植物凝集素的研究进展1
细胞凝集反应实验报告 山东大学
科目细胞生物学实验题目细胞凝集反应细胞凝集反应【实验目的】1.了解细胞膜的表面结构；2.掌握凝集素促使细胞凝集的原理；3.学习研究细胞凝集反应的方法。
【实验原理】1.凝集素凝集素是一类含糖（少数例外）并能与糖转移结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。
常用的为植物凝集素，通常一起被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他们的总称。
在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（又称为糖萼）。
凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。
凝集素引起的血细胞凝集，其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生物化学过程完全不同；另外，凝集素能与不同的糖蛋白特异结合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，因此，Ponder提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。
人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。
ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体；不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。
另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。
如：植物凝集素可抑制受精；芸豆凝集素可直接抑制HIV-1反转录酶的活性，减少HIV感染者的病毒载量；细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。
2.细胞凝集细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。
C型凝集素受体在肿瘤免疫作用中的研究进展
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2019.09.023C 型凝集素受体在肿瘤免疫作用中的研究进展①杨芸宁 徐媛媛 龙 珊 李晓松② (中国人民解放军总医院第四医学中心,北京100048) 中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2019)09⁃1139⁃04①本文受国家自然科学基金(81572953)资助㊂②中国人民解放军总医院第四医学中心,北京100048㊂作者简介:杨芸宁,女,在读硕士,主要从事肿瘤免疫治疗方面的研究,E⁃mail:abyssnamechanging@㊂通讯作者及指导教师:李晓松,男,博士,副主任,硕士生导师,主要从事肿瘤激光治疗㊁肿瘤免疫方面的研究,E⁃mail:doctor301@㊂[摘 要] C 型凝集素受体(CLRs)是一种高表达于树突状细胞(DCs)的模式识别受体(PRRs),它参与了由DCs 介导的针对肿瘤的非特异性免疫和特异性免疫㊂激活表达于DCs 上的CLRs 可显著提升机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用㊂本文将以CLRs 中的Dectin⁃1和Dectin⁃2受体为例,对其在肿瘤免疫中发挥的作用及参与此过程的相关信号通路进行综述,并据此初步探讨CLRs 未来在肿瘤免疫治疗中可能的应用㊂[关键词] C 型凝集素受体;癌症;肿瘤转移;Dectin⁃1;Dectin⁃2;肿瘤免疫Research progress on role of C⁃type lectin receptors in tumor immunotherapyYANG Yun⁃Ning ,XU Yuan⁃Yuan ,LONG Shan ,LI Xiao⁃Song .The Fourth Medical Center of PLA General Hospital ,Beijing 100048,China[Abstract ] As one of pattern recognition receptors,C⁃type lectin receptors (CLTs)were found to be highly expressed bydendritic cells(DCs)and play an important role in the non⁃specific immunity and specific immunity mediated by DCs towards canc⁃er.Stimulating CLTs expressed on DCs will significantly improve the immunity toward tumor cells.In this review we discuss the roleCLTs playing in immunotherapy for tumors and relative signaling pathways,then describe how CLTs can be used in future immunothera⁃py.[Key words ] C⁃type lectin receptors;Cancer;Tumor metastasis;Dectin⁃1;Dectin⁃2;Tumor immunotherapy C 型凝集素受体(C⁃type lectin receptors,CLRs)主要在髓样细胞上表达,为一类内含至少一个C 型凝集素样结构域(C⁃type lectin like domain,CTLD)的蛋白超家族㊂其最主要的功能是作为模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)通过识别来自于病原相关分子模式(Pathogen⁃associated molecular patterns,PAMPs )㊁损坏相关分子模式(Damage⁃associated molecular patterns,DAMPs)㊁肿瘤相关分子模式(Tumor⁃associated molecular patterns,TAMPs)上的配体激活并调节宿主体内的免疫功能㊂根据蛋白在细胞膜上的定位,CLRs 被分为跨膜型受体和游离型受体,这两种受体都具有一个或多个碳水化合物识别中心,并依赖此中心识别病原体或自身蛋白上的葡聚糖㊁甘露糖等多种配体㊂经典CLRs 的特征是依赖协同Ca +识别配体,然而,也有很多CLRs 在缺乏协同Ca +的情况下依然可辨认出多种配体,这种CLRs 又被称为类C 型凝集素样受体[1]㊂树突状细胞(Dendritic cell,DCs)作为目前所知功能最强的抗原呈递细胞(Antigen⁃presenting cell,APC),同肿瘤的发生㊁发展及在此过程中涉及的相关免疫反应有着密切联系,其上的PRRs 包含了CLRs [2]㊂针对于CLRs 在肿瘤免疫过程中所起到的作用,目前相关研究主要集中在树突状细胞相关的C 型凝集素⁃1(DC⁃associated C⁃type lectin⁃1,Dectin⁃1)受体㊁Dectin⁃2受体之上,而对其他的受体研究较少,所以本文选取以上两种受体为典型对CLRs 进行探讨㊂1 Dectin⁃1受体的基本结构及其在肿瘤免疫中的作用机制1.1 Dectin⁃1受体的结构及其分布 Dectin⁃1受体作为CLRs 超家族中的一员,具有Ⅱ型跨膜结构[3]㊂由于其最早在DCs 中被发现,故被命名为DC 相关的C 型凝聚素⁃1㊂曾有报道认为人类Dectin⁃1受体仅在髓样细胞上表达[4],后来随着研究的逐步深入,研究人员发现Dectin⁃1受体同样也在单核细胞㊁巨噬细胞㊁B细胞㊁嗜中性粒细胞㊁嗜酸性粒细胞上表达㊂近期,又有研究证明健康人体血液中的浆系DCs亚群也同样存在Dectin⁃1受体[5]㊂1.2 Dectin⁃1受体通过非特异性免疫发挥肿瘤免疫作用 CLRs作为一种PRRs,其中Dectin⁃1受体高表达于DCs和巨噬细胞等APC上[6]㊂其中,DCs 可通过细胞⁃细胞接触上调NK细胞分泌的细胞因子发挥抗癌作用,并通过细胞毒性作用阻止肿瘤生长[7,8]㊂此作用对于针对癌症的非特异性免疫意义重大,因而在此过程中涉及的Dectin⁃1受体也备受关注㊂APC在利用PRRs识别肿瘤相关抗原的过程中需要干扰素调节因子(Interferon regulatory factors, IRFs)参与相关信号通路并对肿瘤免疫进行调节㊂已有研究证明在先天缺乏IRF5的小鼠体内,黑色素瘤(B16F1)的肺转移非常明显㊂而Dectin⁃1受体在抗真菌的非特异性免疫过程中,其信号通路也涉及到IRF5[9]㊂因此,人们推测Dectin⁃1受体极有可能参与肿瘤免疫的非特异性免疫过程㊂在肿瘤免疫过程中,激活IRF5即可引起相对应的核内易位㊂Chiba等[10]经研究发现相对于野生型小鼠,在缺乏能编码Dectin⁃1受体的Clec7a基因小鼠体内,黑色素瘤细胞无法引起能代表IRF5活性的核内易位,这说明Dectin⁃1受体在IRF5的激活中起到了不可或缺的作用,同时相对于野生型小鼠,先天缺乏Dectin⁃1受体的小鼠黑色素瘤肺转移数量更多㊁程度也更严重㊂此后,研究人员又对比观察了野生型和Dectin⁃1受体缺陷型DCs暴露在黑色素瘤细胞中时的基因表达特性,发现其中干扰素调节因子3依赖性NK细胞激活分子(IFN regulatory factor3⁃dependent NK⁃activating molecular,INAM)基因的表达存在差异㊂已知INAM可通过它的嗜同种受体反应激活NK细胞[11],因此Dectin⁃1⁃IRF5⁃INAM信号通路至少部分参与了DCs激活NK细胞的过程㊂1.3 Dectin⁃1受体通过特异性免疫发挥肿瘤免疫作用 部分Th细胞可发挥针对肿瘤的特异性免疫,而DCs在这类Th细胞的生成过程中不可或缺[12]㊂有研究证明表达于DCs上的Dectin⁃1受体在抗真菌免疫过程中参与诱导幼稚CD4+T细胞分化为Th17和Th1的过程[13],而这两种Th细胞也同样在抗癌过程中发挥其独特作用[14,15]㊂同时,近年来不断有报道证明在使用过继转移方法治疗黑色素瘤的过程中,Th9细胞所发挥的免疫治疗功能要优于其他Th 细胞[16,17]㊂因此人们推测该受体可能同样参与诱导幼稚CD4+T细胞分化为Th9的过程,并与肿瘤免疫密切相关㊂针对以上推测,Zhao等[18]使用Dectin⁃1受体的兴奋剂凝胶多糖对小鼠骨髓来源的DCs进行处理,随后将其与幼稚CD4+T细胞共培养㊂结果显示, Dectin⁃1受体升高后的DCs相对于未经处理的DCs 能够显著提高幼稚CD4+T细胞分化为Th9的数量㊂进一步研究发现,在此过程中,Dectin⁃1受体通过脾酪氨酸激酶和Raf1下游信号分子通路激活经典和非经典NF⁃κB信号通路掌控Th细胞的分化[19],除了参与相应的信号通路,研究表明Dectin⁃1受体在接受凝胶多糖刺激后可促使DCs过表达Th细胞分化所需的肿瘤坏死因子超家族成员15和OX40L分子,并由此促进CD4+T细胞分化为Th9细胞,其后Th9细胞分泌的IL⁃9可促使CD8+细胞毒性T细胞发挥肿瘤免疫功能[20]㊂然而,在最近的一项报道中,Daley等[21]发现表达于不同细胞上的Dectin⁃1受体功能存在差异㊂首先,研究人员通过Western blot检测了胰腺导管腺癌小鼠和野生型小鼠中Dectin⁃1配体的含量,结果显示Dectin⁃1配体在前者中的表达要显著高于后者,同时接受了Dectin⁃1激动剂处理的小鼠胰腺导管腺癌的恶化程度要比未经处理的小鼠更加显著,以上结果似乎说明Dectin⁃1受体能够促进肿瘤的生长,这显然同之前的研究结果互相矛盾,然而,胰腺导管腺癌在被敲除Dectin⁃1受体基因的小鼠体内生长情况与野生型小鼠相比并未产生任何显著改变㊂进一步研究发现,Dectin⁃1受体主要在肿瘤细胞的上皮外间质中发挥促进肿瘤生长的作用㊂与野生型小鼠不同,缺乏Dectin⁃1受体的小鼠仅能诱导CD4+T淋巴细胞产生少量的IL⁃10,并不能减弱CD8+T淋巴细胞的细胞毒性作用㊂2 Dectin⁃2受体的基本结构及其在肿瘤免疫中的作用机制2.1 Dectin⁃2受体的结构及分布 Dectin⁃2的结构同Dectin⁃1相似,都为Ⅱ型跨膜受体并具有一个保守糖类识别中心(Conserved carbohydrate⁃recognition domain,CRD)[22]㊂CRD位于Dectin⁃2受体的碳末端,同时它还拥有一个短小的氮末端细胞质中心㊂Dectin⁃2受体最初在单核细胞和巨噬细胞上被发现,此后又不断有报道表明在Kupffer细胞㊁Langerhans细胞和一些DCs上也发现了它的存在[23]㊂2.2 Dectin⁃2受体通过Kupffer细胞发挥吞噬和清除肿瘤细胞的功能 通过上文我们已经了解Dectin⁃1受体作为一种CLRs可通过激活NK细胞发挥抑制肿瘤生长和转移的重要作用[10],因此同为CLRs㊁与Dectin⁃1的序列同源性较高并同样接受FcRγ调节的Dectin⁃2受体也开始备受关注[22,24]㊂为验证Dectin⁃2受体是否也具有肿瘤免疫功能, Kimura等[25]将结肠癌细胞株(SL4)㊁肺癌细胞株(3LL)㊁黑色素瘤细胞(B16F1㊁B16F10)分别注入野生型小鼠和Dectin⁃2缺陷型小鼠,结果显示注入SL4㊁B16F1㊁B16F10的Dectin⁃2缺陷型小鼠肿瘤肝转移的机率都高于同样注入这些细胞的野生型小鼠,然而,注入3LL的Dectin⁃2缺陷型小鼠却没有发生这种现象㊂与Dectin⁃1受体不同的是,Dectin⁃2受体并非高表达于DCs,而于CD11b+F4/80+Kupffer细胞上㊂此后,经细胞流式仪测定,NK细胞㊁CD4+T细胞㊁CD8+T 细胞和CD45-T细胞同样不表达该受体㊂Dectin⁃2通过Kupffer细胞发挥吞噬和清除肿瘤细胞的功能,但此功能并不适用于全部的肿瘤细胞,例如它就不适用于3LL,而与此相反,Dectin⁃1却可通过激活NK细胞抑制3LL转移[10]㊂此外,有研究表明依赖Dectin⁃2受体激活的Nlrp3炎症小体可通过增强NK细胞功能抑制肿瘤肝转移[26]㊂这些都说明尽管Dectin⁃2受体和Dectin⁃1受体在基本结构和信号通路上有部分相似之处,但是其功能作用却不尽相同㊂随后为了探索Dectin⁃2抑制的肿瘤转移阶段,研究人员又将表达绿色荧光蛋白的SL4细胞注入小鼠体内,并通过检测不同时间段人GDNF家族受体mRNA的表达证明Dectin⁃2受体在肿瘤肝转移早期发挥作用㊂综上,高表达于Kupffer细胞的Dectin⁃2受体可在早期抑制部分肿瘤细胞的肝转移㊂但是Dectin⁃2在肿瘤免疫过程中涉及到的信号通路依然尚未明确㊂除了备受关注的Dectin⁃1和Dectin⁃2受体,人们也对其他CLRs在肿瘤免疫方面产生的作用做了初步研究[27],例如骨髓抑制性C型凝集素样受体和树突状细胞NK凝集素受体⁃1等㊂其中,MICL也被称为CLEC12A,在人体所有的DCs亚群中都广泛表达[28]㊂此前已有研究证明在小鼠模型中同鸡卵白蛋白结合的αCLEC12A抗体可诱导鸡卵白蛋白特异性的CD4+和CD8+T细胞反应[29],同时,近几年又发现CLEC12A可通过NDCA⁃1+mDCs和pDCs高效介导组织相容性抗原⁃1长肽的提呈以及交叉呈递,继而引发接受造血干细胞移植后的患者体内大量CD8+T细胞被激活[30],这些都侧面验证了CLEC12A能在肿瘤免疫过程中发挥一定作用㊂人类DNGR⁃1是一种仅在血液DCs亚群中表达的CLRs,同时它还具有胞吞作用,这都说明它可能具有帮助DCs递呈抗原的能力㊂在体外,DNGR⁃1的特异性抗体可同抗原决定簇共价结合,最终被CD8α+DCs交叉递呈,在此过程中若给予相应佐剂,可诱发大量的细胞毒性反应㊂同时也有研究证明在体内使用DNGR⁃1相关抗体和相应佐剂可抑制黑色素瘤的肺转移[31]㊂3 总结与展望CLRs的抗原提呈和免疫自稳功能使其在肿瘤免疫方面拥有巨大潜力[32]㊂根据文献报道,Dectin⁃1受体激动剂β⁃葡聚糖可以激发强烈的肿瘤免疫反应,应用于多种癌症的治疗[33]㊂同时,应用DNGR⁃1特异性抗体和佐剂结合则可抑制黑色素瘤肺转移[31]㊂但是通过整理近几年的文献我们发现,针对CLRs的研究主要集中在Dectin⁃1受体之上,而对其他受体缺乏更加深入的研究,且关于CLRs在肿瘤免疫过程中涉及到的信号通路的研究也缺乏整体性和系统性㊂需要引起注意的是,不同细胞上表达的CLRs 在免疫功能中的作用可能并不统一,甚至是互相矛盾的[34]㊂因此若想利用CLRs的肿瘤抗原递呈功能增强人体的肿瘤免疫能力,不能单纯地通过注射佐剂激发宿主体内所有CLRs活性,而需精确至不同类型的细胞㊂例如,我们可使用激动剂在体外处理DCs疫苗,增强其对于肿瘤抗原的递呈能力㊂综上,CLRs在肿瘤抗原递呈方面的巨大潜力给肿瘤免疫治疗提供了新思路,但是其具体作用原理及作用过程中所涉及到的相关信号通路仍需我们进一步探索㊂参考文献:[1] Dambuza IM,Brown GD.C⁃type lectins in immunity:recentdevelopments[J].Curr Opin Immunol,2015,32(32):21⁃27.[2] Akira S,Uematsu S,Takeuchi O.Pathogen recognition and innateimmunity[J].Cell,2006,124(4):783⁃801.[3] Ariizumi K,Shen GL,Shikano S,et al.Identification of a novel,dendritic cell⁃associated molecule,dectin⁃1,by subtractive CDNA cloning[J].J Biol Chem,2000,275(26):20157⁃20167. [4] Meyer⁃Wentrup F,Benitez⁃Ribas D,Tacken PJ,et al.TargetingDCIR on human plasmacytoid dendritic cells results in antigen presentation and inhibits IFN⁃alpha production[J].Blood,2008, 111(8):4245⁃4253.[5] Joo H,Upchurch K,Zhang W,et al.Opposing roles of dectin⁃1expressed on human plasmacytoid dendritic cells and myeloid dendritic cells in Th2polarization[J].J Immunol,2015,195(4): 1723⁃1731.[6] Herre J,Gordon S,Brown GD.Dectin⁃1and its role in therecognition ofβ⁃glucans by macrophages[J].Mol Immunol,2004, 40(12):869⁃876.[7] Yokoyama WM,Plougastel BFM.Immune functions encoded by thenatural killer gene complex[J].Nat Rev Immunol,2003,3(4): 304⁃316.[8] Fernandez NC,Lozier A,Flament C,et al.Dendritic cells directlytrigger NK cell functions:cross⁃talk relevant in innate anti⁃tumor immune responses in vivo[J].Nat Med,1999,5(4):405. [9] delFresno C,Soulat D,Roth S,et al.Interferon⁃βproduction viadectin⁃1⁃syk⁃IRF5signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C.albicans[J].Immunity,2013,38(6):1176⁃1186.[10] Chiba S,Ikushima H,Ueki H,et al.Recognition of tumor cells bydectin⁃1orchestrates innate immune cells for anti⁃tumor responses[J].Elife,2014,3(2):e04177.[11] Ebihara T,Azuma M,Oshiumi H,et al.Identification of a PolyI:C⁃inducible membrane protein that participates in dendritic cell⁃mediated natural killer cell activation[J].J Exp Med,2010,207(12):2675⁃2687.[12] Timmerman JM,Levy R.Dendritic cell vaccines for cancer immu⁃notherapy[J].Annu Rev Med,1999,50(50):507⁃529. [13] LeibundGut⁃Landmann S,Gross O,Robinson MJ,et al.Syk⁃andCARD9⁃dependent coupling of innate immunity to the inductionof T helper cells that produce interleukin17[J].Nat Immunol,2007,8(6):630⁃638.[14] Nishimura T,Nakui M,Sato M,et al.The critical role of Th1⁃dominant immunity in tumor immunology[J].Cancer ChemotherPharmacol,2000,46(1):S52⁃S61.[15] Ji Y,Zhang W.Th17cells:positive or negative role in tumor?[J].Immunol Immunother,2010,59:979⁃987. [16] Purwar R,Schlapbach C,Xiao S,et al.Robust tumor immunity tomelanoma mediated by interleukin⁃9⁃producing T cells[J].NatMed,2012,18(8):1248⁃1253.[17] Lu Y,Hong S,Li H,et al.Th9cells promote antitumor immuneresponses in vivo[J].J Clin Invest,2012,122(11):4160⁃4171.[18] Zhao Y,Chu X,Chen J,et al.Dectin⁃1⁃activated dendritic cellstrigger potent antitumour immunity through the induction of Th9cells[J].Nat Commun,2016,7:12368.[19] Gringhuis SI,den Dunnen J,Litjens M,et al.Dectin⁃1directs Thelper cell differentiation by controlling noncanonical NF⁃κBactivation through Raf⁃1and Syk[J].Nat Immunol,2009,10(2):203⁃213.[20] Lu Y,Yi Q.Utilizing T9cells as a novel therapeutic strategy formalignancies[J].Oncoimmunology,2013,2(3):e23084. [21] Daley D,Mani VR,Mohan N,et al.Dectin1activation onmacrophages by galectin9promotes pancreatic carcinoma andperitumoral immune tolerance[J].Nat Med,2017,23(5):556⁃567.[22] Ariizumi K,Shen GL,Shikano S,et al.Cloning of a seconddendritic cell⁃associated C⁃type lectin(Dectin⁃2)and itsalternatively spliced isoforms[J].J Biol Chem,2000,275(16):11957⁃11963.[23] Taylor PR,Reid DM,Heinsbroek SEM,et al.Dectin⁃2ispredominantly myeloid restricted and exhibits unique activation⁃dependent expression on maturing inflammatory monocyteselicited in vivo[J].Eur J Immunol,2005,35(7):2163⁃2174.[24] Sancho D,Reis e Sousa C.Signaling by myeloid C⁃type lectinreceptors in immunity and homeostasis[J].Annu Rev Immunol,2012,30(1):491.[25] Kimura Y,Inoue A,Hangai S,et al.The innate immune receptordectin⁃2mediates the phagocytosis of cancer cells by kupffer cellsfor the suppression of liver metastasis[J].Proc Natl Acad Sci,2016,113(49):14097⁃14102.[26] Dupaul⁃Chicoine J,Arabzadeh A,Dagenais M,et al.The Nlrp3inflammasome suppresses colorectal cancer metastatic growth inthe liver by promoting natural killer cell tumoricidal activity[J].Immunity,2015,43(4):751⁃763.[27] Temizoz B,Kuroda E,Ishii KJ.Vaccine adjuvants as potentialcancer immunotherapeutics[J].Int Immunol,2016,28(7):329⁃338.[28] Marshall ASJ,Willment JA,Pyz E,et al.Human MICL(CLEC12A)is differentially glycosylated and is down⁃regulatedfollowing cellular activation[J].Eur J Immunol,2006,36(8):2159⁃2169.[29] Lahoud MH,Ahmet F,Kitsoulis S,et al.Targeting antigen tomouse dendritic cells via Clec9A induces potent CD4T cellresponses biased toward a follicular helper phenotype[J].JImmunol,2011,187(2):842.[30] Hutten TJA,Thordardottir S,Fredrix H,et al.CLEC12A⁃mediatedantigen uptake and cross⁃presentation by human dendritic cellsubsets efficiently boost tumor⁃reactive T cell responses[J].JImmunol,2016,197(7):2715.[31] Sancho D,Mour⁃SáD,Joffre OP,et al.Tumor therapy in mice viaantigen targeting to a novel,DC⁃restricted C⁃type lectin[J].JClin Invest,2008,118(6):2098⁃2110.[32] Yan H,Kamiya T,Suabjakyong P,et al.Targeting C⁃type lectinreceptors for cancer immunity[J].Front Immunol,2015,6(2):408.[33] Li B,Cai Y,Qi C,et al.Orally administered particulate beta⁃glucan modulates tumor⁃capturing dendritic cells and improvesantitumor T⁃cell responses in cancer[J].Clin Cancer Res,2010,16(21):5153⁃5164.[34] Chiffoleau E.C⁃Type lectin⁃like receptors as emergingorchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutictargets[J].Front Immunol,2018,9:227.[收稿2018⁃06⁃22 修回2018⁃08⁃07](编辑 刘格格)。
细胞凝集胞实验报告
实验1.血细胞凝集Lab1.Blood cell agglutination摘要：细胞凝集指的是细胞与细胞之间通过某种凝集素的作用而相互粘连在一起的现象，最终形成大的细胞团块。
而凝集素由于可使细胞凝集而成为一种重要实验和临床试剂。
本次实验就是通过进行对兔血细胞的凝集操作，观察细胞凝集现象，并掌握凝集素促进细胞凝集的实验原理和操作方法。
关键词：细胞凝集、凝集素前言：凝集素是一类能专一识别糖并与之非共价可逆结合的非酶非抗体蛋白质。
凝集素是指从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞，故名凝集素。
凝集素按来源可分为植物凝集素、动物凝集素和微生物凝集素三大类;植物凝集素分为7个家族：豆科凝集素、几丁质结合凝集素、单子叶甘露糖结合凝集素、2型核糖体失活蛋白、木菠萝素家族、葫芦科韧皮部凝集素和苋科凝集素；动物凝集素按分子结构分为C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素等。
在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出的寡糖链，形成细胞外被（又称为糖萼）。
凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。
其反应机制如下图：凝集素在生化、医学等方面有广泛的应用：1.凝集素在实验室中经常被用来分离、纯化蛋白质植物凝集素的功能是结合细胞表面上的糖蛋白，动物凝集素的功能包括结合可溶性的细胞外或细胞内糖蛋白。
凝集素在实验室中经常用来分离、纯化糖蛋白。
这是由于植物凝集素能专一性地、非共价地可逆结合糖蛋白中不同类型的糖链结构，所以首先分别用凝集素亲和层析方法分离富集正常细胞和癌细胞的细胞裂解液中的糖蛋白，从细胞裂解物中高通量的分离出N-糖苷键型糖蛋白之后，再利用双向凝胶电泳技术对于被凝集素吸附的糖蛋白进行分离，最后利用质谱技术进行鉴定。
2.凝集素介导细胞与细胞、细胞与基质的粘附选凝素是一类Ca2+依赖的、能与特异糖基识别并结合的细胞粘附分子，主要介导白细胞与血管内皮细胞或血小板的识别和粘附。
植物血球凝集素
植物血球凝集素
华越洋
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华越洋-植物血球凝集素说明：生化研究，可用于有丝分裂的研究。
血型测定和红细胞凝集实验。
别名：Phaseolus vulgaris agglutinin；Lectin；PHA
特性：来源：菜豆
效价：<62.5 μg /ml 凝集活性<10 μg/ml促有丝分裂活性
S：22-24/25
溶解性：溶于PBS(PH7.2), 参考浓度：1 mg/ml
储存条件：2-8℃
植物血球凝集素（PHA）phytohaemagg lutinin 对原来从植物中发现的，具有凝集红血球作用的物质，而命名的，后来发现了很多具有同样作用的物质，扩大其含义为细胞凝集素中植物来源的总称——植物凝集素（phytoagglutinin，plant agglutinin）或凝集素（lectin）的同义词涵义模糊。
缩写pHA的多数是指从菜豆属（Phaseolus Vulgaris）和金雀花（P．Communis）中提取的凝集素。
提纯后蛋白质含量多的称为PH A－P，糖蛋白多的称为PHA－M。
它具有凝集红血球，促进淋巴球（主要是T细胞）的幼化和分裂的作用。
类似细胞凝集素作用的物质还有伴刀豆球蛋白A，美国商陆（phytolacca am－ericana）的促细胞分裂剂（mitogen）及革兰氏阴性菌的脂多糖。
植物凝集素的主要生物学作用及应用
植物凝集素的主要生物学作用及应用
杨远和
【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】1994(000)002
【摘要】一、植物凝集素简介植物凝集素(Lectin)一词,起源于拉丁语Legere。
它是非免疫起源的,能与糖类结合的一类蛋白质,具有使细胞凝集和使多糖沉淀的特性,每分子的植物凝集素至少有二个能与糖结合的位点。
一般而言。
【总页数】3页(P1-3)
【作者】杨远和
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q51
【相关文献】
1.植物凝集素的部分生物学作用分析 [J], 于敏;袁萍萍;章莹莹
2.植物凝集素的分子生物学研究 [J], 高莹;瞿礼嘉;陈章良
3.应用植物凝集素研究鱼类寄生虫病原生物学的进展 [J], 赖晓健;熊静;于海振
4.生物学自主设计型实验探索——以植物凝集素为例 [J], 吴智华; 刘虹
5.植物凝集素的生物学功能与应用 [J], 王钰清; 邢雪聪; 柴许然; 杨耀宇; 王振义; 吴传芳; 鲍锦库
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凝集途径检测细胞因子实验报告
凝集途径检测细胞因子实验报告1.凝集素凝集素是一类含糖（少数例外）并能与糖转移结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。
常用的为植物凝集素，通常一起被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他们的总称。
在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（又称为糖粤)。
凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成”桥”，从而引起细胞凝集。
凝集素引起的血细胞凝集，其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生物化学过程完全不同;另外，凝集素能与不同的糖蛋白特异结合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，因此Ponder提出应称”凝集素组织化学”而不能称为”凝集素免疫组织化学""人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。
ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体;不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。
另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。
―如∶植物凝集素可抑制受精;芸豆凝集素可直接抑制HIV-1反转录酶的活性，减少HIⅣ感染者的病毒载量﹔细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。
2.细胞凝集细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。
细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。
C型凝集素受体介导的抗真菌感染机制研究进展
C型凝集素受体介导的抗真菌感染机制研究进展张琴;史伟峰【摘要】近年来,由于广谱抗菌药物、免疫抑制剂的广泛使用,以及实体器官移植、骨髓移植、侵袭性治疗、恶性肿瘤、HIV患者、各种基础疾病逐年增多等原因,真菌感染患者明显增多,死亡率也逐年上升.C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLRs)主要表达在树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞表面,可识别真菌细胞壁β-葡聚糖、甘露聚糖等,激活下游信号通路,促进免疫细胞分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α等多种促炎细胞因子,并启动适应性免疫应答,清除感染真菌.鉴于CLRs在真菌感染免疫应答中发挥的关键作用,该文对CLRs的功能及机制研究进展作一综述.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2018(036)010【总页数】4页(P763-766)【关键词】C型凝集素;固有免疫;抗真菌感染【作者】张琴;史伟峰【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.5模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等固有免疫细胞表面、胞浆和血清中，能够直接识别磷壁酸、肽聚糖、内毒素、甘露糖、DNA或RNA等病原体成分及其产物，以及宿主凋亡细胞和衰老细胞表面某些共有特定分子结构。
常见PRRs有Toll样受体家族(toll like receptors，TLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)、维甲酸诱导基因I型受体家族(retinoic-acid inducible gene Ⅰ-like receptors，RLRs)、C型凝集素受体(C-type lectin receptors, CLRs)、DNA依赖的干扰素调节因子3的活化(DNA dependent activation of IRF3，DAI)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)等。
食用豆科植物皂苷和植物凝集素毒性试验
预防医学 2019 年 7 月第 31 卷第 7 期 Prev Med，Jul. 2019，Vol.31，No.7
· 实验技术 ·
食用豆科植物皂苷和植物凝集素毒性试验
张静，姜淑卿，张书婧，王晓军，钱智勇
天津市疾病预防控制中心毒理室，天津 300011
摘要：目的 检测常见豆科植物豆角中皂苷和植物凝集素的毒性，为豆科植物食物中毒的实验室诊断提供方法和依据。
DOI：10.19485/ki.issn2096-5087.2019.07.032 作者简介：张静，硕士，副研究员，主要从事卫生毒理学与分子生物学
研究工作 通信作者：钱智勇，E-mail：qzyong@
巴斯），ario Skan Flash 光栅型多功能酶标仪 （美国 Threom） ， Centrifuge 5810 高 速 离 心 机 （ 德 国 Eppendorf），CO2 培养箱 （美国 Threom），多功能果蔬 料理机，皂苷快速定性试剂盒，48 孔聚苯乙烯血凝 板，新鲜兔血、鸡血。 1.2 方法 1.2.1 受试物处理 平行称取 50 g 豆角 4 份，150 g 豆角 4 份，分别于沸水中煮沸 0、3、5、10 min，冰 盒降温，吸去表面水分，果蔬料理机制成匀浆，并加 入生理盐水 30 mL，为不同煮沸时长Ⅰ号匀浆和Ⅱ号 匀浆。平行称取 150 g 豆角 4 份，同法制成匀浆，4 层纱布过滤，并加入生理盐水 30 mL，为不同煮沸时 长Ⅲ号滤液。 1.2.2 大鼠体内毒 性试验 参照 GB 15193.3—2014 《急性经口毒性试验》［4］，人用量按 200 g/60 kgbw 计 算。大鼠随机分为 8 组，每组 10 只，雌雄各半，状 态良好，同性别大鼠个体间体重差异不超过 15%。 大鼠经口灌胃 0、3、10 min 组Ⅰ号匀浆，剂量分别 为 20.0 g/kgbw （记为低剂量组，相当于人用量的 6 倍 ， 灌 胃 量 为 36、 30、 29 mL/kg） 和 40.0 g/kgbw （记为中剂量组，相当于人用量的 12 倍，灌胃量为 71、 60、56 mL/kg）；经 口 灌 胃 0、 3 min 组 Ⅲ 号 滤 液，剂量为 75.0 g/kgbw （记为高剂量组，相当于人 用量的 22 倍，灌胃量为 73、63 mL/kg；受试物 5 h 内分 2～3 次给予，观察 2 周内大鼠中毒症状和死亡
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·综述· 收稿日期:2006207207 植物凝集素的研究进展 舒晓燕1 ,阮期平2 ,侯大斌1 (1. 西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621000 ; 2. 绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000) 摘要 植物凝集素是一类具有高度特异性糖结合活性的蛋白,广泛分布于植物界。本文综述了植物凝集 素近年来的研究概况,介绍了植物凝集素的分类、结构特性、功能、基因克隆及其应用。 关键词:植物凝集素;分类;性质;功能;基因克隆;应用 中图分类号:R282. 71 文献标识码:A 文章编号:100422199 (2006) 0620053204 植物凝集素是指能可逆结合特异单糖或寡糖的 蛋白质。随着植物凝集素家族成员的增加,对其结 构、功能研究的深入和分子生物学水平上新的发现, 植物凝集素的定义已几经修正, 1995 年Willy J . Peumans 和El s J . M. Van Damme 认为确定蛋白质 为凝集素的唯一前提条件是至少应有一非结构域, 且其能可逆地结合到特异碳水化合物上[ 1 ] 。 植物中,不仅种子中存在凝集素,根、茎、叶、皮、 果实中也发现有凝集素。1888 年俄国Dorpt 大学 的Stillmark 首次发现了蓖麻凝集素。1936 年 Summer and Howell 发现凝集素专一性结合糖的性 质。1960 年Nowell 报道了植物细胞凝集素有促进 有丝分裂的作用。1975 年Becker 等研究了刀豆凝 集素分子的三级结构,揭开了研究植物凝集素分子 空间结构和功能的序幕[2 ] 。 目前已经发现的植物凝集素近1 000 种,广泛 分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科 等众多植物类群中,其中豆科植物凝集素最丰富,有 600 多种。通过分离鉴定,对它们的性质、分子结构 及功能作了大量的研究,许多工作已深入到基因水 平。近年来,随着对凝集素研究的展开,人们已认识 到凝集素的重要性。现在免疫学、肿瘤、生殖生理、 细胞生物学等许多方面得到应用,在医学、农业上呈 现出巨大的应用前景。 1 植物凝集素的种类 1. 1 根据植物凝集素亚基的结构特征,植物凝集 素被分成4 种类型: 1. 1. 1 部分凝集素(merolectins) 部分凝集素是 一类结构域较小的单一多肽蛋白,只含一个糖结合 结构域,它们不能沉积复合糖和凝集细胞。 1. 1. 2 全凝集素( hololectins) 全凝集素也只由 糖结合结构域组成,但包含至少两个相同或高度同 源的糖结合结构域,此类凝集素有多个结合位点,可 以凝集细胞和沉淀复合糖,目前已知的绝大多数凝 集素属于此类。 1. 1. 3 嵌合凝集素(chimerolectins) 嵌合凝集素 是一类融合蛋白,由一个或多个糖结合结构域及一 个具有酶活性或其他生物活性的结构域共同组成。 根据其糖结合结构域的数目,嵌合凝集素的性质可 能类似于部分凝集素或全凝集素, 如多价Ⅱ型 (multivalent type Ⅱ) 核糖体失活蛋白(RIP) 可以凝 集细胞,而单价Ⅰ类(monovalent class Ⅰ) 植物几丁 质酶基因只有单一的几丁质结合结构域,不能凝集 细胞。 1. 1. 4 超凝集素( superlectins) 超凝集素与全凝 集素类似,至少含有2 个以上的糖结合结构域,而与 全凝集素不同的是,超凝集素的结构域不完全相同 或相似,它们识别结构不同的糖类。 1. 2 按结合糖的类型,凝集素可分为6 类: (1) D2甘露糖或D2葡萄糖凝集素,如伴刀豆凝 集素A (ConA) ; (2) N2乙酰氨基葡萄糖凝集素,如 麦胚凝集素(WGA) ; (3) N2乙酰氨基半乳糖凝集 — 53 — 现代中药研究与实践2006 年第20 卷第6 期 Research and Practice of Chinese Medicines © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 素,如大豆凝集素( SBA) ; (4) D2半乳糖凝集素,如 蓖麻凝集素(RCA) ; (5) L2岩藻糖凝集素,如荆豆凝 集素(U EA) ; (6) N2乙酰神经氨酸(唾液酸) 凝集 素,如马蹄蟹凝集素。 1. 3 根据氨基酸序列的同源性及其在进化上的关 系,植物凝集素可以分为7 个家族。 1. 3. 1 豆科凝集素 豆科凝集素是来自豆科植物 的一类同源蛋白,是目前研究得最为清楚的凝集素 家族,已经从70 多种植物中纯化了豆科凝集素,其 中大部分来自种子,豆科凝集素还存在于叶片、茎 皮、根等营养器官中。所有的豆科植物都由2 个或 4 个分子量约为30 kDa 的原体组成,有1 个糖结合 位点。大多数为金属离子结合的糖蛋白,每个亚基 有一个Mn2 + 和一个Ca2 + ,它们对于凝集素的糖结 合活性是非常重要的。而且按一定的顺序结合,先 结合Mn2 + ,然后其他位点结合Ca2 + ,这两种结合必 须是结合位点处于最优化的构象状态[3 ] 。这一家族 在分子水平上存在序列的同源性,特别是那些稳定 二、三级结构的序列,或是与亚基间连接、金属离子 结合相关的氨基酸残基,以及一些疏水性残基等,但 糖结合特异性差异极大。 1. 3. 2 几丁质结合凝集素 几丁质结合凝集素含 有一个或多个橡胶素( hevein) 结构域。橡胶素是 从橡胶树的乳液中分离的,由43 个氨基酸组成的小 分子蛋白,属于具有一个几丁质结合位点的单凝集 素。目前已经在禾本科、荨麻科、罂粟科、商陆科和 茄科中发现了,几丁质结合凝集素的存在,它们具有 高度的序列同源性。 1. 3. 3 单子叶甘露糖结合凝集素 雪花莲凝集素 ( GNA) 是第一个发现的单子叶甘露糖结合凝集素。 之后,在单子叶家族石蒜科、凤梨科、葱科、天南星 科、兰科和百合科中都发现了相似的蛋白质,不仅序 列上具有同源性,而且都表现出对甘露糖的结合专 一性。 近年还发现,编码单子叶甘露糖结合凝集素的 基因是一类相关基因组成的基因家族。对雪花莲 属、水仙属等石蒜科凝集素基因cDNA 序列分析表 明,它们各自都有不同的凝集素基因的表达,可能是 有许多同工凝集素存在的原因[4 ] 。 1. 3. 4 Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP) 在20 多种植 物中发现有Ⅱ型核糖体失活蛋白,如ricin 、abrin 、 modeccin 、volkensin 、viscumin[5 ,6 ] 和从接骨木中提 取的Ebulin Ⅰ[7 ] 等凝集素。Ⅱ型核糖体失活蛋白具 有特异的rRNA N2糖苷酶活性,能够催化失活真核 细胞的核糖体,由1 、2 或4 个相同的亚基组成,每个 亚基包括两个在结构和功能上都不同的多肽。其主 要识别半乳糖或N2乙酰半乳糖胺。目前仅有少数 II 型核糖体失活蛋白的序列已知。 1. 3. 5 木菠萝素(J acalin) 家族 木菠萝素是从木 菠萝(Arotocarp us integrifolia) 的种子中提取的, 对半乳糖专一的凝集素。这一家族根据其糖结合的 专一性分为两个类别,一类是半乳糖专一性的,包括 木菠萝素和一些桑科凝集素,它们有4 个相同的亚 基,每个亚基由1 个短的β链和1 个长的α链组成; 另一类是甘露糖专一性的,由多个亚基构成的多聚 体,每个亚基由1 条肽链构成。 1. 3. 6 葫芦科韧皮部凝集素 此类凝集素位于葫 芦科韧皮部,都是分子量约25 kDa 亚基组成的非糖 基化双体蛋白,识别( GlcNAc) n 多糖。随着Glc2 NAc 多糖链增加到5 个,它们的抑制活力增加,表 明这一家族凝集素具有扩展结合位点,同时能识别 N2糖原中的双2N2乙酰壳二糖基片段。 1. 3. 7 苋科凝集素 许多苋科植物的种子中包含 一类对GalNAc 具有特异性的凝集素,它们在氨基 酸序列和三维结构上与其他的植物凝集素都不同。 目前发现的这类凝集素不超过10 种,由于最初在苋 科苋属植物种子中发现,因此被命名为amaranthin 。 所有的amarant hins 都是由2 个同源亚基以头2尾方 式排列而形成的二体。糖专一性实验表明amaran2 t hin 可被GalNAc 抑制, 但与T 抗原Galβ( 1 , 3) GalNAc 有更高的亲和力。 2 植物凝集素的分离纯化 植物凝集素的分离、提纯及相关生物活性测定, 一直是研究者关注的热点。具体的分离纯化方法目 前有很多种,基本上都是按照蛋白质分离方法进行。 一般先将提取物经硫酸铵分级沉淀,然后通过阴离 子或阳离子交换层析。如果此种凝集素的糖结合专 一性已知,可以利用亲和层析加以纯化。利用受体 制备亲和层析柱,然后用洗脱液进行解吸附。注意: 前提是所用的介质必须不影响凝集素的凝集活性。 还有一种疏水层析,由于很多凝集素具有特殊的疏 水接合部位,因此可使用此方法加以分离。这种方 法可以不必考虑凝集素的糖结合活性,可以用水作 洗脱剂,经济、简便、条件温和且回收率高。 — 54 — 现代中药研究与实践2006 年第20 卷第6 期 Research and Practice of Chinese Medicines © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 由于凝集素自身很不稳定,易受p H、温度及离 子等条件变化的影响,加之在生物体内的含量很低, 使它的纯化十分困难,同时也阻碍了对它的深入研 究。将凝集素粗品纯化的方法种类繁多,文献报道 的有DEAE2Sep harose 、DEAE2cellulose52 柱层析、 Sep hadexG2100 、Sep hadexG225 、CM2sep harose Fast F10w 柱层析等。这些方法相互配合使用,形成系 列纯化,而且先后顺序各有不同。 3 植物凝集素的结构特性 通过分离纯化,对凝集素的生物学特性、蛋白质 的结构与功能及基因的编码顺序进行深入的研究。 目前已经获得纯化的凝集素中,阐明氨基酸序列的 并不多,多数是对甘露糖(或葡萄糖) 专一的凝集素。 从已分离的凝集素看,分子量变化范围约为10 kDa ～100 kDa ,亚基数目为2～4 个。关于亚基产生的 分子机制,有三种解释: (l) 不同亚基是不同基因编 码的产物; (2) 不同亚基由统一基因编码,但经翻译