悬浮细胞间接免疫荧光试验
细胞表面间接免疫荧光染色
细胞表面间接免疫荧光染色细胞表面间接免疫荧光染色是一种常用的细胞学实验技术，用于研究细胞表面蛋白的分布和表达。
该技术通过标记特定抗体，利用荧光染料对其进行可视化，从而在显微镜下观察和定位特定抗原在细胞表面的分布情况。
本文将详细介绍细胞表面间接免疫荧光染色的原理、步骤和应用。
一、原理细胞表面间接免疫荧光染色的原理基于免疫反应。
首先，需要选择与目标抗原特异性结合的一对抗体，其中一种抗体被称为一抗，另一种抗体被称为二抗。
一抗是直接与目标抗原结合的抗体，而二抗则与一抗结合。
一般情况下，一抗是小鼠或兔子产生的，而二抗是针对小鼠或兔子IgG的抗体。
二、步骤1. 细胞固定：将待染色的细胞固定在载玻片上，常用的固定剂包括甲醛、乙醛和冰乙酸。
2. 渗透：为了提高染色抗体的进入细胞的能力，需要对固定的细胞进行渗透处理。
一般使用0.1% Triton X-100或0.5% Tween 20进行渗透。
3. 阻断：为了防止非特异性结合，需要对细胞进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）和羊血清。
4. 一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到载玻片上，与细胞孵育。
一抗与目标抗原结合后，可以利用荧光标记的二抗进行可视化。
5. 二抗孵育：将荧光标记的二抗溶液加到载玻片上，与一抗结合。
常用的荧光标记物有荧光素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）和碳氰菲（Cy5）等。
6. 洗涤：将载玻片进行洗涤，去除未结合的抗体。
7. 封片：将载玻片倒置在抗褪色剂中，然后用封片胶封住玻片边缘，使样品不受空气氧化。
三、应用细胞表面间接免疫荧光染色广泛应用于生命科学领域，尤其在细胞生物学和免疫学研究中发挥重要作用。
具体应用包括：1. 细胞表面蛋白定位：通过荧光染色，可以观察和定位特定蛋白在细胞表面的分布情况，如受体、通道蛋白等。
2. 细胞凋亡检测：细胞表面间接免疫荧光染色可以用于检测细胞凋亡相关标志物，如细胞色素C和半胱天冬酶-3等。
3. 免疫细胞分型：通过特定抗体的染色，可以对免疫细胞进行分型，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等。
小胶质细胞免疫荧光实验操作方法
小胶质细胞免疫荧光实验操作方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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新手细胞免疫荧光实验常见问题解答
新手细胞免疫荧光实验常见问题解答一提到蛋白实验，大家想到最多的就是Western blot，其实除了WB，免疫荧光技术也是一项很好的检测蛋白定位和表达的辅助试验。
今天，小六儿想跟大家分享一下自己在做免疫荧光试验的一些经验。
1、细胞密度细胞密度是整个实验是否能成功的关键点之一。
无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，爬片后细胞密度直接影响到后续的荧光拍照效果。
免疫荧光对细胞密度的要求不同于细胞划痕实验。
我们在做细胞划痕的时候，一定要等到细胞长满才可以进行后续操作，但是免疫荧光并不需要这么多的细胞数量，镜下细胞太多反而会让图像效果很乱，没有针对性；如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果。
第一张图可能不是很清楚，玻片四周的细胞较多，中间的细胞较少。
20倍镜下DAPI核染色可见细胞密度较大，其中亮度更显著的地方很可能是多层细胞叠加的效果。
那么我们该如何控制好细胞爬片时的密度呢？我们需要考虑的到爬片的尺寸和细胞生长时间。
爬片是一个动词，其实就是将玻片放到培养皿中，让细胞在玻片上生长。
第一点：我们要保证玻片上的细胞以单细胞层生长。
在这一点上，个人认为悬浮细胞很容易被吹打混匀，玻片上的细胞基本上可以保证处于同一层面。
但是贴壁细胞本身很喜欢抱团生长，所以镜下总是一簇一簇的细胞聚集，这种情况下就很难保证细胞生长同一层面了。
那么我们在做这一步的时候，建议大家用10μl的小枪头吸取细胞悬液，在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样（见下图），这么做相当于在缓慢加样的过程中，玻片上的细胞又完成了一次从外向内和从内向外的混匀过程，防止某一部位的细胞聚集。
加样结束后，镜下观察细胞初步密度。
如果细胞密度过大，可以将玻片上的细胞悬液吸回再重新稀释；如果细胞密度可以，只是还存在部分细胞聚集，可以用5ml的注射器针头轻轻拨动细胞悬液，注射器针头相对于10μl的枪头还是细的，不会破坏细胞形态。
第二点：我们要考虑到细胞生长的速度。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
IF步骤
IF/ICC实验步骤基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min。
（3）通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min。
通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4）封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5）一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。
少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的目的有三：①防止细胞从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；③使标本易于保存。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③应保持细胞和亚细胞结构；④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％里面室温下固定30分钟，洗两次，0.1% 100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的，在上面滴上稀释在1％中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上（大约每个玻璃片加10），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于和的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是（绿）和（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的，荧光标记物对照是荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在241296中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
4.其实小的的话，可以直接拿来染色，没问题的。
5.固定：用洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。
检验科免疫学常见检测与分析方法
检验科免疫学常见检测与分析方法为了满足你的要求，我将按照“检验科免疫学常见检测与分析方法”的格式来书写文章。
以下是文章的正文：检验科免疫学常见检测与分析方法免疫学是研究机体免疫系统结构、功能及其介导的免疫反应的科学。
在检验科中，免疫学检测和分析方法广泛应用于疾病诊断、药物研发和医学研究等领域。
本文将介绍免疫学常见检测与分析方法，包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、流式细胞术和酶联免疫斑点法。
一、间接免疫荧光法间接免疫荧光法是一种检测抗体和抗原相互作用的方法，其原理是利用荧光素标记的二抗结合到已与目标抗原结合的抗体上，通过荧光显微镜观察荧光标记的二抗与抗原结合的情况。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的优点，因此被广泛应用于疾病的早期诊断和研究中。
二、酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
该方法利用酶和底物的反应产生可见的颜色变化，从而判断目标物的存在和数量。
ELISA方法具有操作简单、灵敏度高和可扩展性强的特点，被广泛应用于病原微生物的检测、药物筛选和免疫学研究中。
三、流式细胞术流式细胞术是一种光学技术，用于分析和计数悬浮在流动液体中的细胞。
该方法通过染色和荧光素标记的抗体等实验步骤，通过流式细胞仪实时检测细胞的形态、大小、荧光强度等特征，从而实现对细胞种类和状态的分析。
流式细胞术在免疫学研究和临床诊断中的应用广泛，如检测白细胞亚群、免疫球蛋白等。
四、酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（ELISPOT）是一种高灵敏度、高特异性的单细胞分析技术，用于检测细胞产生的蛋白质分子。
该方法通过将待检细胞分泌的蛋白质与荧光素标记的抗体结合，通过荧光显微镜观察形成的颗粒斑点。
ELISPOT方法被广泛应用于评估免疫细胞的功能和活性，例如检测细胞因子的分泌和细胞毒性。
总结：免疫学在检验科中的检测和分析方法多种多样，包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、流式细胞术和酶联免疫斑点法。
细胞分子免疫学-间接免疫荧光法检测抗核抗体共16页文档
体
聪明出于勤奋，天才在于积累
间接免疫荧光法检测抗核抗体
<<细胞与分子免疫学技术>>
实验原理
ANA (Antinuclear Antibodies) 是针对细胞核成分的 自身抗体 间接免疫荧光法检测ANA是初步筛选实验 ANA阳性提示患有自身免疫性疾病SLE和其他不同类 型的风湿病，抗体滴度≧1:100 Hep-2细胞为抗原基质，产生的荧光核型与靶抗原的 分布部位有关
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
核仁型（Nucleolar pattern）
细胞核内部呈现大团 块或大颗粒状染色， 通常其数目不超过6 个。核仁型抗体与系 统性硬皮病、多发性 肌炎/硬皮病重叠综合 症、 SLE，以及系统 性风湿病相关
间接免疫荧光法检测ANA试剂盒
覆有Hep-2细胞和灵长类肝组织复合片的生物薄片 FITC-羊抗人IgG 阳性质控 PBS-Tween缓冲液
PBS/Tween20
Wash PBS-Tween冲洗1 s
5 min 浸泡
抗原片背面滤纸吸干
清水冲 洗加样 板，生物薄片上滴加1滴磷酸 盐缓冲甘油
北京欧蒙生物技术有限公司 抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒
oumeng
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
10X100X1000X 4L 标本 + 36 LPBS-Tween
25 µl per field
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（细胞免疫荧光步骤）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为细胞免疫荧光步骤的全部内容。
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0。
1％ TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透.3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大,扁平状的，比如大的培养皿)里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度.4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗(稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上.6.最后,在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul)，把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗,一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti—rat-Tex-Red （红）。
间接免疫荧光实验
试管等
生物薄片
生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片 反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。
滴定平板技术： 使实验操作标准化
将标本或试剂滴加 到加样板反应区上，然 后把生物薄片载片盖在 加样板的凹槽里，所有 生物薄片均与液滴接触， 反应同时开始.系统的几 何结构决定了液滴的位 置和高度.
均质型
颗粒型
核仁型
核膜型
实验报告
阴性：检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基
质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以 辨认的荧光模式
阳性：检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明
显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式
免疫荧光模式：阳性结果应报告
滴度：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反
４．第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加 样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物 薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30分钟。
５．清洗：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流 不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装 有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗5分钟。
６．加样：滴加20ul FITC标记的羊抗人IgG至洁净加样板的 反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意： 标记的IgG使用前需混匀。
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悬浮细胞间接免疫荧光试验
将淋巴细胞用PBS洗2次，1700rpm离心5min，细胞沉淀用PBS悬浮，细胞浓度1~3×10
7
个/mL，取50~100uL细胞悬液滴在6孔或12孔板细胞爬片上（爬片事先放入6孔板或12
孔板中，用PBS浸润后吸弃PBS），将6孔板放入37℃恒温箱中20min，按照以下步骤进行：
（1）往6孔板中缓慢加入4%多聚甲醛，4℃固定30min。
（2）吸弃4%多聚甲醛，PBS洗细胞2次。
（3）加0.1%TritonX-100（去离子水配制）室温作用15min.
（4）吸弃0.1%TritonX-100，PBS洗2次。
（5）用含0.5%BSA的PBS（pH7.4）作为封闭液，室温封闭30min。
（6）吸弃封闭液，PBS洗2次。
（7）加Abcam公司的NF-κBp65一抗（用0.5%BSA的PBS作1:1000稀释），37℃作用60min。
（8）吸弃一抗，PBS洗2次，每次2min。
（9）加Thermo公司的FITC-羊抗兔IgG（用0.5%BSA的PBS作1:50稀释），37℃避光作
用60min。
（10）PBS洗3次，每次2min。
（11）加DAPI（Roche公司产品，使用终浓度500ng/mL，去离子水1:20000稀释），作用
2~5min（作用时间不宜过长）。
（12）去离子水洗2次，最后一次不吸弃去离子水。
（13）将1mL的注射器针头折成弯曲的，用针头将细胞爬片取出。将防荧光淬灭剂滴在载
玻片上，将有细胞的一面扣在载玻片上，用10uL枪头吸少部分透明指甲油滴在爬片边缘以
固定，待指甲油凝固。
（14）荧光显微镜下观察。