糖基转移酶酶活测定方法
转氨酶活力测定实验报告
一、实验目的1. 了解转氨酶在生物体内的作用及其在临床诊断中的重要性。
2. 学习并掌握转氨酶活力测定的原理和方法。
3. 通过实验操作，提高对实验仪器的操作技能。
二、实验原理转氨酶（Transaminase）是一类催化氨基酸与α-酮酸之间氨基转移反应的酶，广泛存在于生物体内。
在人体内，转氨酶主要存在于肝脏、心肌、骨骼肌等组织中，其中以谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）最为重要。
ALT和AST活性的测定在临床上具有重要的诊断价值，可作为肝功能异常、心肌梗死等疾病的辅助诊断指标。
本实验采用分光光度法测定ALT活力。
ALT催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸之间的转氨反应，生成L-谷氨酸和丙酮酸。
丙酮酸与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙（PNP）。
PNP在碱性条件下呈棕色，其最大吸收峰在520nm处，通过测定520nm处的吸光度，可以计算出ALT的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡肝- 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）- 0.1mol/L丙氨酸- 0.1mol/Lα-酮戊二酸- 2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）- 30%氢氧化钠溶液- 碘化钾溶液- 硫代硫酸钠溶液- 酶活力测定试剂盒2. 实验仪器：- 酶标仪- 电子天平- 移液器- 离心机- 恒温水浴箱- 试管四、实验步骤1. 样品制备：将鸡肝剪碎，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），匀浆，离心取上清液。
2. 标准曲线绘制：配制一系列不同浓度的丙酮酸标准溶液，加入2，4-DNPH和30%氢氧化钠溶液，在520nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
3. 样品测定：将样品溶液、底物溶液、2，4-DNPH和30%氢氧化钠溶液加入试管，混匀，在520nm处测定吸光度。
4. 数据处理：根据标准曲线，计算样品中ALT的活力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：在520nm处，吸光度与丙酮酸浓度呈线性关系。
【VIP专享】糖基转移酶和去糖基化酶
M
↓Gl cNAc T ransferase Ⅰ
M
M
M
M -N -N -A sn 杂合型( Hybrid t ype)
N -M
↓Mannosidase Ⅱ
M M -N -N -Asn
N -M ↓Gl cNAc T ransferase Ⅱ
↓Fuco syl T ransferase ↓Galact osy l T ransferase ↓Sialy l T ransf erase
蛋白质的糖基化修饰和天然糖蛋白的去糖 基化是研究糖蛋白糖链结构和功能的重要手段 之一。其中糖基转移酶和各种糖苷酶是该手段 中的有用工具。本文主要介绍蛋白质糖基化和 糖蛋白去糖基化过程中的主要酶性质的研究进 展。
1 蛋白质的糖基化修饰和糖基转移酶 根据蛋白质与糖链连接的方式不同将糖蛋
白分为 N -连接糖蛋白和 O -连接糖蛋白[ 4, 9] 。O 连接糖蛋白糖链的生物合成比较简单, 是将单 糖以核苷酸糖的形式逐渐加在多肽的丝氨酸或 苏氨酸上, 主要在高尔基体内进行[ 4] 。 1. 1 N-连接糖链生物合成及糖基转移酶
也于 1991 年实施 “糖工程前沿计划”, 同时成 立 “糖工程研究协议会”并出版 《糖锁工学》专 著和 创刊 专门 杂 志 “T rends in Glycoscience and Gly cot echnolog y”。自 1993 年首届 “国际糖 工程会议”在美国召开以来, 已有多次国际糖 生物学会议召开。可见, “生命化学中最后一个 ‘巨大 前 沿’: 糖 生 物 学 的 时 代 正 在 加 速 来 临! ”[ 1, 3] 并将成为二十一世纪的热点。
G-G-G-M -M -M
↓Gl ucosidaseⅠ
糖基转移酶组织定位
糖基转移酶组织定位介绍糖基转移酶是一类重要的酶，它在生物体内起着关键的催化作用。
糖基转移酶能够将糖基转移给底物分子，从而产生糖基化产物。
糖基化反应是生物体内糖代谢的重要过程之一，它参与了许多生物学过程，如细胞信号传导、细胞识别和免疫应答等。
了解糖基转移酶的组织定位对于深入理解其功能和生理作用具有重要意义。
组织定位研究方法研究糖基转移酶的组织定位通常采用多种方法，包括细胞免疫荧光染色、免疫组织化学、蛋白质印迹、基因表达分析等。
这些方法可以在细胞和组织水平上检测糖基转移酶的存在和定位，从而揭示其在不同组织和细胞类型中的表达模式和功能。
糖基转移酶的组织定位糖基转移酶在不同组织中的定位具有明显的差异。
下面将对几种常见的糖基转移酶进行讨论。
1. 糖基转移酶A糖基转移酶A（GTA）是一类重要的糖基转移酶，它参与了细胞膜糖脂的合成过程。
研究发现，GTA主要定位在高度分化的细胞中，如肝脏、肾脏和肺组织。
这些组织中GTA的表达水平较高，说明其在这些组织中具有重要的生理功能。
2. 糖基转移酶B糖基转移酶B（GTB）是一类参与糖蛋白合成的酶。
研究表明，GTB主要定位在内质网和高尔基体中。
内质网是细胞内蛋白质合成和修饰的重要位置，而高尔基体则参与了蛋白质的后翻译修饰和运输过程。
GTB在这些细胞器中的定位说明其在蛋白质糖基化过程中起着重要作用。
3. 糖基转移酶C糖基转移酶C（GTC）是一类参与细胞膜糖脂的合成的酶。
研究发现，GTC主要定位在细胞质中。
细胞质是细胞内许多生物学过程的重要场所，包括蛋白质合成、能量代谢和信号传导等。
GTC在细胞质中的定位暗示其在这些生物学过程中可能发挥重要的功能。
糖基转移酶组织定位的生理意义糖基转移酶的组织定位对于揭示其功能和生理意义具有重要意义。
不同组织中糖基转移酶的表达模式和定位差异可能与其在不同组织和细胞类型中的特定生理功能相关。
研究发现，糖基转移酶在细胞信号传导中起着重要作用。
细胞信号传导是细胞内外信息传递的关键过程，它参与了细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
重组变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区的活性研究
外葡聚糖的过程对变形链球菌在牙面形成菌斑及此 后 龋病 的发 生至关 重要 � G T F 包 含 催化 活性 区 i ng， G B 或 G LU) 两个功能区段，G T F 催化活性区
� � (C a a l i c， C AT )和葡聚 糖结合 区 (G l ca n bi nd 储冰峰 解放军总医院口腔医学中心 主任医师 教授
是它的重要功能区段 [4]，我们已将变形链球菌 G T F 的 C AT 区基因提取并克隆至大肠杆菌获得了可溶 性的重组 C AT ，本实验拟通过 研究重组 C AT 的 生物学活性对其在致龋过程中的作用进行 初步探 讨，为研究 G T F 的生物学功能做准备 � 1 . 材料与方法 1 . 1 材料 sA-C AT 大肠杆菌 B L2 1 的重组菌，由本实验组构建�
关键词：变形链球菌；葡糖基转移酶；蒽酮硫酸液 [中国图书分类号] R 7 8 0 .2 [文献标识码] A [文章编号] 1 0 0 9-37 61 (2 0 1 0 )0 2-0 0 65-0 3
� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ANG � � � � � L � ,C H U B� � � � , ANG � � C ,L I U H ,SH AO N , ANG G ,DO NG J ,L I U � � � � � � � � � � � � � . (S C PL A B 1 00 8 53 ,C ) � � � � � � � � � : T oa � ssa � h ea c ii ofre com bi na n e pre sse d h ecaa l i c re g i o no f gf C f ro m S.m a ns G S5. � � � : Ob � a i n hesol � � � bl ef � si � o � nproe � � i nb I P TG i nd ce heE . co l iB L21 , An hron e s l ph ri ca ci d e s hea c ii o f he � � � so � l bl ere co m bi � na � n proe � i n(rG T F). � : OD630 f i gsho he rea rea ppa re nl d i f f e re n cebe e e n herG TF gro p a nd � � � � � � � � � � hebl � � a nk g ro � � p (� < � 0 .0 5) � b� � h em ohod � o fa nh ro ne s l ph ri c a ci d. : T here s ls sh o e d h a hesol bl e rG T F co l d caa l eh es cro see f f e c ie l. � : de na lca ri e s;glcos lra nsf e ra se s;a nhron e s l ph ri ca ci d
酶活,糖,蛋白,叶绿素含量测定方法总结
生理实验方法总结酶提取液制备称取干净叶片0.5g于预冷研钵中，加2ml的提取介质﹙PH7.8的50 mmol·L-1磷酸缓冲液﹚，充分研磨后，加提取介质冲洗钵体，并使最终体积为5ml，6000rpm离心30min，上清液即为提取液。
供SOD、CAT、POD、MDA和蛋白质含量测定。
1、叶片相对含水量：先求叶片鲜重Wf，然后将叶片浸入蒸馏水中数小时（要48h左右叶片质量才不会增加），使叶片吸水成饱和状态。
取出用吸水纸吸取表面的水分，立即放入已知重量的称瓶中称重，再放入蒸馏水中一段时间后取出吸干外面水分，再称重，直至重量不再增加为止。
此时即为叶片吸水饱和时的重量Wt，再将样品烘干，求得组织干重Wd，即得相对含水量=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%注：Wf——叶片鲜重（g）；Wd——叶片干重（g）；Wt——叶片饱水重（g）。
2、比叶重：单位面积的叶片的干重，避开主脉。
3、相对电导率：取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性,少含茎节),用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分,将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉),快速称取鲜样3份,每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中,盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h.用电导仪测定浸提液电导(R1),然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2).相对电导率=R1/R2!100% 4、叶绿素含量：将采回的样叶快速洗净擦干，去中脉，称取0.1g，加10ml95%的乙醇，在黑暗中泡45h（直到叶片发白）。
于721分光光度计测定在波长D470nm、645nm 和663nm下的光密度（OD值），按照Arnon公式，计算出每克叶片的叶绿素a,b和叶绿素总的含量：叶绿素a(mg/g鲜重)=（12.7D663-2.69D645）*[V/（1000*W）]叶绿素b(mg/g鲜重)=（22.9D645-4.63D663）*[V/（1000*W）]叶绿素总含量(mg/g鲜重)=（20.2D645+8.2D663）*[V/（1000*W）]类胡萝卜素含量(mg/g鲜重)=(1000D470－2.05Ca－114.8Cb)/245式中：D---光密度读数V---叶绿素提取液总体积（10ml）W---所用叶片鲜重（g）5、MDA含量的测定：用硫代巴比妥酸法：取干净试管，加入酶提取液1mL，然后再加入3ml10%的TCA和1ml 0.6%的TBA，摇匀，混合液在95℃水浴中保温30min，迅速冷却后，4000rpm下离心10min，取上清液分别于600nm，532nm，450nm波长下测定吸光度值。
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Analysis of glk 12，15
葡萄糖通过葡萄糖激酶的ATP依赖的磷酸化是由通过根据弗兰克尔和Horecker 的使用过量的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶监测细胞提取物中NADPH的形成。
反应体系为 2 ml，50 mM Tris buffer pH7.65；10 mM MgCl2；50mM甘露糖；加入0.1mL酶。
在反应中，NADP+被还原生成NADPH，其产量与样品GLK活性呈正相关，NADPH在340nm处有一吸收峰，因此测吸光度，每分钟记录一次直至吸光度不再变化，测出每分钟光密度的增加值。
根据以下公式计算：酶活性=吸光度变化（min）/6.22（NADPH吸光系数）
Analysis of manB 中文
酶的测定原理是根D-甘露糖-l-磷酸作底物,反应后经酸水解无机磷的减少而测定。
标准的反应溶液中,含有D-甘露糖-1-磷酸(0.5m mol/l) 、D-葡萄糖-2,6-二磷酸 ( 0.0 1mmo l/L),醋酸镁 (2.5m mol /L),组氨酸(5m mol /L),Tris -Hcl(10 mmol/ l,pH8.0 )的缓冲液和微克量的酶液。
反应总体积为 50μL,在30 ℃下反应10分钟,然后加4.25 mL 0.74 mol /L H2SO4 .消化20 分钟,再加125 m1 钼酸铵和25 μL F -S试剂 ,在100℃水浴下煮沸7 -10分钟,冷却,在670 nm波长下测光密度。
以酶液先消化后加底物经同样处理的样品作对照测光密度。
以两者的光密度正差显示酶活性。
Analysis of gmd and wcaG 17
利用分光和色谱测定试验系统进行测量GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶-4-还原酶的活性。
GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶标准测定体系含有50mM的Tris/盐酸缓冲液pH7.5，10mM的氯化镁，4mM的GDP-D-甘露糖，50μMNADPH+和GMD含粗提物终体积为100μL。
该反应在37℃进行60分钟，每隔一段时间测量一次。
最后加入1900μL 100mM NaOH终止反应并在37℃下孵育20min，然后在320nm下测吸光度。
GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶-4-还原酶活性测量依靠加入在第一步骤中的反应，然后通过在340 nm和37℃下测量NADPH的消耗量测定。
Analysis of fuct 1-。
标准测定混合物含有38nM寡糖受体，20mM的MnCl2，1％的Triton X-100，50mM的二甲胂-HCl缓冲液（pH值 5.8），0.37 μM GDP-岩藻糖（270.0 mCi/mmol），和酶（0.4 mg protein），100μL的终体积。
温育在37℃，1h。
终止反应用300μL氯仿/甲醇（2/1，v/v），然后将产物通过TLC，乙醇/吡啶/ 1-丁醇/水/乙酸(100/10/10/30/3, by vol)在下层相分离。
掺入糖脂的放射性活度是用图像分析仪和并用液体闪烁计数器测定。