免疫学技术
常用免疫学检验检测技术
要点一
总结词
要点二
详细描述
蛋白质分析的常用技术
免疫印迹技术是一种用于分离、检测和识别蛋白质的常用 技术。该技术通过将蛋白质混合物在凝胶上进行电泳分离 ，然后将其转移到膜上，再与特异性抗体结合，最后通过 显色反应检测目标蛋白质。免疫印迹技术具有高灵敏度、 高特异性和可同时检测多个蛋白质的特点，广泛应用于生 物学、医学和生物工程领域。
注意事项
由于放射性同位素具有放射性，操作过程中需要注意安全防护，避免对操作人员和环境造成污染。同 时，由于放射免疫分析需要使用放射性同位素标记的抗原，因此成本较高。
优缺点分析
优点
放射免疫分析具有较高的灵敏度和特异性， 可以用于痕量物质的定量检测；操作简便， 易于自动化；测量结果准确可靠。
缺点
由于使用放射性同位素，操作过程中存在安 全风险；成本较高，需要特殊仪器和实验室 条件；对于某些样品，可能存在交叉反应或 非特异性干扰。
化学发光免疫分析（CLIA）
总结词
快速、高灵敏度的定量检测技术
详细描述
化学发光免疫分析是一种基于化学发光反应 的免疫分析技术，通过测量化学发光反应过 程中释放的光子数量来检测抗原或抗体的浓 度。该技术具有快速、高灵敏度和低背景干 扰的优点，广泛应用于传染病、肿瘤标志物
和激素等生物分子检测领域。
免疫印迹技术（Western Blot）
05
其他常用免疫学检验检测技术
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
总结词
高灵敏度、高特异性的定量检测技术
详细描述
时间分辨荧光免疫分析是一种基于荧光能量共振转移的免疫分析技术，通过测量荧光标 记物的发射光谱来检测抗原或抗体的浓度。该技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干
免疫学快速检验技术有哪些？
免疫学快速检验技术有哪些？免疫学检验技术是将免疫学方法应用于医学领域，通过对抗原抗体的反应原理，借助有效的标记和追踪技术来分析人体免疫功能和疾病的一种技术。
在当前，随着医疗技术的不断发展，免疫学快速检验技术也得到了不断的进步，传统的检验中操作较为复杂，还容易受到各种因素干扰，对最终的检查结果造成影响，在当前，免疫学快速检测技术得到了不断的发展进步，为疾病的检验做出了突出贡献，本文将围绕着传统的免疫学快速检测技术、免疫胶体金技术、化学发光免疫分析技术、免疫荧光技术、免疫酶技术、生物传感器技术和生物芯片技术等相关的技术进行一一的分析，帮助大家全面了解免疫学快速检验技术。
免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应，早期包括了凝集现象、沉淀现象和溶血现象等等。
相关的免疫学快速检验技术也正是基于这一基础展开的，当前的技术主要由以下七个，分别是传统免疫学快速检验技术、免疫胶体金技术、化学发光免疫分析技术、免疫荧光技术、免疫酶技术、生物传感器技术和生物芯片技术等等，在下文中将对这几个基础进行说明。
技术一：传统免疫学快速检验技术传统的免疫学检验主要是通过抗体来源和检测标本来进行的检测。
因为检测标本大部分都是血清，所以传统的免疫学快速检验技术，还有一个称呼叫做血清学试验，它通过观察和测定样品中沉淀物形成扩散，凝结和溶血现象，来分析抗原和抗体的有无以及相关含量。
在传统的免疫学快速检测技术中，最具有代表性的就是梅毒快速诊断试验。
这个试验方法操作简单，易用性极好，但很容易受到其他疾病影响和其他因素干扰，呈现假阳性，所以需要进行多次实验才能够判断出最终的结果。
技术二：免疫胶体金技术这一技术主要是利用胶体机本身的吸附功能，将蛋白质等高分子就被吸附到了胶体金颗粒的表面，完成了胶体金标记。
这种免疫胶体金技术对各种蛋白质都有极强的吸附能力，试验过程中不需要特殊的设备，操作非常简单，但是这种技术的局限性就在于胶体金技术只能定性，无法定量，很容易出现假阴性的情况，同时如果有严重溶血和黄疸等疾病，会对最终的结果造成影响。
经典免疫学技术
间接凝集试验
间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体） 吸附在一种与免疫无关的惰性颗粒表面， 使其成为致敏载体，在与相应的抗体或抗 原反应，在电解质存在的条件下，载体颗 粒被动地发生凝集。
（正向）间接凝集试验 正向）
反向间接凝集试验
间接凝集抑制试验
自身红细胞凝集试验
抗球蛋白试验
抗球蛋白试验是1945年由Coombs建立的一 抗球蛋白试验是1945年由Coombs建立的一 种抗球蛋白抗体参与的血凝试验，用于检 测抗红细胞不完全抗体，因此又称为 Coombs试验 Coombs试验
根据其原理可以分为
透射免疫比浊（turbidimetry）、 透射免疫比浊（turbidimetry）、 散射比浊（nephelometry） 散射比浊（nephelometry） 速率散射比浊（rate nephelometry）。 速率散射比浊（rate nephelometry）。
透射免疫比浊试验
直接凝集反应
直接凝集反应是颗粒性抗原在电解质参与 下直接与相应抗体结合，出现凝集。反应 中的抗原可以称为凝集原（agglutinogen）， 中的抗原可以称为凝集原（agglutinogen）， 参与反应的抗体称为凝集素（agglutinin）。 参与反应的抗体称为凝集素（agglutinin）。
双扩散实验结果
免疫电泳技术
免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique） 免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique） 是可溶性抗原和抗体在直流电场的作用下，在凝 胶内加速定向运动，彼此相遇结合，在比例合适 处形成可见的沉淀物。
免疫电泳技术包括以下几种具体方法
体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细 胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。
免疫学检测技术基本原理
荧光免疫检测技术(FI)的基本原理
荧光免疫检测技术与FIA类似，但是不需要标记酶和底物，而是直接标记荧光染料，通过检测荧光信号 随时间变化的曲线来判断样品中免疫分子的存在和浓度。
无需酶标记
荧光免疫检测不需要使用 酶标记荧光素酶，避免了 潜在的酶和底物污染。
高通量检测
荧光免疫检测可以在低浓 度下完成快速检测，适用 于高通量和大规模的样品，可以 标记多种不同的免疫分子， 提高检测的多元性和特异 性。
放射免疫检测技术(RIA)的基本原理
放射免疫检测技术利用放射性标记的免疫分子来检测样品中目标免疫分子的存在和浓度。
1
放射性标记
将免疫分子与放射性元素标记如131I、125I等结合。
2
孵育和分离
将标记的免疫分子与待测样品反应孵育，通过分离获得实验的反应产物。
免疫学检测技术基本原理
免疫学检测技术是一种检测生物体内免疫分子的方法，应用广泛于临床诊断、 生命科学、农业、环境监测和食品安全等领域。
免疫学检测技术的定义和概述
免疫分子的来源
免疫分子包括抗体、补体和细 胞因子等，都是免疫系统特异 性抗原识别和应对的产物。
检测方法的基本原理
通过与特定抗原或抗体结合来 检测样品中目标免疫分子的存 在和浓度。
免疫学检测技术的应用
广泛应用于疾病诊断、药物开 发、生物学研究和疫苗制备等 领域，成为现代生物技术发展 的重要手段。
免疫学检测技术的常见方法
直接法
直接使用标记的抗体或抗原检测样品中的免 疫分子。
间接法
利用未标记的抗体与样品中的免疫分子结合， 再使用标记的二抗或蛋白A/G结合物检测。
竞争法
利用抗原或抗体与样品中的免疫分子竞争结 合，测定中目标免疫分子的含量。
免疫学检测技术基本原理及其应用课件
探讨免疫学检测技术在环境污染监测中的应 用，如检测水中的污染物。
生物医学研究
了解免疫学检测技术在研究领域的应用，如 免疫组织化学和流式细胞术。
食品安全监测
介绍免疫学检测技术在食品安全监测中的作 用，如快速检测食品中的有害物质。
免疫学检测技术的前景展望
展望免疫学检测技术未来的发展方向和应用 前景。
述
3 免疫学检测技术分
类
介绍免疫学检测的基本 原理，如抗原-抗体相互 作用和信号放大。
探讨不同类型的免疫学 检测技术，如免疫层析、 免疫荧光和酶联免疫吸 附实验。
免疫学检测技术的应用
临床诊断
探索免疫学检测技术在疾病诊断和监测中的 广泛应用，如病毒检测和肿瘤标志物。
生物工业
探索免疫学检测技术在生物工业中的应用， 如生物制药和工业发酵。
免疫学检测技术基本原理 及其应用课件
欢迎来到免疫学检测技术基本原理及其应用的课件！本课程将带您深入了解 免疫学检测技术的基本原理以及广泛的应用领域。让我们开始这段令人兴奋 的学习旅程吧！
免疫学检测技术基本原理1 来自疫学基础知识回顾回顾免疫学的基本概念 和原理，为后续的技术 解释提供基础。
2 免疫学检测原理概
免疫学检测技术的挑战与改进
1 技术难点
探讨当前免疫学检测技术所面临的挑战，如灵敏度、特异性和自动化。
2 改进方向
讨论改进免疫学检测技术的可能方向，如新的标记方法和数据分析技术。
免疫学课件：免疫血清学技术
抗体的生物学功能
抗体具有中和毒素、调理吞噬、介导炎症反应等 多种生物学功能。
抗原抗体结合机制
锁钥学说
ห้องสมุดไป่ตู้01
抗原与抗体结合就像锁和钥匙一样，具有高度的特异性和互补
性。
诱导契合学说
02
抗原与抗体在结合过程中，会发生构象变化，使得两者更加紧
力。
抗原的特异性
抗原与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合的物质基础。
抗原的分类
根据抗原性质不同，可分为完全抗 原和不完全抗原。完全抗原具有免 疫原性和特异性，而不完全抗原仅 具有特异性。
抗体结构与功能
1 2 3
抗体的基本结构
由四条多肽链组成，包括两条重链和两条轻链， 通过二硫键连接。
抗体的功能区域
密地结合在一起。
多重识别机制
03
抗原抗体结合不仅依赖于锁钥关系或诱导契合，还涉及到电荷、
疏水作用等多重因素。
03 免疫血清制备技术
动物选择与免疫方案
动物选择
选用健康、适龄、免疫原性强的实验动物，如兔、马、羊等 。
免疫方案
根据实验需求和免疫原性质，制定合适的免疫程序，包括免 疫剂量、免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
补体结合实验方法
补体结合试验（CFT）
在补体参与下，用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。该方法具有较高的敏感性和特异性。
间接补体结合试验
先用已知抗原致敏红细胞，再加入待检血清中的相应抗体，最后加入补体，观察红细胞是否溶解来判 断结果。该方法常用于检测某些病毒、立克次体等微生物的抗体。
临床免疫学检验技术
三、酶联免疫吸附试验（enzyme-
linked immunosorbent assay,ELISA）
• 4.捕获法 用于测定特异性IgM类抗体。被检 血清中针对某抗原旳特异性IgM和IgG常同步 存在，为防止IgG旳干扰，一般采用捕获法 来测定IgM。先将已知特异性抗体（如抗人μ 链）包被于固相载体上，加待测人血清样本， 其中旳IgM（IgM分子相对于固相抗μ链又是 一种抗原）被固相抗μ链抗体特异性捕获， 形成IgM-抗IgM复合物。洗涤除去血清中旳 其他Ig和杂质；加特异性抗原试剂，该抗原 只与固相上旳特异性IgM结合。
三、酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）
• 5. 生物素—亲合素ELISA（avidin—biotin— peroxi—dase complex，ABC-ELISA）是将生 物素（biotin）和亲合素(avidin)或链霉亲合素 (streptavidin,SA)引入ELISA旳措施。生物素是 一种小分子物质，经活化后可高比度旳偶联 抗体或抗原等大分子。亲合素（或链霉亲合 素）与生物素旳结合力极强，一分子亲合素 可与4个生物素分子结合。在反应系统中引入 生物素和酶标识亲合素，可将ELISA旳反应多 级放大，明显提升检测措施旳敏感性。
临床免疫学检验技术
一、概述
• 免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学 检验领域应用旳一门学科。免疫检验技术 则要点论述各类免疫学技术旳基本原理、 措施类型和临床应用。19世纪末相继建立 了凝集试验、沉淀试验和补体结合试验等 三大经典血清学试验，用于检测病原微生 物旳抗原或抗体对传染病旳诊疗起到主要 作用。
三、酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）
免疫学研究的新技术和新进展
免疫学研究的新技术和新进展随着科技的不断发展，人类社会也迈入了一个新时代。
在医学研究方面，人们对于免疫学研究的深入探讨越来越多，这也促使着科研人员不断探索新技术，以期对相关疾病的治疗有更好的了解。
下面我们将从多个角度来探讨免疫学研究的新技术和新进展。
一、单细胞RNA测序技术单细胞RNA测序技术是一种高通量、高精度、多参数的RNA分析技术。
它可以在单个细胞水平上分析细胞个体的转录功能和表达情况，从而帮助研究人员更加深入地了解细胞发育、疾病发生及治疗的细节。
该技术主要基于流式细胞术，将大量细胞分离成单个细胞后，在聚合酶链式反应（PCR）终端完成RNA扩增和高通量测序。
根据一定的算法模型，研究人员可利用这些测序数据推断出单个细胞的特征、特异性表达基因及其调控机制等，进而为疾病研究及治疗提供更好的基础。
例如，在肿瘤研究中，单细胞RNA测序技术可用于分析肿瘤内部的异质性表达特征，揭示新的靶向治疗策略。
二、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种基因编辑技术，可通过定向切除基因序列、替换、修复基因等方式，精准修饰细胞或生物体中的基因序列，从而改变其生物学特征。
这项技术的核心是“CRISPR-Cas9系统”：利用细菌具有识别、切割病毒基因组的天然免疫机制进行基因编辑。
在研究过程中，研究人员可操纵该系统精准切除（或替换、修复）细胞中的特定基因序列，以达到治疗疾病的目的。
例如，该技术在治疗免疫相关疾病方面有着广阔的应用前景，如肿瘤、炎症以及自身免疫疾病等，为医学研究和临床治疗带来了巨大的发展潜力。
三、单细胞ATAC-seq技术单细胞ATAC-seq技术是一种新型的染色质开放性测序技术，可用于分析单个细胞内某些区域的染色质开放度（即表观遗传水平）及其功能特性等。
基于细胞单核转录组的序列分析，可以建立高精准的基因调控模型，帮助揭示内源性调节机制及其在疾病发生和治疗上的应用。
在疾病预防、诊断和治疗等方面，该技术也有很大的应用潜力。
免疫学--酶免疫技术
Enzyme Immunoassay
❖ 酶免疫技术：
是用酶作标记物标记抗原或抗体，将抗 原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专 一性结合在一起的一种免疫检测技术。
本章主要内容
1.酶 标记物的制备 2.酶联免疫吸附试验 3. 酶免疫印迹试验 4. 生物素放大酶免疫技术
第一节 概述
一、技术原理 二、酶免疫技术的类型
是一种以膜为载体的酶免疫技术，以膜为载 体吸附抗原，加入抗体和酶标二抗，反应后 在膜表面形成免疫复合物，加底物显色进行 检测。
类型： 斑点酶免疫试验
（dot immunoenzyme filtration assay） 免疫印迹试验
（immuno-blotting test）
（一）斑点-酶联免疫吸附试验
❖ 生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验 Biotin-Avidin System ELISA
一、生物素-亲和素系统
❖ 生物素： Biotin ❖ 亲和素： Avidin
生物素
➢维生素H ➢动、植物组织中广泛分布,
卵黄和肝含量高,现可人工合成 ➢MW 244.31kD ➢结构：咪唑酮环＋噻吩环（图）
PAP:
过氧化物酶(P)-抗过氧化物酶(AP)复合物
Ag-Ab1-桥Ab2-PAP-桥Ab2B-ABC-S
第六节均相酶免疫测定
❖ 酶放大免疫测定技术 ❖ 克隆酶供体免疫测定技术
第七节 酶免疫测定的应用
1. 病原体及其抗体测定 2. 蛋白质测定 3. 非肽类激素测定 4. 药物和毒品测定
思考题： 1. 酶免疫技术的类型。 2.ELISA的基本原理。
二、技术类型
（一）酶免疫测定技术与酶免疫组化技术 1. 酶免疫组织化学技术:
常用免疫学检验技术的基本原理
常用免疫学检验技术的基本原理免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。
由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）.由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体)。
免疫学检测技术的用途非常广泛,它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。
最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。
这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。
单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈,沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比.利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。
免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开.然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。
然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体)的鉴别。
上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限.比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原(或抗体）的含量。
该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
免疫印迹法则首先通过电泳分离标准的已知抗原,然后将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，浸于待测血清中。
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洗涤不充分、封闭用的正常血清不对
2 .部分区域背景着色:切片部分区域干燥、显
色反应物在封片介质中可溶、造成弥散
3 .部分区域不着色:脱蜡不完全 、切片部分区 域干燥
4.各种孵育结果所有抗体均不着色 :H2O2 终浓度不够或存放过久、稀释液中有错
误的正常血清、显色反应物溶于脱水的
酒精及二甲苯或封片液 5.某些抗体不着色:需要消化而没有消化、
生物素-亲和素系统（biotin-avidin system）
生物素:一种维生素H,经活化后可与抗体、抗原、 酶以多 配一方式共价结合,且不影响它们的活性
亲和素:从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,可与
酶偶合,以一配多的方式对生物素有很强的亲和力
BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法/BA
法/ABC法
6. 消除内源性生物素活性:先以 0.01%抗生物
素溶液作用切片20min 7.ABC复合物应在临用前30min配置
8.ABC试剂保存温度为4℃
9.抗体保存：-20℃ 分装冻存,或于4℃ 常规使
用,切忌反复冻融
免疫组化常遇问题
1 .均匀的背景染色:酶-底物反应时间过长、孵 育切片干燥、一抗或二抗稀释度不够、切片
断中,后两者有意义,前者除标本处理和方法学
因素外,与细胞轻度异常表达及某些细胞摄取 了周围组织抗原有关
2.阳性标记细胞学特征
免疫组化阳性细胞反映抗原在细胞中的定位 和分布情况.阳性细胞以拟标记的细胞为前提, 阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在 抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使
阳性也不应作为判断依据.根据抗原在细胞中
⑶ 胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆.大
部分抗原均属此型,如细胞角蛋白、波形蛋白、
神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及
前列腺特异性抗原（PSA）等.抗原在胞浆内 分布通常为弥漫性或局限性.弥漫性是阳性颗
粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆,局限性是
指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞
浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧
抗原抗体复合物及其存在部位
荧光抗体染色方法 直接法:这是荧光抗体技术最简单和基本的
方法.滴加荧光抗体于待检标本片上,经反应和
洗涤后在荧光显微镜下观察.标本中如有相应
抗原存在,即与荧光抗体特异结合,在镜下可见
有荧光的抗原抗体复合物.此法的优点是简单、
特异.但其缺点是检查每种抗原均需制备相应
的特异性荧光抗体,且敏感性低于间接法
管型 腔缘型 菊团型
4.阳性标记强度特征
细胞免疫组化标记的阳性强度根据显 色程度分为弱阳性、阳性和强阳性;也可依
据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为:弱
阳性,阳性细胞≤25%;阳性,阳性细胞25%~
50%;强阳性,阳性细胞>50%
5.非特异着色特征
（1）抗体交叉反应:是由于该抗原决定簇同 时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在
2.操作过程结束,尽快荧光显微镜下看结果
3.注意镜下结合荧光与非结合荧光的区别
4.每次实验应该提前激发荧光显微镜光源
5.使用荧光显微镜时间1-2h为宜
Ⅳ 荧光原位杂交（FISH）技术
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是建立在核酸分 子杂交和放射性原位杂交基础上的非放
免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶
体金技术和发光免疫测定
Ⅰ.ELISA Ⅱ.免疫组化
Ⅲ.荧光抗体标记
Ⅳ.荧光原位杂交（FISH） Ⅴ.分光光度法
Ⅰ.酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应. 酶结合物具有双功能:高度特异的免疫反应、
⑷ 微绒毛型 抗原颗粒主要分布于腺癌细 胞的微绒毛,胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表
达.此形最常见于各种腺癌,如甲状腺、乳腺、
胃肠、胆道、卵巢浆液性腺 癌等.特点是阳性 颗粒靠近腔面,基底部可呈阴性反应.在肿瘤标
记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、
结肠相关抗原、卵巢癌抗原等,甲状腺腺癌中
甲状腺球蛋白常以该形式出现
存在某些抗原,但不属于瘤细胞固有成分,胞浆
内抗原定位较模糊,因此应该区别
（4）非特异性染色:是指抗原无明确定位,细 胞与间质均为黄色,相互累及一题或稀释度不合理及操作方法不规范等. 免疫组化特异性染色定位非常重要,如果缺乏
细胞间的不均一性染色即使阳性染色,常提示
时间不够、加抗体时切片上缓冲液过多
11 .切片镜下模糊或黑点沉着:脱水不彻底、
进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯
混合液、温箱干燥替代脱水过程
Ⅲ 免疫荧光标记技术
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能 量后,即刻引起发光,停止能量供给,发光亦瞬
即停止.荧光素是一种能吸收激发光的光能产
生荧光,并能作为染料使用的有机化合物,亦称
生物催化放大作用
基本方法:间接法、双抗体夹心法、竞争法、 生物素-亲和素系统
间接法
a.将已知可溶性抗原吸附于载体 b.温育后清洗 c.加入可能含特异性抗体的待检液 d.温育后清洗 e.加入酶标记的二抗 f.温育后清洗
g.加入酶作用底物
h.测定反应颜色深浅
双抗体夹心法
a.将已知抗体吸附于载体上
b.温育后清洗
TMRITC:最大吸收光谱550nm，最大发射光
谱620nm，橙红色
基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异
性和敏感性与显微示踪的精确性相结合,以荧 光素作为标记物,与已知的抗体(或抗原)结合、
不影响其免疫学特性.将荧光素标记的抗体作
为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原.在
荧光显微镜下,可以直接观察呈现特异荧光的
免疫学实验技术
免疫学技术--抗原抗体反应
可对抗原或 抗体进行定性、
定量、定位的
检测
影响因素:
电解质、温度
酸碱度
免疫标记技术:
是指用荧光素、放射性同位素、 酶、
发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标
记抗体或抗原进行的抗原抗体反应
特点:高度灵敏、特异、快速, 定性、定量、
定位 分类:免疫酶技术、免疫荧光技术、放射
基因定位、转基因检测、染色体异常观测及
疾病的诊断等众多领域
染色体荧光原位杂交始于细胞遗传学和 DNA技术的结合,基础为Southern blot原理,以
耗材:移液器、吸头、酶标板、滤纸
试剂:酶标抗体、抗体稀释液、封闭液、底物
溶液、终止液 仪器:酶标仪
ELISA结果分析
1.根据标准品的含量及检测OD值结果,应用线 性回归方程进行统计分析,可求得待测样品
的定量值
2.上机前将标准品的数量及含量按要求在酶 标仪上进 行设置,机器自动计算打印出标准 曲线及各待测样品的定量结果
分布和阳性颗粒沉淀部位可分5种类型：
⑴ 胞膜型
阳性颗粒主要分布于细胞膜表
面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞.此类
型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA）、 白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、
粒细胞相关抗原（GAA）
⑵ 胞核型 阳性颗粒定位于细胞核,呈均匀
分布位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布. 多见增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌 激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因 p53等
Ⅱ.免疫组织化学技术
免疫组化是组织化学的一种,是利用已知的
抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反
应使结合在特异性抗体上显示剂(酶、金属离 子、同位素等)显示一定的颜色,在显微镜下观
察颜色的变化,在抗原抗体结合部位确定组织、
细胞结构的化学成份或化学性质
1.阳性标记色度特征
免疫组化细胞阳性程度与抗原含量、分布密 度、标记方法有关. 一般抗原含量越多、密度 越高、标记方法越敏感,阳性显色则越强.淡黄 色,弱阳性;黄色,阳 性;棕黑色,强阳性 .结果判
间接法:首先将待测抗体加在含有已知抗
原的标本片上作用一定时间冲洗;滴加标记抗 抗体.如第一步中抗原抗体发生结合,加入的标
记抗抗体和已固定在抗原上的抗体分子结合,
形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物并显示荧
光.此法优点是敏感性高于直接法,缺点容易产
生非特异性荧光
免疫荧光实验的注意事项 1.反应过程一定要避光,操作过程尽量避光
射性原位杂交技术，将标记的核酸探针
与细胞或组织中的核酸进行杂交
它是基于DNA探针序列与标本细胞中互补序
列的特异碱基配对的原理,DNA探针经引入报
道分子（如生物素或地高辛）的化学修饰后， 可利用与特异报道分子结合物（如亲和素或
直接抗报道分子的抗体）偶联的荧光染料加
以检测。FISH技术可用于染色体的DNA检测、
⑵抗原表达必须在特定部位 阳性表达必须 在细胞和组织特定的抗原部位,如LCA在细胞
膜上、S-100蛋白在胞浆和胞核内,不在抗原
所在部位的阳性表达不能视为阳性 ⑶阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结
果不能认为具有否定意义;阳性表达有强弱、
多少之分,只有少数细胞阳性（在抗原所在部
位）也要视为阳性表达
引起假阴性和假阳性结果的原因
⑸ 复合型 常规免疫组化标记中,同一种 抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞
浆、微绒毛和胞浆,很少发现胞膜和胞核同时
表达.应注意组织标本固定不及时造成抗原移
位
3.阳性标记组织学特征
根据免疫组化阳性细胞的组织学特点, 免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类
型排列:局灶型 弥漫型 片块型 网状型 腺
为非特异性染色.组织片边缘反应和出血坏死
灶周围阳性反应不能作为诊断依据
免疫组化结果的判断原则及 对假阴性和假阳性的认识