微生物多酚氧化酶研究进展
微波处理对全麦粉及全麦生鲜面中PPO和微生物的抑制研究
中国粮油学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｃ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ Ｏｉ ｌ ｓ Ａｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｖｏ １ ． ２ ９． Ｎｏ ． ３ Ｍａ ｒ ． ２ ０１ ４
冻 离心 机 ： 日本 Ｈｉ ｔ ａ ｃ ｈ ｉ Ｋ ｏ ｋ ｉ 公司 ； Ｕ Ｖ一 ２ ８ ０ ０型紫 外
３ ４ Ｂ ０ １ ） 收稿 日期 ： ２ ０ １ ３一 Ｏ ５—２ ６
Ｋ ｉ ｔ ｃ ｈ ｅ ｎ Ａ ｉ ｄ小 型和面 机 ： 英国Ｋ ｉ ｔ ｃ ｈ ｅ ｎ Ａ ｉ ｄ公 司 ；
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喜树植物内生真菌
abstract亚氯酸钠（SC）是众所周知的微生物抑制剂，最近对鲜切产品的酶促褐变抑制作用强。
我们调查了SC对多酚氧化酶（PPO）及其底物，绿原酸（CA）的影响，因为与酶促褐变抑制的机制有关。
结果表明，PPO催化的CA（1.0mM）的褐变反应（33U /mL）在pH 4.6下被1.0mM SC显着抑制。
通过天然聚丙烯酰胺鉴定了两种PPO同种型凝胶电泳，两者都被SC（3.0mM）灭活。
这表明SC作为一种PPO抑制剂以防止酶促褐变。
此外UV-Vis扫描和LC-MS分析，也研究了SC对CA的稳定性在酸性（pH 4.5）和碱性条件（pH 8.3）的影响。
结果表明，在SC（3.0mM）存在下，CA（0.1mM）降解为奎尼酸和咖啡酸以及其他中间体。
因此，SC的抗褐变性可归因于两个作用方式：直接灭活多酚氧化酶和氧化降解酚类底物。
1.Introduction酶促褐变是广泛发生在水果，蔬菜和茶叶的色彩反应。
褐变反应需要氧，酚类化合物和多酚氧化酶（PPO），通常由酶催化将单酚氧化成邻二酚和邻二酚醌，其进行进一步的非酶聚合导致褐色的形成。
虽然酶促褐变有利于某些食物的颜色和味道的形成，例如茶，咖啡和可可等物品，但是会损害各种鲜切水果和蔬菜的品质和销售，如莴苣，马铃薯，苹果，梨，香蕉和桃，在加工过程中易于发生酶促褐变。
广泛的研究专注于通过瞄准来控制褐变PPO，底物（氧和酚）或最终产物褐变反应。
基于工作机制，褐变抑制剂可以分为六组，包括还原药剂，酸化剂，螯合剂，络合剂，酶处理和酶抑制剂。
在所有测试的抑制剂中，还原剂，例如抗坏血酸酸及其衍生物，半胱氨酸和谷胱甘肽有效控制褐变，并且抗坏血酸钙配方已在鲜切苹果产业广泛应用。
与目前使用的还原剂比较的主要缺点是那些还原剂通常与被广泛应用于鲜切行业、以防病原体污染的消毒剂不相容，因为大多数消毒剂如氯，臭氧和二氧化氯本质上是具有氧化性的。
由于褐变控制解决方案经常是从一批到一批苹果重复使用，缺乏适当的消毒处理可能会导致潜在的食源性人类病原体引起污染。
蒲菜的保鲜和加工研究进展
蒲菜的保鲜和加工研究进展田其英【摘要】The respiration,PPO activity and the fibrin course of Typha latifolia after picking,the preservation technique effect on living Typha latifolia including temperature,controlled atmosphere,coating and chemical reagent,as well as the research results of product processing technology of Typha latifolia were summarized in this article.Then the characteristic of a variety of different preservation technique was contrastd and analyzed ,the development trend about preservation and processing technique of Typha latifolia has been looked forward to.%本文归纳总结了蒲菜采后呼吸作用、多酚氧化酶（PPO）活性和纤维化进程，温度、气调、涂膜、化学保鲜技术在蒲菜保鲜中的应用效果以及蒲菜产品加工技术研究成果，并对比分析了各种保鲜技术的特点，展望了蒲菜保鲜和加工技术发展趋势。
【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2014(000)022【总页数】4页(P128-131)【关键词】蒲菜;多酚氧化酶;加工;保鲜技术【作者】田其英【作者单位】江苏食品药品职业技术学院江苏淮安 223003【正文语种】中文蒲菜是多年生宿根草本水生菜类，属于香蒲科香蒲属，世界各地均有分布，唯我国作为蔬菜食用，产地主要有云南建水、云南元谋、江苏淮安和山东济南的大明湖。
酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展
2021年2月Feb.2021第41卷第2期Vol.41,No.2热带农业科学CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展武珊珊1)丁其欢1)周雪芳2)马占霞1)杨雪梅1)邵宛芳1)苏建美1)(1滇西应用技术大学普洱茶学院云南省普洱市665000;2云南省绿色食品发展中心云南省昆明市650000)摘要综述近年来不同酶工程技术，如酶的化学修饰、固定化酶技术、生物酶传感器等在茶叶中天然酶的获取、各类茶的初加工、茶叶的深加工及茶叶检测等方面的国内外应用研究成果，并对酶工程技术在茶叶方面的应用发展前景进行展望。
关键词酶工程技术；茶叶初加工；茶叶深加工；茶叶检测；茶叶保鲜中图分类号S188+.3文献标识码ADOI ：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.02.019Application of Enzymes in Tea PreparationWU Shanshan 1)DING Qihuan 1)ZHOU Xuefang 2)MA Zhanxia 1)YANG Xuemei 1)SHAO Wanfang 1)SU Jianmei 1)(1College of Tea,West Yunnan University of Applied Sciences,Pu'er,Yunnan 665000,China;2Yunnan Green Food Development Center,Kunming,Yunnan 650000,China)Abstract The recent researches in application of enzymes in preparation of teas,such as tea natural enzyme extraction,tea preliminary processing and deep processing and tea detection were reviewed,based on which an outlook for application of enzymes in tea preparation in the future is put forward.Keywords enzyme ;tea preliminary processing ;tea deep processing ;tea detection ;preservation of tea酶工程是于1971年第一届国际酶工程会议上首次命名的一项技术，即将酶学基本原理与化学工程技术及基因工程有机结合形成的新型应用技术，是基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程以外的现代五大生物工程技术之一，主要研究酶的生产纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰与改造等，在工农业、医药卫生等领域广泛应用。
水杨酸的抑酶与抑菌作用
水杨酸的抑酶与抑菌作用郑国兴，张春乐，黄浩，张丽娟，林敏，陈清西*（教育部细胞生物学与肿瘤细胞工程重点实验室，厦门大学生命科学学院，福建厦门361005）摘要：以水杨酸为效应物，研究其酶学效应和微生物效应．实验结果表明：水杨酸对马铃薯多酚氧化酶有明显的抑制作用，半抑制率（IC50）为2.05 mmol/L，抑制作用表现为非竞争性的可逆过程，其抑制常数为2.00 mmol/L．水杨酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种细菌和白色假丝酵母、黑曲霉两种真菌均有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度（MIC）分别为0.75、0.5、0.5、0.25和0.75 mg/mL，最小杀菌浓度（MBC）分别为0.75、1.0、0.5、0.25和0.75 mg/mL．本研究为水杨酸在果蔬保鲜中的应用提供实验理论依据．关键词：水杨酸；马铃薯多酚氧化酶；细菌；真菌；抑制作用中图分类号：Q 356．1 文献标识码：A我国果蔬、蔬菜资源丰富，产量均居世界第一位．然而，因采后处理技术落后，我国果蔬腐烂损失也高居全球榜首，每年因贮藏、运输当中变质的果蔬占总产量的1/7，造成巨大的经济损失．导致果蔬腐烂变质主要有微生物感染和酶促褐变两种[1~3]．其中，引起果蔬腐败的微生物主要有细菌、杆……1 材料与方法1.1 材料水杨酸、KCrO4、庆大霉素均为国产分析纯试剂[1~3]．马铃薯多酚氧化酶由本实验室制备．L-3,4-二羟基苯氨酸（L-DOPA）为Aldrich化学公司产品．大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉均由厦门大学生命科学学院微生物教研室提供……1.2方法（1）PPO活力测定参考文献[4]方法，在50 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.8）中，以0.5 mmol/L L-DOPA为底物，30℃下测定波长为475 nm的光密度值（OD475）随时间的增长直线，从斜率计算酶的活力，产物的消光系数按3700 L/(mol cm)计算[5]．……（2）微生物实验抑菌实验：采用琼脂渗透法，在已经培养好的斜面培养物中分别加无菌生理盐水5 mL，用接种环刮下菌苔制成菌悬液，分别取菌悬液1 mL加到已融化又冷却至适当温度的100 mL……收稿日期：2005-12-22基金项目：福建省科技攻关课题（2004N002）和国家自然科学基金（30570408）资助作者简介：郑国兴(1978 ~ )，男，硕士研究生．*通讯作者：chenqx@2 实验结果2.1 水杨酸对马铃薯PPO 抑制效应研究水杨酸对马铃薯PPO 抑制作用类型，在测活体系中，固定酶的浓度，改变底物L-DOPA 浓度，测定不同浓度抑制剂对酶的活力的影响．由Lineweaver-Burk 双倒数作图得到一组横轴截距不变的直线，说明这一组抑制剂不影响米氏常数(K m )，只影响最大反应速度(V m )，其抑制机理表现为非竞争性类型，以不同浓度抑制剂下测定的1/V m 对抑制剂浓度作图(图1内插图)为一条直线，从直线的斜率可以求得抑制常数(K I =K IS )为2.00 mmol/L ．表1. 琼脂渗透法测定结果Tab.1 The assay result of the agar diffusion method效应物 浓度 E. coli B. subtilisSt. aureusC. albicansA. niger DMSO ≥99.0％ − − − − − 庆大霉素 80 U/mL 22 20(±) 25 − − KCrO 4 1 mg/mL − − − 14(±) 16(±) 水杨酸 40 18 15 22 12 12注：“±”表示抑菌圈模糊，“−”表示无抑菌圈．3 讨 论……本文研究结果表明，水杨酸对于马铃薯PPO 具有明显的抑制作用，它对该酶的活力表现为可逆非竞争性抑制作用．这说明抑制剂与酶分子的结合及底物分子与酶的结合是相互独立的，抑制剂不改变酶对底物的亲和力；抑制剂可以同时与游离酶(E)和结合酶(ES)结合，且结合常数相同．这也说明了水杨酸在酶分子上的结合位点并不在活性中心，而是活性中心以外的区域．因此，水杨酸作为马铃薯PPO 的强效抑制剂，可望成为除抑菌功效外，同时能够防止果蔬产生酶促褐变的保鲜剂．参考文献：[1]王成云．葱头腐烂的原因及防治对策[J]．北方园艺，2002，34（4）：68－69．[2]Alvarez A M．Postharvest Diseases of Papaya[C] ．New York, Springer Press,1987：123－125．[3]陈清西, 柯莉娜，王勤，等．联苯基甲醛与联苯基甲酸[M]．厦门：厦门大学出版社，2004．[4]黄璜，刘晓丹，陈清西．苯甲醛族化合物抑制蘑菇多酚氧化酶活力[D] ．厦门：厦门大学，2003．……Effect of Salicylic Acid on Potato PPO andSome MicrobeZHENG Guo-xing, ZHANG Chun-le, HUANG Hao,ZHANG Li-juan, LIN Min, CHEN Qing-xi*(Key laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering,School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005,China)Abstract:Used salicylic acid as the inhibitor, we studied its inhibitory effect on the activity of potato polyphenoloxidase (PPO) and some bacteria and fungi. Salicylic acid could obviously inhibit the PPO activity and the inhibitor concentration leading to 50% activity lost (IC50) was determined to be 2.05 mmol/L. The inhibition mechanism of salicylic acid belonged to a noncompetitive reversible reaction, and the constant of inhibition (K I) was 2.00 mmol/L. The inhibition of salicylic acid on some bacteria such as E .coli, S. aureus and B. subtilis and some fungi such as C. albicans and A. niger has been studied. The values of MIC were determined to be 0.75, 0.5, 0.5, 0.25 and 0.75 mg/mL, respectively, and the values of MBC were 0.75, 1.0, 0.5, 0.25 and 0.75 mg/mL, respectively. This study gave theoretical support for salicylic acid used as food preservative agent.Key words: salicylic acid; potato PPO; bacterium; fungi; inhibition。
采后桃果实酶促褐变机理的研究进展
2021 年第 13 期
现代园艺
试验研究
发生跟 PPO、POD 的活性及底物的酶促氧化存在着密 切的关系。 2 酚类褐变底物鉴定
果实体内酚类物质种类众多且含量丰富。目前，关 于酚类物质作为果实 PPO 酶促褐变底物出现了较多 的报道。Sun 等[16-17]发现，表儿茶素、表没食子儿茶素、 原花青素 A2 的含量随荔枝褐变程度的加深呈现出下 降的趋势，参与荔枝果皮褐变，但一直未能确定参与褐 变的关键酶。Song 等[18]发现，苹果中儿茶素、表儿茶素、 原花色素类的含量随着褐变指数的增加呈下降的趋 势，与 PPO 催化氧化导致的褐变存在着密切的关系。 本课题组发现漆酶是荔枝果皮褐变的关键酶，其最适 底物为表儿茶素，参与荔枝果皮花色素苷的降解过程。 漆酶对花色苷降解的依赖于底物表儿茶素的特性，表 明是一个花色素苷降解酶 /LAC- 表儿茶素偶联氧化 模型。表儿茶素和花色素苷的含量随着荔枝褐变指数 的增加呈现出下降的趋势，证实了这个模型。免疫金标 记透射电镜表明，ADE/LAC 定位于液泡中，富含丰富 的酚类物质。漆酶在荔枝褐变严重的果皮中表达量高， 通过表儿茶素介导导致花色素苷的降解，从而积累褐 色物质，导致果皮褐变[19]。本课题组还发现，表儿茶素、 绿原酸随苹果虎皮病褐变的严重其含量减少，可作为 苹果漆酶的底物参与褐变的发生[20]。目前，已有少量关 于绿原酸、儿茶酚和表儿茶素可作为底物参与果肉褐 变的发生进程的报道[21]。因此，进一步加强采后桃果肉 褐变底物的种类及化学结构的研究，有助于全面阐明 桃果肉褐变的机理。 3 贮藏期间酚类底物含量的变化
果实褐变机理进行了全面深入的研究。普遍认为 PPO
和 POD 在采后果实酶促褐变中起着关键作用。酚 - 酚
酶的区域化分布学说受到学术界的普遍认可，该学说
浅谈食品中多酚氧化酶与酶促褐变的控制
浅谈食品中多酚氧化酶与酶促褐变的控制摘要：多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase, PPO）是一类广泛分布于植物体中，由核基因编码，能与铜相结合的一种金属蛋白酶。
植物多酚氧化酶是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因，对农产品食品品质有重要影响。
本文概述了多酚氧化酶的分布、分子结构及活性诱导特点，PPO与酶促褐变的关系及对食品的影响，介绍了食品工业生产中酶促褐变的抑制方法，并展望了今后PPO及酶促褐变的研究方向，以对食品中PPO及在酶促褐变中的应用作浅析。
关键词：食品；多酚氧化酶；酶促褐变；控制1 前言多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO) 是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。
它早在1895 年就被发现，直至1937 年才被分离得到。
随着研究的深入，将其分为单酚单氧化酶（酪氨酸酶(tyrosinase) ,EC. 1. 14. 18. 1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶(catechol oxidase) , EC. 1. 10. 3. 2）、漆酶（laccase , EC. 1.10. 3. 1）[1,2]。
现在所说的多酚氧化酶一般是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
食品在贮藏加工过程中，经常会发生褐变现象，其中以酶引起的褐变作用非常迅速，酶促褐变需要和氧接触，由酶催化，故称之为酶促褐变。
这是由于水果、蔬菜等新鲜植物食物在采摘后，组织中仍在进行活跃的代谢活动。
在正常情况下，完整的果蔬组织中氧化还原反应是偶联进行的，但当发生机械性的损伤（如削皮、切开、压伤、虫咬、磨浆等）及处于异常的环境条件下（如受冻、受热）时，便会影响氧化还原作用的平衡，发生氧化产物的积累，造成变色。
大多数情况下，酶促褐变是一种不希望出现于食物中的变化，如香蕉、苹果、梨、马铃薯等园艺产品均很容易在削皮切开后褐变，不仅有损于感观，且影响产品的运销，还可使产品的营养价值降低。
另一方面，适当的褐变又是形成如茶叶、可可豆、某些干果等食品良好风味与色泽所不可缺少的。
9多酚氧化酶,过氧化物酶,脂肪氧合酶
化学方法 含硫氨基酸
含巯基氨基酸如半胱氨酸通过与醌类物质 反应形成无色稳定化合物也能阻止黑色素 的形成,用在土豆、苹果、莴苣等切分果蔬 的褐变抑制上.
它也成为一些防褐变的商业产品的主要活 性成分之一.若能与柠檬酸联合(如 0.5%L2cys+2%柠檬酸)则效果更佳
酶法 蛋白酶
有人发现蛋白酶对土豆和苹果切片的褐变有较好 的抑制作用.
我们讨论第一种酶，PPO这个缩写指的就是第一种
二、多酚氧化酶在自然界的分布
含量随品种不同，橄榄中活力最高.
分布取决于品种和年龄及成熟度.
在果蔬的不同部分的含量差别很大.
分结合的(bound)和可溶性(soluble)的两类，其比 例随果蔬的成熟度而变.
品种
桃 甜樱桃 杏子 苹果
可溶态的PPO占总酶活力的百分数
从理论上讲,果蔬的多酚氧化酶引起的酶促 褐变可以通过加热钝化酶、去除一个或几 个 PP底O物抑(制O2剂和或多黑酚色类素物形质成)、的降抑低制p剂H、等添方加法 来加以控制。目前已知的PPO抑制剂有很 多种, 但真正有潜力能替代亚硫酸盐的不多。
天然方法: 如利用色拉酱的几种成分进行互 相抑制.如菠萝汁对苹果切片的酶促褐变有 很好的抑制作用;蜂蜜中分子量大于600的 某些多肽对白葡萄及一些水果切片的PPO 酶有很好的抑制作用.
1）相互作用生成高分子量聚合物； 2）与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物；
这两个非酶反应导致褐色素的生成；色素的分子量 愈高，颜色愈暗。
此外邻醌也可 3）氧化那些氧化-还原电位较低的化合物，形成 无色的产物。
黑色素的形成
Formation of melanins from tyrosine
二、PPO的底物
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微生物多酚
氧
化酶研究进展
赵淑娟王冲波傅冬和(湖南农业大学园艺园林学院多酚氧化酶(PolyphenolOxideasPO)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醒类物质在茶儿茶素氧化形成茶黄素的过程中多酚氧化酶与过氧化物酶(POD)起着非常重要的作用尤其是多酚氧化酶总活性是茶黄素形成的主要制约因子随着微生物研究领域的发展研究人员在许多微生物中发现含有多酚氧化酶并已利用其进行了含酚废水处理木质素降解以及染料脱色等领域的研究在合成茶黄素方面也进行了相关的尝试本文对微生物中多酚氧化酶的种类性质及微生物生产多酚氧化酶的条件等方面的研究进行综述旨在为筛选合成茶黄素的有效菌种提供理论依据一微生物多酚氧化酶的种类多酚氧化酶是自然界中分布极广的一种氧化还原酶普遍存在于植物真菌昆虫的质体中甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的酿在广义上多酚氧化酶可分为三大类:酪氨酸酶(Ec114181肠orsinase)儿茶酚酶(EC11031Cateeholoxidase)和漆酶(EC11032加case)在这三大类多酚氧化酶中儿茶酚酶主要分布在植物中微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶1微生物漆酶漆酶是三大类多酚氧化酶中作用底物最广的一类漆酶最早是在1883年由Yoshida首先从漆树液中发现的后来人们又从大量的真菌体中发现了漆酶漆酶来源很多结构各异不同来源的漆酶表现出来的催化特性相差较大即便是同一来源如同一白腐菌菌种也可分泌出不同性质的漆酶组分包括氧化能力最适pH底物专一性等因此催化氧化作用也各不相同漆酶是一种典型含铜糖蛋白具有特征性吸收光谱通常认为每个漆酶蛋白分子中含有4个铜离子分属于3类其中I型l个n型1个nI型2个漆酶分子中的铜离子是漆酶催化反应的活性中心在催化氧化过程中起决定作用漆酶的催化氧化反应需要氧气的参与其机理主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4个铜离子的协同作用当漆酶催化酚类(如氢醒)氧化时首先是底物氢醒向漆酶转移1个电子生成半醒—氧自由基中间体用ESR可观察到明显的自由基信号其次是不均等非酶反应2分子半醒生成1分子对苯醒和1分子氢醒氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体它们可以自身结合或相互偶联产物李园莉雷玉国李勤教育部茶学重点实验室410128)中除醒外还有聚合物和C一OC一C偶联产物在氧气的存在
下还原态漆酶被氧化氧气被还原成水漆酶催化底物氧化和对氧气的还原是通过4个铜离子协同地传递电子和价态变化实现的在真菌中漆酶大多分布在担子菌(Basiidmcyetes)
多
孔菌(oP加。二)子囊菌(Aoom少亡etes)脉抱菌(Neuor印oar)柄抱壳菌(oP一dosPoar)和曲霉菌
(A、eP哪u。)等真菌中担子菌中的白腐菌是目前获得漆酶
的主要来源iGvaudan等还从稻根上的生脂固
氮螺菌
(注:05户iirzzumziPoferum)中分离出细菌漆酶
黄乾明等以粗毛栓菌门h切王。t。列iloa)为出发菌通
过紫外诱变处理其担抱子PDA一RBBR平板变色法初筛ABST〔2,2一边氮基一双(3一乙基苯并唾毗咯琳一6一磺
酸)
〕
法测定培养液漆酶酶活力复筛获得1株漆酶高产诱变菌株SAH一12
黄俊等(206)从森林树木根部土壤中分离得到1株具
有漆酶活性的细菌菌株并鉴定该细菌属于克雷伯氏菌(`le占siella)属命名其为Klo6、iellasp一601这是首例报道lK。阮iclla细菌具有漆酶活性
另外在国外还有很多菌种的漆酶基因得到了克隆并
且
进行了分析和鉴定包括粗毛云芝(Coirolushiout。)云
芝
(升丈训eet、:。。icolo:)射脉菌(hPleibandri以a)长绒毛栓
菌(Zh训巴ets:流此a)未红密孔菌(乃
二
noP
~
。inrzbz二nus)糙皮侧耳(瓜uortoosetratus)灰盖鬼
伞
(oCPirn。。i、er。)脉胞菌(Ne“or`poarc心sa)构巢
曲霉
(A切e哪10nidul*)和立枯丝核菌(尺h众oetoni
a、o
l
an
i
)
等2微生物酪氨酸酶
酪氨酸酶又叫单酚氧化酶它可以氧化L一酪氨酸合成L一多巴和黑色素在高等动物和人类中酪氨酸酶的活性高
低与黑色素的形成速率有关缺乏此酶活性将引起白化病对酪氨酸酶的光谱研究表明它的活性中心有2个Cu+2
能与周围的氮原子和氧原子形成3种不同的形态分
别为铜离子态(Emet)氧一铜离子态(Eoxy)和亚铜离子态
(Edeoxy)人们最早研究的酪氨酸酶基本功能有两个:一是
作为单酚酶使单酚及其衍生物邻位经基化生成邻二酚及其衍生物;二是作为双酚酶氧化邻二酚及其衍生物生成相应的
醒其催化机理如图1所
示
有报道说一种假单胞菌(乃。udomonosP)具有高产酪氨酸酶的能力另一种细菌即弗氏柠檬杆菌(
iC占orbac
t。;
介udni)在L一酪氨酸诱导下能高效表达酪氨酸酶的催化活
性经小试试验可获得L一多巴产量.9sg/L为其中试生产奠
定了基础图1酪氨酸酶催化酚类化合物氧化的机理蔡信之等分离并鉴定出嗜麦芽假单胞菌Pss以tP1能够稳定地产生酪氨酸酶并催化产生黑色素他们已将该菌的酪氨酸酶基因(mel)片断克隆到.Ecoil质粒载体pUC18上构建了产生黑色素的工程菌.Ecoli/pwSYUfangRuan(2以)4)首次发现苏云金芽抱杆菌高温诱导产黑色素的新现象并进一步发现该黑色素的产生也是经酪氨酸酶氧化酪氨酸途径产生的目前报道能产生黑色素的细菌有eA~A么超肋石`etrj巧℃砧二份~icM,,cus撇边出汤哪otmy(二e、V访而R入众。bilun和hse~阮酪氨酸酶催化合成黑色素是s加,otnlcye、属的典型特点此特点已被视为其分类的依据二微生物生产多酚氧化酶的条件杨建明等对木耳属中3个种27个菌株产生过氧化物酶和漆酶的能力进行筛选后得到一漆酶高产菌株毛木耳(Auicrulariapo尔成ha)A4P并对A4P产生漆酶的发酵条件进行了初步研究最佳培养基为:碳源梭甲基纤维素(CMC)59/L氮源NH洲03+L一天冬酞胺(L一sp毋久多ne)24mmol/L培养基的初始pH值为.40培养温度25℃邵强等对筛选到的一株高漆酶合成的白腐真菌进行了碳源和氮源的利用研究结果表明其漆酶合成的最适碳源为葡萄糖最适氮源为酵母浸出汁碳氮源的最佳组成为:葡萄糖109L/酵母浸出汁79/oL王戈林等研究了表达酪氨酸酶的基因工程菌(云C成WYS)产黑色素的条件WYB能在酪素平板上产生可溶性黑色素在添加酪氨酸的液体比培养基中的黑色素产率是基因来源菌—尸sel以omDnasmalt叩hil她的5倍并对摇瓶装量菌龄底物浓度发酵温度和pH等因素的影响作了进一步探讨发现培养基中高浓度的优良氮源—蛋白陈对发酵产黑色素非常有利这一方面是因为工程菌不仅要合成自身的各种蛋白质与酶还要大量合成酪氨酸酶对氮源的需求大为增加;另一方面葡萄糖作为碳源浓度高于.05%时工程
菌就不能产生黑色素可能是葡萄糖对合成酪氨酸酶有很
强的阻遏作用或是高浓度的葡萄糖存在时细菌生长速率过高导致携有酪氨酸酶基因的重组质粒分离不稳定而丢失尸爪日翻,ihl记对碳氮源的要求恰恰相反说明酪氨酸酶
基
因转人大肠杆菌后由于所处遗传环境的变化产酶的营养要求有了很大改变在wF发酵培养基中在适宜的发酵条件下工程菌有l6mg/mL的黑色素产率酪氨酸酶是黑色素产生的关键酶黑色素的产率直接显示了酪氨酸酶的合成情况
宁华用正交试验优化了基因工程菌(EcoilP/wsy
)
产黑色素培养基的组成配方为:蛋白陈1%葡萄糖.02%硫酸钱.05%磷酸氢二钾.07%磷酸二氢钾.03%氯化钠.05%硫酸镁.001%
上述研究为实现微生物发酵法大规模
生产黑色素提供了重要数据
利用微生物生产多酚氧化酶一般都是通过微生物发酵让菌株在利于其产酶的碳源氮源pH值温度等环境条件下予以适当诱导使其分泌多酚氧化酶微生物发酵法有易培养繁殖快易诱导在短时间内能廉价地生产多酚氧化酶的特点这使有效利用多酚氧化酶成为可能刘尚旭等对糙皮侧耳(凡“orooser二)xA3菌的漆酶产生条件进行了研究结果发现该菌漆酶产量较高的条件是:培养温度25℃培养基pH二.55每升含C.02529N.00219;加人.005%一0or%的吐温可提高漆酶酶活12倍王宜磊研究了碳源氮源愈创木酚香兰素及培养条件对漆酶分泌的影响结果表明麦草粉作碳源(NH;)多04作氮源有利于漆酶的分泌;适宜浓度的愈创木酚和香兰素等对漆酶的产生有一定的作用;pH在.30一8.0的范围内变动时对漆酶的分泌影响不大;培养温度接种量通气量对漆酶的分泌有较大影响分泌漆酶的最适pH值为.40最适反应温度为30℃Kzn,Cu,可激活漆酶而AgFe,CI则抑制漆酶活性三、微生物多酚氧化酶的性质1微生物漆酶的性质
漆酶在微生物中分布非常广泛因此研究者们对多种
不
同菌种合成的漆酶的性质做了比较全面的研究杨建明对毛木耳AuicruliarapolrticrhaA4P的粗酶液
进行PAGE电泳后发现含有3种漆酶同工酶并且通过运
用NativeSDS一以GE获得3种漆酶的分子量大小分别约为:LaeA(110kD)aLeB(84kD)LaeC(65kD)重点研究了LacB漆酶得到其反应的最适温度为30℃最适pH为
30此酶氧化ABST的Km值为664xl0巧mmol/L金属离子
对酶活的影响很大其中Ca,Mg,ZnZNaAg对漆酶LaeB有明显的激活作用;Co,Hg,Fe,Fe,BaZ
等对酶活
有明显的抑制作用LacB和其他真菌漆酶一样具有底
物专
一性不强的特点并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用