
活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。 胞内羟基自由基测定机理： 2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。 尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。 胞内羟基自由基测定方法： 在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。 胞内超氧阴离子自由基测定机理： 一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。 胞内超氧阴离子自由基测定方法： 在本研究中，用PBS洗涤1 mL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于20 μM DHE（Invitrogen，美国）的终浓度下温育30 min。用PBS洗涤一次后，通过FL2通道检测胞内超氧阴离子自由基水平。
超氧阴离子自由基清除
一．实验原理： 该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。 二．实验仪器：分光光度计 三．实验试剂： 一：液体40mL×1瓶； 二：液体1mL一瓶； 三：粉剂一支； 四：粉剂一支； 五：1mg/mL芦丁标准品，1mL 四．溶液配制： 一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液； 二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光； 三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用； 四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。 五．实验步骤： 测定吸光值。
六．清除能力计算： 超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100 注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0； 2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。 七．注意事项： 1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔； 2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。 3. 试剂三建议全程冰上操作。试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！ 4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。 5. 部分物质会导致显色加深，导致求得的抑制率是负值，如遇到此类现象请先确定该物质是否具有超氧阴离子清除能力，再考虑更换方法，如邻苯三酚自氧化法等进行测试。
抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒
抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒 说明书修订日期：2015.07.13 Cat number：KGT012 Store at4℃for6months For Research Use Only（科研专用） 一、测定原理 模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基O2—，加入电子传递物质及gress 氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有O2。抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，而如果被测样本中含有产生O2。物质时，则比色时测定管的吸光度高于对照管的吸光度，通过以维生素C做标准，可计算出被检物品对O2。的影响能力。 二、试剂盒组份 组份KGT012 50assays Buffer A 5.0mL Buffer B 5.0mL Buffer C 5.0mL Buffer D350μL Buffer D稀释液 5.0mL 试剂E1支 试剂F1支 Vc标准品4支 注意事项 1．Buffer A室温较低时会有部分结晶析出，溶解后加蒸馏水稀释10倍至1×Buffer A50ml。 2．Buffer D用前用Buffer D稀释液按1︰14稀释至1×Buffer D（不可冷冻，4℃可保存2个月）。 3．试剂E配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。 4．试剂F配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。 5．显色剂配制：试剂E︰试剂F︰冰乙酸＝3︰3︰2的体积比配制，4℃避光保存（冰乙酸自备）。 6．Vc标准贮备液配制：将一支Vc标准品加蒸馏水定容至5ml（Vc标准配制后当天内使用）Vc标准品工作液（0.15mg/ml）配制：取1ml贮备液加4ml蒸馏水，5倍稀释现配现用。 Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/ml Vc标准品工作液需30分钟内检测。
自由基及检测方法
ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： V： ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶于
负氧离子与自由基的关系
负氧离子与自由基的关系 摘要：外界环境中的阳光辐射、空气污染、频发的雾霾天气、吸烟、农药等都会使人体产生有害的自由基，导致人体患病、衰老。我们要积极可以抗氧化、中和消减自由基，抵抗疾病和衰老，空气负离子就是具有抗氧化防衰老、消减自由基效果的自然因子。 外界环境中的阳光辐射、空气污染、频发的雾霾天气、吸烟、农药等都会使人体产生有害的自由基，使核酸突变，导致人体患病、衰老。 自由基的危害 自由基带有不稳定的氧分子，它们由衰老、日光暴晒或是接触过的有毒化学物中产生。因为失去1个电子变得不稳，为了使自己稳下来，便尝试从细胞里夺回失去的电子，因而损害健康的细胞，引起病变，甚至增加患癌的机会。 众多的医学研究和临床试验证明，人体细胞电子被抢夺是万病之源。自由基的危害很大，夺去了细胞的电子会导致疾病;如果自由基
夺去了细胞蛋白分子的电子，使蛋白质接上支链发生烷基化，形成畸变的分子就会致癌。 如何消减体内自由基? 虽然我们难逃自由基的“魔爪”，但是我们积极可以抗氧化、中和消减自由基，抵抗疾病和衰老，空气负离子就是具有抗氧化防衰老、消减自由基效果的自然因子。 空气负离子可以消减体内自由基，减轻自由基的危害的原理主要是因为负离子具有抗氧化(还原性)防衰老的突出作用。空气负离子的抗氧化性(还原性)是一种基本的化学原理，化学反应就是电子层上分子的交换，失去分子叫氧化、得到分子叫还原。失去电子的分子(团)或原子显示正电性的叫正离子，获得多余电子的分子(团)或原子显示负电性的叫负离子，因此空气负离子带有负电位即有多余的电子，可以补充给老化的细胞和血球电子，防止了电子抢夺的恶性循环、具有消减自由基的效果。 环境污染会导致人体内的自由基剧增，负氧离子不仅能消减人体内已形成的自由基，而且可以主动出击、吸附凝聚沉淀空气中的小粒
羟基自由基与臭氧比较优劣
纳米水雾是一种氧化还原能力极强的物质。它具有以下特点：它非常活跃，可以与一切有机物质发生链式反应，可以杀死病毒、细菌，降解农药、激素、抗生素等，它与污染物反应后的产物是水、CO2、无机盐，且剩余纳米水雾最终还原成水，没有其他物质生成，对人体没有任何危害。 好尔卫盾产品工作时产生的是纳米水雾，而不是臭氧。通过以下实验说明： 一、将5滴有机蓝墨水加入即时产生的含有纳米水雾的200ml水溶液中，5秒以内蓝墨水完全褪色；（有机蓝被氧化而褪色）。 将5滴有机蓝墨水加入200ml纯净水中，通入臭氧，20分钟以后略有褪色。 二、200ml纯净水通入臭氧20分钟，静置5分钟，加入5滴有机蓝墨水，不褪色； 含有纳米水雾的水溶液200ml，静置两天，加入5滴有机蓝墨水，10秒内褪色。 三、好尔卫盾在纯净水中工作并不产生异味。如果有臭氧产生的话，就有腥臭味。 纳米水雾相比臭氧具有以下优势： 1、氧化能力强，其标准电极电位达到2．80 V，仅次于F（2.87V），高于臭氧（2.07V），是一种氧化能力极强的氧化剂；可以与一切有机物质发生链式反应杀死病毒、细菌，降解农药等。 2、反应速率常数大，非常活泼，与大多数有机物反应的速率常数在106～1010mol_1·L·s-1非常迅速；也就是说能瞬杀死病毒，细菌，降解农药，将它们分解为无毒无害的物质。 3、选择性低，且与被氧化的反应物浓度无关。即为再少的细菌，再低浓度的农残都能被处理达到国家相关标准。 4、纳米水雾本身就是在水溶液中产生的，相对于臭氧保存的时间长。而臭氧在空气中的分压接近于0，所以在水中实际的溶解度很小，几乎不能在水中保存。. 5、纳米水雾本身无嗅无味，处理效率高，反应后的产物是水、CO2、无机盐，不产生二次污染．且剩余的纳米水雾最终还原成水，不产生其他物质。臭氧本身就有腥臭味，对人的神经系统有损害。 6、若在使用好尔盾产品时也闻到了刺激性气味，那不是产生了臭氧，而是因为纳米将水中的消毒剂残留的Cl-氧化成了氯气。
玉郎伞提取物对超氧阴离子自由基和羟自由基的抑制和清除作用_焦杨
*广西自然科学基金资助项目(桂科自9912038)1第一附属医院药剂科收稿日期:2003-05-10 玉郎伞提取物对超氧阴离子自由基和羟自由基的抑制和清除作用 * 焦 杨 段小群 黄仁彬 韦锦斌 蒋伟哲 1 (广西医科大学药理学教研室 南宁 530021) 摘要 目的:探讨玉郎伞提取物(Y LS)对氧自由基的抑制和清除作用。方法:采用分光光度法检测Y L S 对超氧阴离子自由基(O 2·-)和羟自由基(·O H )的清除及抑制作用。结果:Y L S 浓度为0.15、0.30、0.60g /ml 在体外对·O H 的清除率分别为7.1%、29.1%、68.5%,对O 2·-的清除率分别为40.5%、49.9%和64.5%,对O 2·-生成的抑制率分别为48.0%、60.3%和68.8%。结论:Y LS 对O 2·-具有明显的抑制及清除作用,对·O H 也有一定的清除作用。关键词 玉郎伞提取物;超氧阴离子自由基;羟自由基;清除作用中国图书资料分类法分类号 R285.5 SCAVENGING AND I NHIBITIING EFFECT OF YULA NGS AN EXTRACT ON SUPEROXI -DE ANION FREE RADICAL AND HYDROXY FREE RADICAL J iao Yang ,Duan Xiaoqun,Huang Renbin,et al.(Depa rtm ent of Pha rmaco logy ,Guang xi Medical Univ ersi-ty ,Nanning 530021China ) Abstract Objective :To study the scavenging effect o f YU LANGSAN ex tract on supero xide anio n free radical (O 2·-)and hydrox y free radical (·O H ).Methods :Spectro photometry (w av e leng th 322nm a nd 536nm )w as used to observ e the effects o f YLS o n O 2·-and ·O H .Result :The lev el of ·O H was reduced by 7.1 %,29.1%,68.5%in the presence o f YLS 0.15,0.30,0.60g ·ml -1,the lev el of O 2·-w as reduced by 40.5 %,49.9%and 64.5%,respectively .The genera tion o f O 2·-w as inhibited by 48.0%,60.3%a nd 68.8%,respectiv ely ,in the presence of YLS 0.15,0.30,0.60g ·ml -1in v itro .Conclusion :The results show that YLS can g rea tly scav eng e O 2·-(P <0.01)and ·O H,and inhibit the productio n of O 2·-.Key words YU LANGSAN ex tract;superoxide a nion free radical;hydrox y free radical;scav enging effect 玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药,为蝶形花科植物疏叶崖豆M illettia pulchra Kur z va r .lax io r (Dunn )Z .W ei 的块根,具有舒筋活络、补虚润肺之功能,民间用于腰腿痛、风湿痛、慢性肝炎、肺结核等的治疗[1]。本研究小组的一些药理学研究初步表明,玉郎伞提取物(Y L S )具有降低血压、减轻心肌缺血再灌注损伤、减轻急性化学性肝损伤等作用[2]。本研究探讨其在体外对连苯三酚氧自由化产生的氧自由基(O 2·-)和由邻二氮菲-Fe 2+/H 2O 2体系产生的羟自由基(·O H)的抑制和清除作用。 1 材料和方法 1.1 材料:Y L S 由本室自行提取,每毫升溶液含生药3g 。连苯三酚为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产,批号为F010630;邻二氮菲、硫酸亚铁为上海试剂三厂生产,均为分析纯。 1.2 仪器:分光光度计(DU -640,美国Beckman 公司)。1.3 方法[3,4]: 1.3.1 ·O H 的生成及清除率的测定:配制含邻二氮菲0.75mmo l /L 、Fe SO 40.75mmol /L 磷酸盐缓冲液(pH 7.3)150mmol /L 的溶液作为反应体系,加0.01%H 2O 2(损害)或不加H 2O 2(未损害),37℃保温60min 后,以磷酸盐缓冲液为参比,分别测536nm 时的吸收值,得A 损害与A 未损害。上述反应体系加入0.01%H 2O 2和一定量的Y L S,以同浓度Y L S 作参比,测536nm 时的吸收值,即得A 样。重复8次。按下式计算·O H 清除率:·O H 清除率(S %)=(A 样-A 损害)/(A 未损害-A 损害)×100 %。1.3.2 O 2·-的生成及清除率的测定:配制含磷酸盐缓冲液(pH8.3)50mmo l /L 、连苯三酚0.2mmo l /L 的溶液作为反应体系,反应温度为25℃,测定波长为322nm 。此反应体系中加入一定量Y L S,以同浓度Y L S 作参比,测定反应启动后10s 时的吸收值(A 样)。另取试剂同上,不加Y L S,作为空白对照,以PBS 为参比,测反应启动后10s 时的吸收值(A 空)。重复8次。按下式计算清除率:O 2·-清除率(S %)=(A 空-A 样)/A 空×100 %。· 22·广西医科大学学报 J OU RNAL O F GUANGXI M EDICAL UN IV ERS ITY 2004Feb ;21(1) DOI:10.16190/https://www.360docs.net/doc/ce409627.html, k i .45-1211/r.2004.01.010
植物超氧阴离子自由基含量的测定LT
植物超氧阴离子自由基含量的测定 一、实验目的 了解实验原理，掌握实验技术 二、实验原理 超氧阴离子（O?? 2）能与羟胺反应生成NO3-，反应式为： NH2OH+2O?? 2+H+ = NO2-+H2O2+H2O 其中NO2-进一步反应生成对氨基磺酸、反应后再生成α-苯胺，最后生成红色的偶氮化合物。其中，偶氮化合物在520nm到560nm下有吸收峰，本次实验在530nm下进行比色。 三、实验材料与仪器 植物材料 小麦叶片，荠菜叶片 试剂 NaNO2- AR 100μl；蒸馏水；对氨基酸苯磺酸；α-苯酸；PBS；盐酸羟胺；对氨基苯磺酸；α-苯胺。 仪器 可见光分光光度计，型号V-1100D 四、实验方法 1.标准曲线 1 2 3 4 5 6 7 NO2-标准液（50μg/ml）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 对氨基酸苯磺酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 α-苯酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0然后置于30o C培养箱中保温30min显色反应测定A530，以NO2-为横坐标，A530值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. O?? 2的提取 小麦叶片称取1.0g。加入少量PH7.8的PBS研磨。之后定容到5ml。10000rpm 45o C离心 10min。之后取上清液备用。 注：空白对照直接用上清液显色测本底值NO2-含量。 3.组织中O?? 2测定 （1）NO2-的产生 O?? 2 PBS 盐酸羟胺标样 2.0 1.5 0.5 调零 2.0 2.0 0 之后置于25o C保温20min （2）NO2-显色，调标准线
超氧阴离子清除能力试剂盒说明书
货号：MS1518 规格：100管/96样 超氧阴离子清除能力试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 测定原理： AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO 2－，NO 2 －与对氨基苯磺酸和α－ 萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。 自备实验用品及仪器： 天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体1.5mL×1支，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加6mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体7.5mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂五：液体7.5mL×1瓶，4℃避光保存。 样品处理： 1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提 取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细 胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 3.培养液或其它液体：直接检测。 4.粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。 第1页，共2页