实验11 氨基酸的薄层层析分离和鉴定
实验11 氨基酸的薄层层析分离和鉴定
一实验目的
1．理解薄层层析原理，
2．掌握薄层层析技术，
3．学会氨基酸的较为精确的定性。
二实验原理
1 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别(如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性)，使各组分在两个相中的分布不同，其中一个相是固定不动的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
2 固定相：可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）
3 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
4 层析技术利用
分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移
值），
动距离，称比移值（ R
f
所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
薄板层析:通常将吸附剂（载体）铺在光洁的表面上（如玻璃板、金属或塑料等），形成均匀的薄层。然后以流动相展开，样品中的组分不断地被吸附剂（固定相）吸附，又被流动相溶解（解吸）而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相有不同的解吸能力，因此，在流动相向前流动的过程中，不同组分移动的距离不同，因而得到分离。
5 薄层层析特点
装置简单，操作简便。展开耗时短，一般20－30min即可上行十几厘米。斑点扩散少，检出灵敏度高。（0.01ug）同一薄层析可用多种试剂显斑。加厚薄层后可用于制备。（50mg）
三实验器材
1 材料
(1) 玻板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。
(2)固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF<[254]> 、硅胶H、硅胶HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F<[254]>等。
其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘
合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上, 后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7％)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓
冲液的薄层。
(3) 点样器同纸色谱法项下。
(4) 展开室应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。
2主要仪器
带密封盖的层析缸、毛细管(0.5mm)、100℃的烘箱、电吹风机、载玻片（75mm*25mm）、玻璃棒、药勺、烧杯（100ml）、量筒（10ml）、滤纸、喷雾器、直尺、铅笔。
3．试剂
（1）氨基酸标准溶液：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸10mg／m1水溶液。各25ml
（2）样品液：混合氨基酸的水溶液。25ml
（3）展开剂：水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5 500ml
（4）显色剂：0.5%茚三酮溶液（茚三酮O.5g溶于乙醇l00ml中。）
四、操作方法
1．硅胶G薄层板的制备
(1)清洗玻璃板：先用洗衣粉和水清洗干净，再经自来水淋洗，经酒精冲洗后放入烘箱烘干，取用时只能手指接触板的边缘。
(2)制备浆液：称取3g硅胶G于烧杯中，缓慢地加入9ml0.5%羧甲基纤维素钠溶液，边加边搅拌，加料完毕用玻璃棒剧烈搅拌调成均匀浆液。
(3)涂片：将调好的浆液倒在玻璃板上，将板倾斜使浆液铺开，再将板拿起用手左右摇晃，使浆液均匀附在玻璃板上，其厚度为0.25—1mm，然后用纸轻轻擦去薄板四周多余浆液（取拿板时只能触及板的顶部及两侧），把薄板放桌面上晾干。
(4)活化：将硅胶板于105~110℃烘箱内烘30min，取出冷却放在干燥器内保存备用（薄层活化温度一般不超过128℃，以免引起石膏脱水失去固着能力）。
2、点样
（1）在距离薄板一端约1-1.5cm处用细线向下压硅胶(用铅笔划一线)，压成一条点样线。（2）用直径约1mm或0.55mm的玻璃毛细管分别吸取甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸及混合氨基酸溶液，在点样线上点样，每隔0.8cm处点一种样品（约5ul），与薄板垂直方向轻轻碰点样处点样，直径约2~3mm。待点样处干后（可用吹风机吹干），再将样品在原点样处重复点一次。
（3）氨基酸的点样量以5ul为宜，含氨基酸0.5-2ug。
3、展开
（1）硅胶板的点样端向下，倾斜地放入层析缸内，使其与缸底平面呈约15-30度角。
（2）用长颈漏斗加入展开剂使展开剂离点样处1cm处为止。即点样端浸入展开剂深度约0.3cm －0.5为宜
（3）盖上层析缸盖进行层析。
（4）当溶剂前沿距上边缘１厘米处时，取出薄层板，立即用笔标出溶剂前沿的位置，将硅胶板置干燥箱烘干。
4、显色
（1）用喷雾器均匀地喷上茚三酮显色剂
（2）将玻板置105℃干燥箱内烘干，约10分钟左右即可显出粉红色斑点（脯氨酸为黄色）。
五、结果与计算
用大头针轻轻划出所有斑点的轮廓，再用尺量出每个斑点从原点至斑点中心的距离及原点至展开剂前沿距离，计算出Rf值。
氨基酸移动的距离（cm）
值＝
R
f
溶剂移动的距离（cm）
样品至色斑中心的距离（cm）
＝
样品至溶剂前沿的距离（cm）
六、注意事项
1. 为了防止薄层被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套。
2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干薄层。
如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法
如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法 谢沐风 (上海市药品检验所上海200233) 摘要本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。 关键词薄层色谱法（TLC法）有关物质方法建立 有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。 TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。 1．测定方法类型 常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。 2．展开剂的确定（即专属性试验） 专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来
氨基酸的薄层层析
实验4 氨基酸的薄层层析 一、实验原理 薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。 薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的R f值（R f值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。 氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。 二、实验材料 （一）样品 1．氨基酸标准溶液： （1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 （2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 （3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 2．混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。 （二）试剂
1．硅胶G(C.P.) 2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。 3．展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。 4．0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。 5．展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。 （三）仪器及器材 1．层析板（6×15cm）； 2．小烧杯； 3．量筒（10mL）； 4．小尺子； 5．吹风机； 6．毛细玻璃管； 7．层析缸； 8．烘箱。 三、实验步骤 （一）实验流程 （二）操作步骤 1．制板 ↓（1）调浆：称取硅胶3g，加0.5%的羧甲 基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。 （2）涂布：取洁净的干燥玻璃板a均匀涂 a. 玻璃板要清洁平整，无油污。 b. 粘在玻璃板侧面边上的硅胶 粉应去掉，否则在层析时会有较
薄层色谱 的详细步骤
. 薄层色谱分析步骤详解 薄层色谱法(thin layer chromatography简写TLC)是一种物理化学的分离技术，常用于药物的分离与分析。现对此方法的分析步骤及留意事项提点建议。 完成TLC分析通常需经制板、点样、展开、检出4步操纵。 ⑴制板 在一平面支持物(通常为玻璃)上，均匀地涂制硅胶、氧化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有：10cm×20cm、5cm×20cm、20cm×20cm等。称取适量硅胶，加进0.2％～0.5%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na），充分搅拌均匀，进行制板。一般来说10cm×20cm的玻璃板，3～5g硅胶/块；硅胶与羧甲基纤维素钠的比例一般为1：2～1：4。制好的玻璃板放于水平台上，留意防尘。在空气中自然干燥后，置1l0℃烘箱中烘0.5～lh，取出，放凉，并将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。 ⑵点样 用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，假如要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm.底线距基线1～2．5cm，点间间隔为lcm左右，样点与玻璃边沿间隔至少lcm，为防止边沿效应，可将薄层板两边刮往1～2cm，再进行点样。 ⑶展开 将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定间隔后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。 ①展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加进足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高、 宽的滤纸条，一端浸进展开剂中，密封室顶的盖。 ②展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。 ③薄层板点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。 ④展开应密闭，展距一般为8～15cm。薄层板放进展开室时，展开剂不能没过样点。一般情况下，展开剂浸进薄层下真个高度不宜超过0.5cm。 ⑤展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。 ⑥展开后的薄层板用适当的方法，使溶剂挥发完全，然后进行检视。 ⑦Rf值一般控制在0.3～0.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变活动相的比例。 ⑷斑点的检出 展开后的薄层板经过干燥后，常用紫外光灯照射或用显色剂显色检出斑点。对于无色组分，在用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。 展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值(Rf值)来表示。化合物斑点中心至原点的间隔与溶剂前沿至原点的间隔的比值就是该化合物的Rf值。 ;.
纸层析法分离氨基酸实验报告材料
纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有
机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用
DNS-氨基酸的制备和鉴定-
DNS-氨基酸的制备和鉴定 实验目的 1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理 2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 实验原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下： 图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即： 图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH 2 ，即： 图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH 2 DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH 2 产生蓝色荧光，可彼此区分开。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 实验器材 1.聚酰胺薄膜（7×7cm） 2.电吹风一个 3.紫外灯一台 4.点样管（4支） 5.吸管 6.量筒
氨基酸薄层层析 实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称氨基酸的薄层层析 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握薄层层析法的一般原理。 1.2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 1.3.掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。 二、实验原理 2.1.薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）。 2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 2.3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。（Rf=斑点至原点距离/溶剂前缘至原点距离） 三、材料与方法：
3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①分析样品：氨基酸混合液；②吸附剂：硅胶；③粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠；④氨基酸的异丙醇溶液；⑤丙氨酸、精氨酸、甘氨酸；⑥展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液） 3.1.2.实验器材：①层析板、尺子、铅笔；②烧杯、玻棒、量筒；③吹风机；④毛细管、层析缸；⑤药匙；⑥烘箱 3.2.实验步骤： 3.2.1.制板：①调浆： 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠 8毫升，调成均匀的糊状；②涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层；③干燥：将玻璃板水平放置，室温下自然凉干；④活化：70 ℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。 3.2.2.点样：①位置：用铅笔距底边2cm 水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm ；②取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm ；③点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm 。 3.2.3.层析和显色：将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm 时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。 3.2. 4.处理和结果分析：小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的Rf 值。根据Rf 值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。 3.3.注意事项：①切勿用手直接接触薄层板面；②点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴；③样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成 斑点过大，
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成 ●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值） 来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因
素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5．显色用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6．计算各种氨基酸的Rf值。 四、结果与分析
薄层层析的原理与操作
薄层层析的原理与操作 薄层色谱，或称薄层层析(thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。 一、基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。 物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。 薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟;混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。 二、固定相支持剂的选择和处理 在薄层层析时，对支持剂的选择主要考虑两方面：一是支持剂的性质与适用范围;二是支持剂的颗粒大小。一般来说，所选吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力;所选吸附剂与溶剂及样品组分不会发生化学反应。吸附力的强弱规律可概括如下：吸附力与两相间界面张力的降低成正比，某物质溶液中被吸附的程度与其在溶剂中的溶解度成反比。极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。同族化合物的吸附程度有一定的变化方向，例如，同系物极性递减，而被非极性表面吸附的能力将递增。
氨基酸薄层层析实验报告doc
氨基酸薄层层析实验报告 篇一：生物化学实验-氨基酸分析实验报告 【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、 ②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、 ③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）： XX 】 一、预习报告 ? 实验原理： 根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。薄层层析是在玻 璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。 薄层层析（thin layer chromatography，TLC）：是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。 本次实验： ? 具体原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不 一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在
薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。 ? 吸附剂（固定相）：硅胶（C.P.）。为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基 纤维素钠（CMCNa）作黏合剂。 ? 展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:10:10,V/V/V）。 ? 展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。 ? 活化（activation）：在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。可使硅胶的活性提高，吸附能力加强。 ? 氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原， 此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。 ? Rf值： Rf? 斑点中心到样品原点的距离 对应溶剂前沿到样品原点的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的， 因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 ? 实验材料：
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示： 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定 性依据。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色
氨基酸的分离与鉴定
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法 目的要求 （1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。 （2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。 原理 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示： 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。 本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。 试剂和器材 一、试剂 （1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。 （2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。 （3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。 （4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38 硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。 正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易挥发，稀释前需测出毕重）。 0.5%茚三酮丙酮溶液。 二、器材 新华中速薄层析滤纸，层析缸（高约430mm，直径约290mm，具有磨口盖子），鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样架，点样管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮（或线）手套，结晶皿。
薄层层析方法与注意问题
薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析。 薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需15-30min，分辨力比纸层析高10-100倍，它既能分离0.01μg的微量样品，又能分离500mg 基至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。 一、支持剂的选择与处理 薄层层析的支持剂种类很多。使用时应根据欲分离物质的种类进行选择。 支持剂颗粒大小要适当。颗粒大，展开速度快。但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象。一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm)，薄层厚度为1-2mm；无机类支持剂如氧化铝、硅胶等的颗粒一般为150-300目，薄层厚度为0.25-1mm。 在薄层层析中，使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析。同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理。 二、薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可以直立展开，而软板只能接近水平展开。
实验七-氨基酸的分离鉴定
实验七-氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
●层析溶剂由有机溶剂和水组成 ●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值） 来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析 一、实验目的 1．掌握薄层层析法的一般原理。 2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 3．掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。 二、实验原理 1．薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 硅胶吸附薄层层析的特点： ①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。 ②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。 ③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。但是实际操作时为70℃，活化1h 2．氨基酸与茚三酮的显色反应
茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。3．记录结果，计算Rf值 混合氨基酸被分离后，在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法： 材料： （一）分析样品：氨基酸混合液 （二）试剂： 吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠、氨基酸的异丙醇溶液、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。展开-显色剂：正丁醇、乙酸、茚三酮溶液 （三）器材：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻棒、量筒、吹风机、毛细管、层析缸、药匙、烘箱 方法： （一）薄层板的制备 1．调浆称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2．涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3．干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4．活化70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。
薄层色谱中展开剂的选择分解
薄层色谱中展开剂的选择 2007-04-05 02:03 （一）有机合成中展开剂的选择 做有机合成时走板子是常有的事，展开剂的选择就至关重要了。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚 实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R f值，借此可以达到定性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、时间等都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅 （3）安培瓶 （4）层析缸 （5）吹风机 （6）喷雾器 2．试剂 糖类的提取分离与薄层层析分析 实验简介：薄层层析(thin layer chromatography,TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。 一、实验目的 1、了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。 2、学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。 二、实验原理 1、单糖及多糖的提取 凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。 多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。 2、薄层层析 薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。 糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。若采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高糖的分离效果。 薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。一般常采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行，将适量的展层溶剂倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可(如图1所示)。保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸汽是实验成功的关键。 氨基酸的鉴定——纸层析法 171850044钱诗晨 一、实验目的 掌握纸层析法的基本原理。 通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并不学会分析未知样品中的氨基酸组分 二、实验原理 1、层析法又称色谱法（Chromatography），是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。 分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示： 在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。 三、实验试剂 1.酸性展层剂——正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
糖类的提取分离与薄层层析分析
氨基酸的鉴定