叶绿体的分离与荧光观察实验报告
叶绿体的分离与荧光观察.ppt
表面张力作用， 从而使细胞发生融合，
进而细胞质沟通，形成一个双核或多核 细胞
实验用品
1.器材：离心机，移液枪，水涡锅，载玻 片，盖玻片，血细胞计数板，刻度试管， 刻度吸管，电炉，冷冻离心管，显微镜， 烧杯， 吸管
2.试剂：Alsever溶液，GKN溶液，0.85% 生理盐水，50%PEG ，蒸馏水
红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂， 即红细胞发生溶血.由于溶质透人速度不 同，溶血时间也不同。
实验用品
试剂：0.17 mol／L氯化钠，0.17 mol／L 氯化铵，0.17 mol／L硝酸钠，0.12 mol／ L硫酸 钠，0.12 mol／L草酸钠，0.12mol ／L醋酸钠， 0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，0.32mol ／L丙醇。 仪器：显微镜，载玻片，盖 玻片，吸管，小烧杯，试管，试管架
50％PEG混合液： 称取少许PEG(Mw 6000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加 热， 使其溶化，待冷却至50℃时，加入 预热至50℃ 的等体积的GKN液，混匀。 注意使用前配制。
实验方法
1.取新鲜的鸡血与Alsever溶液以1：4的 比例混匀，可在冰箱内存放一周（4℃）
2.取1ml贮存鸡血加入4ml0.85%生理盐水， 充分混匀800r/min,3min弃上清，重复离 心两次。
悬浮介质：通常用缓冲的蔗糖溶液，它 比较接近细胞质的分散相，在一定程度 上能够保持细胞器的结构和酶的活性。
詹纳斯活染：詹纳斯绿B是对线粒体专一 的、毒性很小的、活性染料，由于其碱 性，解离后
带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持 在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显 色，而细胞质中的染料被还原成无色。
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实验原理
脂质体常用类脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、胆固醇等制备。 其中最常用的是磷脂酰胆碱和胆固醇的 混合物。利用磷脂的双亲分子特性，加 入水相后形成囊状或液晶态，用超声波 处理，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分 子或分子团，并自动重新排布成类似生 物膜的双分子层囊泡。
实验用品
器材 超声波清洗机、光学显微镜、旋涡混合
凝集素（lectin）是一类含糖的（少数除 外）并能与糖专一结合的蛋白质，它能 具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用， 凝集素使细胞凝集是由于他与细胞表面 的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的 结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制 细胞的凝集。
实验用品
1、材料：土豆块茎 2、器材和仪器：显微镜，粗天平，载玻
0.85％生理盐水：0.85g氯化钠溶于 100mL重蒸水中。
ALsver液： 葡萄糖 2.05g , 枸橼酸钠 0.8g , NaCl 0.42 加蒸馏水至100ml
GKN液： NaCl 8g ，KCl 0.4g , N0.a629HgP, O葡4萄·2H糖2O2g1,苯.77酚g ，红 N0.a0H1g2P溶O于4·H2O 1000ml蒸馏水中
3.弃上清再加4mlGKN溶液离心，加GKN 液，制成细胞悬液。
4.取上述细胞悬液1ml与刻度试管中，用 血细胞计数板计数，用GKN液将其调整 为5×106个/ml
5.取上述细胞悬液1ml于另一刻度试管中， 放入37℃水浴中，浴热20min，PEG液也 浴热20min
6、20min后，将0.5ml 50%PEG液逐滴沿 管壁加入到1ml细胞悬液中，边加入边摇 匀，然后再放入37℃水浴中保温20min。
2、记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发 荧光和次生荧光现象，分析结果 。
实验五叶绿体的分离与观察
实验五叶绿体的分离与观察引言：叶绿体是植物和一些藻类细胞中的一种重要细胞器，其内含有叶绿素，参与光合作用，并且能够进行自我复制。
叶绿体的分离与观察可以帮助我们更好地理解叶绿体的结构和功能。
本实验旨在通过破碎叶绿体细胞壁和最后沉淀纯化，获得高纯度的叶绿体样品，并观察其形态和颜色。
材料与方法：1.植物叶片（如菠菜等）2.磨砂棒3.0.5MEDTA（乙二胺四乙酸二钠，含有金属离子螯合剂，可帮助破环细胞壁）4.磷酸盐缓冲液（PH=7.2）5.叶绿体离心管6.离心机7.色谱柱8.吲哚素（荧光指示剂）9.显微镜实验步骤：1.将大约10g的菠菜叶片放入研钵中，加入足够的磷酸盐缓冲液，用磨砂棒研磨，直至叶片完全破碎。
2.将研磨的混合物过筛，将过筛的悬浊液取出置于离心管中。
3.加入适量的0.5MEDTA溶液，溶液中EDTA的浓度约为0.3M，为了破坏细胞壁脱落细胞质中的叶绿体。
4. 将离心管放入离心机中，离心10分钟，以3000 rpm离心速度。
5.将上清液倒入新的离心管中。
6. 用磷酸盐缓冲液把上出来的树珪胶稀释为1 ml，用来测定叶绿素a含量，以叶绿素a含量/体积的值判断叶绿体的提纯程度。
7. 用离心机再一下离心10分钟，以5000 rpm离心速度，取出离心管，倒出上清液。
8.取少量草绿后的混合悬浊液加入色谱柱中，过滤，用于进行吲哚素荧光指示剂的观察和检测。
结果与讨论：通过实验操作，我们成功将叶绿体从菠菜叶片中分离出来，并获得了纯化程度较高的叶绿体样品。
在观察纯化后的叶绿体样品时，我们可以看到其呈现出绿色或草绿色。
这是因为叶绿体内含有大量的叶绿素，而叶绿素能够吸收光线中的蓝光和红光，反射绿光，因此使得叶绿体呈现出绿色。
此外，利用吲哚素荧光指示剂对叶绿体样品进行观察和检测，可以进一步确认我们所提取的物质是否为叶绿体。
吲哚素是一种常用的荧光指示剂，当其与叶绿体内的一些化合物结合时，会发出绿色荧光。
因此，如果我们在观察过程中观察到绿色荧光的出现，就可以确认叶绿体的存在。
实验二 密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光观察
轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml加入离心管，再取 15%蔗糖溶液0.4ml小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面 可见，制成密度梯度。
三、实验用品
1. 材料：新鲜菠菜叶 2. 器材：光学显微镜、台式高速冷冻离心机，
研钵、剪刀、托盘、玻皿等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L蔗糖、
0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液，pH7.4）（2） 50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶液。
四、实验步骤
1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、 主脉后，称取2~3g，剪碎置研钵中。
6. 加入0.4ml上清液，严格平衡离心管后，用 水平转头8000r/min离心，20min。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻 片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。另 取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观 察。（角转取中间靠壁的叶绿体）
五、作业
• 分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。 • 实验报告
实验二 密度梯度离心法 分离提纯叶绿体及叶绿体
荧光观察
一、实验目的
• 学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶 绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理
❖一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗 粒的大小、形状和密度，也同离心力以及 悬浮介质的粘度有关；
❖用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在 离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小 的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降 系数较大的细胞组分沉到离心管底部， 这样，可粗略地分离叶绿体。
叶
叶绿体的分离、纯化及荧光观察
叶绿体的分离、纯化及荧光观察科目细胞生物学实验姓名*** 系年级2011级生物基地学号***日期2013.05.16 同组者***叶绿体的分离、纯化及荧光观察【实验目的】1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
通过控制离心力和离心时间等因素，不同的细胞器可以通过阶梯离心的方式得到分离。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。
某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
实验一：叶绿体的提取和荧光观察
叶绿体的提取和荧光观察一、实验目的：1. 学习分离制备叶绿体的方法，了解制备细胞器的一般程序，观察光镜下叶绿体的形态。
2. 学习和掌握离心机的原理和基本使用方法。
3. 学习荧光显微镜的使用方法及其应用。
二、实验原理及分析：细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。
细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。
某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
三、实验材料：菠菜叶片四、实验步骤：1. 菠菜叶片洗净吸干。
称取20克，剪成小块；加入40ml完全介质，在研钵中充分研磨。
2.浆状物用双层纱布过滤；3. 汁液置于离心管中，1100 rpm(200g)离心5Min；4. 弃去沉淀，取上清液1900 rpm(600g)离心12Min；5. 弃去上清液，沉淀加入15ml A液，轻轻吹打悬浮；6. 悬浮液600g离心12Min；7. 弃去上清液，取沉淀，悬浮于A液中；8.普通光学显微镜下观察；9. 荧光显微镜下观察1〕荧光镜下紫外直接观察；2〕滴加吖啶橙后观察五、实验结果及分析：在普通显微镜下，叶绿体呈现出绿色椭球形，为正常结构。
可能因为差速离心得到的样品不纯，还观察到一些组织碎片。
实验五 叶绿体的分离
山东大学实验报告2013年3月12 日姓名李某某系年级同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离、纯化与荧光观察学号201100140000【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.叶绿体分离原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、差速离心特点：1.介质密度均一；2.速度由低到高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。
沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。
可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3、密度梯度离心密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
叶绿体的分离实验报告
叶绿体的分离实验报告叶绿体的分离实验报告引言：叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它具有自主复制的能力，并且在光合作用中起着重要的作用。
为了更好地了解叶绿体的结构和功能，我们进行了一系列的实验，其中包括叶绿体的分离实验。
本报告将详细介绍我们的实验步骤、结果和讨论。
实验步骤：1. 实验前准备：a. 准备一定量的新鲜叶片样本，最好选择绿色较浓的叶片。
b. 准备所需的实验器材，包括离心机、显微镜等。
c. 准备叶绿体分离液，可以使用含有蔗糖、EDTA和缓冲液的溶液。
2. 叶绿体的分离：a. 将新鲜叶片样本切碎，并加入适量的叶绿体分离液中。
b. 将混合液放入离心管中，进行离心。
离心的速度和时间可以根据实际情况进行调整。
c. 离心后，可以观察到离心管中的分层现象。
叶绿体通常会沉淀在离心管的底部。
d. 小心地将上层液体倒掉，留下叶绿体沉淀。
e. 加入适量的缓冲液，轻轻悬浮叶绿体沉淀，使其均匀分散。
3. 叶绿体的观察：a. 取一滴悬浮的叶绿体液滴在载玻片上，并盖上盖玻片。
b. 使用显微镜进行观察。
可以调节放大倍数，以便更清晰地观察叶绿体的结构。
c. 观察叶绿体的形态、颜色和大小等特征。
实验结果：通过以上实验步骤，我们成功地分离出了叶绿体，并观察到了其形态和结构。
1. 形态观察：a. 叶绿体呈现绿色或浅绿色，具有一定的透明度。
b. 叶绿体的形态多样，有些呈椭圆形，而有些则呈圆形或不规则形状。
c. 叶绿体的大小也有差异，一般直径在2-10微米之间。
2. 结构观察：a. 在显微镜下观察，可以看到叶绿体具有双层膜结构，外层膜与内层膜之间形成了叶绿体间隙。
b. 叶绿体内部含有一种绿色的色素，称为叶绿素。
叶绿素是进行光合作用的关键物质。
c. 叶绿体内还含有一系列光合作用所需的酶和蛋白质，这些物质协同工作，完成光合作用过程。
讨论：通过本次实验，我们成功地分离出了叶绿体，并观察到了其形态和结构。
叶绿体是植物细胞中的重要细胞器，它在光合作用中起着至关重要的作用。
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实验五叶绿体的分离与荧光观察
姓名：俞华军班级：09级生科3班学号：200900140157 时间：2011/04/15
一．实验目的
1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二．实验原理
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
三．实验仪器
1、器材：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、500ml烧杯2个，
250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，
无荧光载片和盖片各4片。
2、材料：新鲜菠菜。
3、试剂：0.35 mol／L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)。
四．实验方法
1．选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35 mol／L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。
2．利用组织捣碎机低速(5 000 r／min)匀浆3~5min。
3．将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4．取滤液4ml在1000 r／min下离心2 min。
弃去沉淀。
5．将上清液在3000 r／min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为p为叶绿体
(混有部分细胞核)。
6．将沉淀用0.35 mol／L NaCl溶液悬浮。
7．取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察；③取叶绿体悬液
一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙荧光染料，加无荧光
盖片后即可在荧光显微镜下观察。
五．实验结果
1. 实验结果图
图一普通显微镜中菠菜叶的叶绿体（10x40）图二普通显微镜中菠菜叶绿体局部放大图（10x40）图三荧光显微镜菠菜叶绿体（未染色）（10x40）图四荧光显微镜中菠菜叶的叶绿体（染色）（10x40）
2. 实验结果记录
1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部
含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2. 以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片、B双色镜和0ss。
(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光（图三）。
3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光（图四），而其中混有的细胞
核则发绿色荧光。
六．实验分析
1. 差速离心时要控制号速度和时间，否则会影响最后的叶绿体的观察，甚至可能无法分离出叶绿体；
2. 差速离心只能得到80%纯度的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心法；
3. 差速离心分离出叶绿体时，其中没含有部分细胞核碎片，在荧光下时要注意观察，不要看错；
4．要注意使用荧光显微镜的方法和操作，切勿弄错步骤，否则会损坏仪器。