E3泛素连接酶APC对糖尿病大鼠肾组织SnoN蛋白

第３４卷第４期２００９年８月贵阳医学院学报

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＹＡＮＧＭＥＤＩＣＡＬＣＯＬＬＥＧＥＶｏｉ．３４Ｎｏ．４２００９．８

Ｅ３泛素连接酶ＡＰＣ对糖尿病大鼠肾组织ＳｎｏＮ蛋白表达的影响木

郭兵，刘瑞霞，崔龙，石明隽，肖瑛，李晓颖

（贵阳医学院病理生理学教研室，贵州贵阳５５０００４）

［摘要］目的：观察ＡＰＣＩ０在糖尿病大鼠肾组织中的表达变化，并初步探讨其与糖尿病肾病（ＤＮ）发生发展中ＳｎｏＮ蛋白表达变化的关系。方法：大鼠随机分为糖尿病２、４和８周组，每组均设鼠龄匹配的正常对照组；生化方法测ｍ糖、血肌酐和２４ｈ尿蛋白，并观察肾脏指数；免疫组织化学检测ＡＰＣＩＯ、核转录共抑制因子ＳｎｏＮ（ＳｎｏＮ）、转化生长因子．Ｂ．（ＴＧＦ—ｐ，）、Ｓｍａｄ２／３及链脲佐菌素（ＦＮ）蛋白的表达变化；ＲＴ—ＰＣＲ检测ＳｎｏＮｍＲＮＡ的表达。结果：ＡＰＣＩ０阳性染色见于各组大鼠肾小管，随ＤＮ病程进展其表达逐渐增多，ＳｎｏＮ蛋白表达逐渐减少，ＴＧＦ－１３。、Ｓｍａｄ２／３及ＦＮ蛋白亦随ＤＮ发展而增多；各时点糖尿病大鼠ＳｎｏＮｍＲＮＡ的表达与正常对照组相比差异无统计学意义。结论：ＡＰＣＩ０在ＤＮ发生发展中的表达增多可能介导了ＳｎｏＮ蛋白的泛素化降解，可能是ＳｎｏＮ蛋白表达减少的主要机制之一。［关键词］糖尿病肾病；转化生长因子ｐ；免疫组织化学；连接酶类；大鼠，Ｓｐｒａｇｎｅ－Ｄａｎｌｅｙ；后期增进复合体；转录共抑制因子［中图分类号］Ｒ５８７．２０２［文献标识码］Ａ［文章编号］１０００－２７０７（２００９）０４－０３６０－０６

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＥ３ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＬｉｇａｓｅＡＰＣｏｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｎｏＮｉｎＲｅｎａｌＴｉｓｓｕｅｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＲａｔｓ

ＧＵＯＢｉｎｇ，ＬＩＵＲｕｉｘｉａ，ＣＵＩＬｏｎｇ，ＳＨＩＭｉｎｇｊｕｎ，ＸＩＡＯＹｉｎｇ，ＬＩＸｉａｏｙｉｎｇ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＧｕｉｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎａｐｈａｓｅｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｏｍｐｌａｘ（ＡＰＣ）ｉｎｒｅｎａｌｔｉｓ—

ｓｕｅｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ，ａｎｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｔｏｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆＳｋｉ—ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＮ（ＳｎｏＮ）

ｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ（ＤＮ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ

ｉｎｍａｌｅ

Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙｒａｔｓ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｓｅｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ３ｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈｄｉｓｅａｓｅｃｏｕｒｓｅｓｏｆ２

ｗｅｅｋｓ，４ｗｅｅｋｓ，ａｎｄ８ｗｅｅｋｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｒｅｅａｇｅ—ｍａｔｃｈｅｄｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｓｅｔｕｐｓｉｒｅ—ｕｈａｎｅｏｕｓｌｙ．Ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅ（ＢＧ），Ｓｅｒｕｍｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（Ｓｃｒ），ａｎｄ２４ｈｕｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＰ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃ—ｔｅｄｗｉｔｈｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｋｉｄｎｅｙｉｎｄｅｘｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＣＩＯ，ＳｎｏＮ，ＴＧＦ—

ｐ１．Ｓｍａｄ２／３ａｎｄＦＮｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄＳｎｏＮｍＲＮＡｗａｓ

ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＡＰＣＩＯｐｒｏｔｅｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｒｅｎａｌｔｕｂｕｌｅｓｏｆａｌｌｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄＡＰＣ１０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｒｅｎａｌｃｏｄｅｘｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ＳｎｏＮｐｒｏｔｅｉｎｔａｐｅｒｅｄｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｎａｌｔｉｓｓｕｅｓ．ＴｈｅｒｅＷａｓａｔｉｍｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＴＧＦ—

Ｂ１，Ｓｍａｄ２／３ａｎｄＦＮｉｎｔｈｅｋｉｄｎｅｙｏｆＤＮｒａｔｓ．ＮｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆＳｎｏＮｍＲＮＡｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｒａｔｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄＤＮｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｏｆＡＰＣＩＯｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇ

ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤＮｍａｙｌｅａｄｓｔｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＳｎｏＮｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔ

ｂｅ

ｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｉｎｃａｕｓｅｓｆｏｒｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆＳｎｏＮｐｒｏｔｅｉｎ．

‘［基金项目］贵州省科技攻关资助项目［黔科字Ｓ（２００７）１０３３号］，贵州省高层次人才科研条件特助经费资助项目（ＮＯ．ＴＺＪＦ－２００７年一“号），贵州省科技基金资助项目［黔科合Ｊ字（２００８）２１６７号】：

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万方数据４期郭兵等Ｅ３泛素连接酶ＡＰＣ对糖尿病大鼠肾组织ＳｎｏＮ蛋白表达的影响［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｌｉｇａ—

ｓｅｓ；ｒａｔｓ，Ｓｐｒａｇｕｅ—ｄａｗｌｅｙ；ａｎａｐｈａｓｅｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣＯ—ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ

糖尿病肾病（ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＤＮ）是糖尿病患者临床常见而难治的并发症，其发病率很高，在欧美国家和我国经济发达地区，ＤＮ肾衰占透析和肾移植人数的前列。然而，ＤＮ的发病机制尚未完全阐明，亦无有效的治疗药物。细胞培养、动物试验及人体研究均发现转化生长因子一Ｂ。（Ｔｒａｎｓ—ｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ—Ｂ１，ＴＧＦ－Ｂ１）在ＤＮ发病机制中起着重要的作用，它通过Ｓｍａｄｓ信号通路调节细胞的增殖、分化、移行及凋亡，进而促进ＤＮ的发生和发展，其中糖尿病时的高血糖和ＡｎｇⅡ是ＴＧＦ．Ｂ。的主要刺激因子¨。Ｊ。目前国内外对这一信号转导网络研究较多的是从胞膜进人胞质这一阶段，ＴＧＦ—Ｂ，信号由Ｓｍａｄｓ蛋白介导入核后如何调控相关基因转录与翻译的机制仍不甚清楚。近期的研究显示，核转录共抑制因子ＳｎｏＮ（Ｓｋｉ—ｒｅｌａｔｅｄｎｏｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎＮ）蛋白在ＤＮ中的表达变化可能与ＴＧＦ—Ｂ，顺利发挥其致肾纤维化作用有关Ｈ１。而有关ＤＮ发病过程中，肾小管上皮细胞ＳｎｏＮ蛋白表达变化的调节机制研究，国内外尚未检索到相关的报道。为此，从ＳｎｏＮ的蛋白降解和基因转录两个方面初步探讨其表达变化的机制，以期进一步阐明ＳｎｏＮ在ＤＮ发病机制中的作用。１材料和方法１．１材料１．１．１实验动物清洁级健康雄性Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗ－ｌｅｙ（ＳＤ）大鼠，体霞（１８０４－２０）ｇ，由上海实验动物中心提供，批号：ＳＣＸＫ（沪）２００３—０００２。１．１．２主要试剂链脲佐菌素（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）由美国Ｓｉｇｍａ公司生产；ＡＰＣＩ０和ＳｎｏＮ兔多克隆抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ）；ＴＧＦ—Ｂｌ、Ｓｍａｄ２／３和ＦＮ兔多克隆抗体，ＳＡＢＣ免疫组织化学试剂盒，ＤＡＢ显色剂（武汉博士德）。ＳｎｏＮ及ｐ—ａｃｔｉｎ引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；总ＲＮＡ提取试剂盒（ＴＲＩｚｏｌ法）、２ｘＴａｑＰＣＲＭａｓ—ｔｅｒＭｉｘ、Ｍａｒｋｅｒｌ（天根生化科技有限公司）；Ｒｅｖｅｒ＿ｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎ—ｔａｓ）。其他试剂均为市售分析纯。１．１．３主要仪器高速低温离心机（美国Ｂｅｃｋ—ｍａｎ）、核酸蛋白分析仪（美国Ａｍｅｒｓｈａｍ）、凝胶成像系统（美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ）、梯度ＰＣＲ扩增仪（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）。１．２方法１．２．１链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型的建立３６只ＳＤ大鼠随机分成正常对照组（ｒｔ＝１８）和糖尿病组（ｎ＝１８）。糖尿病组给予尾静脉注射溶于

ｐＨ４．５、０．０１ｍｏＬ／Ｌ无菌柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液的ＳＴＺ（５５ｍｇ／ｋｇ），７２ｈ后测空腹血糖，血糖值≥１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ者入选；正常组尾静脉注射ｐＨ４．５、Ｏ．０１ｍｏｌ／Ｌ无菌柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液５００斗Ｌ／

只；两组大鼠均予清水、常规饲料喂养共８周。１．２．２动物处理３６只大鼠分别于实验进行至２、４、８周时处死，其中每次处死正常组６只、糖尿病组６只。于处死前１ｄ代谢笼收集２４ｈ尿液，记录尿量。禁食６—８ｈ，乙醚麻醉后称重，股动脉放血收集血液，４℃离心，分离血清，一２０℃保存；处死大鼠，灌洗肾脏，直至肾脏变为苍白色，取双肾，去掉包膜及脂肪组织，称重，两肾分别于４％多聚甲醛固定及一８０℃保存。１．２．３生化指标测定考马斯亮蓝法测尿蛋白，氧化酶（ＧＯＤ—ＰＡＰ）法测血清葡萄糖，苦味酸法测血清肌酐，均按试剂说明书操作。以肾重与体重比值作为肾脏指数。１．２．４’肾组织形态学观察多聚甲醛固定的肾组

织制成３“ｍ厚的石蜡切片，行ＨＥ染色，光镜下观察肾组织形态结构的变化。１．２．５。肾组织免疫组织化学检测肾组织石蜡切片进行免疫组织化学ＳＡＢＣ法检测，ＡＰＣＩ０和Ｓｍａｄ２／３蛋白一抗浓度为ｌ：５０，ＳｎｏＮ、ＴＧＦ－Ｂｌ和ＦＮ蛋白一抗浓度均为ｌ：１００，阴性对照用ＰＢＳ代替一抗，ＤＡＢ显色，苏木素复染。免疫组织化学计数方法参考文献［５］，高倍镜（４００倍）下计数１０个视野的免疫染色阳性肾小管数，取均值。１．２．６ＲＴ—ＰＣＲ检测肾组织ＳｎｏＮｍＲＮＡＴｆｉｚｏｌ一步法提取肾组织中总ＲＮＡ，核酸蛋白仪测ＲＮＡ的浓度和纯度（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ，比值在１．８—２．０）。取５斗ｇ总ＲＮＡ随机引物法逆转录合成ｃＤ．ＮＡ，进行ＲＴ．ＰＣＲ。ＳｎｏＮ及Ｂ－ａｃｔｉｎ的引物序列、退火温度及循环次数见表ｌ。ＰＣＲ产物经１．５％琼３６１

万方数据