双特异性单链抗体BiTE的研究进展
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7一、本文概述本文旨在利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter Assay）来验证过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）是否直接靶向调控肌球蛋白重链7（MYH7）基因。
PPAR2作为一种核受体，在多种生物学过程中发挥着关键作用，包括脂肪代谢、炎症反应和细胞分化等。
MYH7，作为肌球蛋白家族的一员，主要参与肌肉收缩和细胞骨架组成，其表达调控对于肌肉发育和功能至关重要。
因此，探究PPAR2是否通过直接结合MYH7基因启动子区域来调控其表达，对于理解PPAR2在肌肉生物学中的作用具有重要意义。
本文首先利用ChIP-seq技术，通过高通量的方法寻找PPAR2在体内结合的DNA序列，从而确定MYH7基因是否为其潜在的靶向基因。
在此基础上，通过构建包含MYH7基因启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，利用荧光素酶活性的变化来反映PPAR2对MYH7启动子的转录激活作用。
这种方法结合了染色质免疫沉淀的高特异性和荧光素酶报告基因技术的高灵敏度，为验证PPAR2对MYH7的靶向调控提供了强有力的实验手段。
通过本文的研究，我们期望能够明确PPAR2是否直接调控MYH7基因的表达，揭示这一调控过程的具体分子机制，并为进一步理解PPAR2在肌肉生物学中的功能提供新的线索。
二、材料与方法1 细胞系：使用人源细胞系，例如HEK293T细胞，用于后续的ChIP-seq和双荧光素酶报告基因实验。
2 ChIP-seq试剂：染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒、蛋白酶抑制剂、DNA纯化试剂盒、DNA片段化酶、测序引物等。
3 双荧光素酶报告基因系统：包含PPAR2反应元件（PPRE）的荧光素酶报告质粒，以及用于转染细胞的荧光素酶底物。
4 PPAR2特异性抗体：用于ChIP实验的PPAR2转录因子特异性抗体。
双特异性抗体与抗体融合蛋白ppt课件
11
构建策略
双特异性抗体的构建方法
杂化杂交瘤技术
将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的McAb 细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白） 的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交 瘤细胞株的二价瘤体。
Immunology
12
杂化杂交瘤技术产生的双特异性抗体
Immunology
13
杂化杂交瘤分泌的抗体形式
一个结合治疗靶标，另一个指向体 内效应细胞 吞噬细胞/APC FcγR、CR
Immunology
9
构建策略
双特异性抗体的靶标
一个结合治疗靶标，另一个指向体 内效应细胞 NK细胞 FcγR、CD56
Immunology
10
双特异性抗体的效应靶
效应细胞 T细胞
NK细胞
靶分子
TCR/CD3,CD2
14
只有L1H1-H2L2才是所需的双特异性抗体
Immunology
15
杂化杂交瘤方法的不足
产量低，仅占10% 产物需筛选，费时费力 瘤株不稳定
Immunology
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构建策略
双特异性抗体的构建方法
化学交联法
Nisonoff和Rivers最早开始研究 化学交联无需经过细胞融合，比较简便易行。 通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原 和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结 合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等， 把两个抗体半分子交联在一起。
双特异性抗体与抗体融合蛋 白
2
双特异性抗体
概述 构建策略 应用
Immunology
3
概述
双特异性抗体：
全球新型抗肿瘤药物研发进展及趋势
全球新型抗肿瘤药物研发进展及趋势作者：李积宗张博文方淑蓓韩佳毛开云江洪波陈大明来源：《上海医药》2022年第25期李积宗，中共党员﹑高级工程师，上海市生物医药科技发展中心主任、上海医药行业协会副会长，长期从事生物医药领域科研项目管理、科技成果转化和软课题研究等工作，牵头建设运行上海市生物医药研发与转化功能型平台，熟悉上海生物医药科技创新政策，具有丰富的项目管理和成果转化经验。
通信作者：陈大明，研究员，长期从事生物医药等领域的科技情报研究，创新了基于关联索引的情报研究新方法，揭示了多学科交叉融合演进的范式，构建了用于专利价值和成果转化的评估框架，在软科学研究、知识产权分析、产业情报研究等方面带领团队完成了数十项研究课题，有力支撑了多种决策。
摘要：新型抗肿瘤药物已成功用于规避常规策略的某些局限性，同时提供更高的敏感性和特异性、更高的生物利用度和改善的综合治疗效果。
本文总结了过去70年的抗肿瘤药物开发里程碑，综述了基于肿瘤标志性特征的14类抗肿瘤药物开发路径，并且从多学科交叉融合的视角探索了抗肿瘤药物开发中的前景。
关键词：抗肿瘤药物多学科研究中图分类号：R979.1文献标志码：A文章编号：1006-1533（2022）S2-0001-o8引用本文李积宗，张博文，方淑蓓，等.全球新型抗肿瘤药物研发进展及趋势[J.上海医药，2022，43（S2）：1-8.Noval anti-tumor drugs： global advances and trendsLlJizong' ， ZHANG Bowen'， FANG Shubei' ，HAN Jia'， MAO Kaiyun'，JIANG Hongbo ， CHEN Daming（ 1.Shanghai Center of Biomedicine Development，Shanghai 201203，China; 2. Shanghai lnformation Center for LifeSciences，Shanghai Institute of Nutrition and Health， Chinese Academy of Sciences ，Shanghai 200031 ， China）ABSTRACT Noval anti-tumor drugs have been successfully employed to circumvent certain limitations of conventionalstrategies while providing higher sensitivity and specificity，greater bioavailability， and improved comprehensive effects fortherapeutic outcomes. This paper summarized anti-tumor drug development milestones in the past seven decades，reviewed anti-tumor drug based therapies accroding to 14 different targeting approaches， and discussed the imperative role of multidisciplinaryresearches that could drive anti-tumor drug developments.KEY WORDS anti-tumor ; drug; multidisciplinary research過去数十年来，全球肿瘤治疗巨大需求的拉动力、多种技术融合创新的驱动力，共同推动了全球抗肿瘤药物研发的快速发展。
肿瘤靶向治疗抗体研究进展
・０ ８５・
综 述 ・ 座 讲
肿 瘤 靶 向 治 疗 抗 体 研 究 进 展
刘杜 先 ， 王 丽， 陈 胡 ， 奇婵 ， 胡 杨举 伦
文献标识码 Ａ ｄ ｉ１ ．９ ９ ｊｉ ｎ １０ ０ ８ ． ００ ０ ．５ ｏ ：０ ３６ ／．ｓ ．０４— １８ ２ １ ．７ ０２ ｓ
ｓＦ 的 亲 和力 及 抗 原 结 合 活 性 与亲 本 单 抗 相 差 无 几 。 ｃｖ １ ２ ３ 二硫 键 稳 定 的 Ｆ （ ｉ ｌｄ ｓ ｂｌ ｅ ｖ ｄＦ ） 通 ．． ｖ ｄｓ ｆ ｅ— ｔ ｉｚｄＦ ，ｓｖ ｕｉ ａ ｉ 过链 内 二 硫 键 联 结 ＶＨ 和 Ｖ ： Ｌ功 能 区 中结 构 上 固定 的 骨 架 区
功 能 性 抗 体 。这 种 抗 体 的 两 个 Ｆ ｂ段 能 同 时 与 两 个 不 同 的 ａ
１ １ ２ 嵌合 抗体 （ ｈｍｅ ｃａｔ ｏｙ 是在 基 因 水平 上 连 ．． ｃ ｉ ｒ ｎｉ ｄ ） ｉ ｂ
抗原相结合 ， 如与特异性抗 原及效应细胞相结合则 可介 导抗 体靶 向特异性结合抗原 与效应细胞 的杀 伤作用。 １ ２ ６ 该类抗体最 新进 展 由于小 分子抗 体 分子量 小 ， ． ． 易 于渗透人靶 向部位 及与其 他分 子融合 ， 内清 除率高 ， 源 体 人
由于 两 条 链 间 的 非 极 性 相 互 作 用 ， 稳 定 ， 且 因 为 有 Ｃ 很 而 Ｈ１ 而 便 于检 测 。
合某种抗原的小 鼠免疫球 蛋 白。具 有特 异性 强 ， 度高 ， 纯 可 以规模化生产等优点 ， 在肿瘤靶 向治疗 的初期显示 了 良好 的 靶向定位 及拮抗功效 。但 鼠源性 单抗 存在免疫原性 ， 在人 体
肿瘤靶向治疗抗体研究进展
月蚤栽耘 酝栽员园猿 悦阅员怨 和 悦阅猿
双特异 杂糟云增
月蚤栽耘
耘责 鄄 悦粤酝 和 悦阅猿
开发阶段 云阅粤 批准 Ⅲ期临床 Ⅱ期临床 Ⅰ期临床
临床前
临床前 临床前 临床前 Ⅰ期临床 临床前
适应证
结肠癌造影 癌症 乳腺癌 为胃肠道肿瘤放射、 免疫治疗探查靶点
黑色素瘤
乳腺癌
卵巢和乳腺癌 黑色素瘤 月 细胞淋巴瘤 结肠癌
万方数据
外，也可作为一种独特型抗原诱导机体产生抗独特型抗体。 抗独特型抗体分为 α、β、γ、δ 源 种亚型，其中 β 型 粤遭圆 能有 效模拟外部抗原的三维结构，诱导产生类似外部抗原产生的 特异性免疫反应，故可成为疫苗即抗独特型疫苗。 员援 猿援 猿摇 细胞内抗体（ 蚤灶贼则葬遭燥凿赠）摇 是指应用基因重组技术在 细胞内合成的一种工程抗体 辕 细胞因子，通过耦联定位信号 序列，定向表达于亚细胞器（ 如细胞核、细胞浆或内质网）， 能够特异性结合细胞内靶分子，干扰或阻断靶分子的加工、 分泌过程或去除靶分子，使其生物学表型得到敲除，进而影
员援 猿摇 新型抗体分子 员援 猿援 员摇 抗体相关分子摇 是通过基因拼接、化学交联等方法， 使不同类型抗体分子与酶、化学药物、放射性同位素、生物毒 素、超抗原等相结合形成的抗体。抗体相关分子中的抗体一 般发挥导向及载体效应，可使所连接物质准确无误地聚集于 靶组织，具有特异性高、用量少、副作用小的优点。 员援 猿援 圆摇 抗独特型抗体（ 葬灶贼蚤 鄄 蚤凿蚤燥贼赠责蚤糟 葬灶贼蚤遭燥凿赠，粤陨凿 或 粤遭圆） 摇 此型抗体的提出基于 允藻则灶藻 的免疫网络学说。抗原刺激机 体产生相应抗体（ 粤遭员 ），粤遭员 可变区除与抗原特异性结合
悦悦源怨
栽粤郧 鄄 苑圆 全心炎抗原
丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达
丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达¹100039北京解放军第302医院成军施双双钟彦伟夏小兵王刚王琳刘妍陈菊梅摘要利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体(ScF v)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-core-ScFv。
以重组的HCV核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-core-ScFv基因的噬菌体克隆。
从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经NcoI/Not I酶切鉴定,该ScFv基因由750bp组成。
将其亚克隆到pCAN TA B5E表达载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DN A序列测定,符合ScF v的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。
I PT G诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV-core-ScFv的表达。
酶联免疫吸附法(EL ISA)证实表达的HCV-core-ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性。
对转化的JM109大肠杆菌上清中表达的HCV-co re-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAG E),证实表达的HCV-core-ScFv的分子量为28kDa。
为应用HCV-core-ScF v进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。
关键词丙型肝炎病毒;核心蛋白;单链可变区抗体;表达中国图书资料分类号Q78EXPRESSION OF SOLUBLE HUMAN ScFv AGAINST C ORE PROTEIN OF HEPATITIS C VIRUS IN E COLICheng Jun,Shi Shuangshuang,Zhong Yanw ei et al.Gene T herapy Research Center, Institute of Infectious Diseases,The302Hospital of PLA,Beijing100039 Abstract T o construct expr essive vector for human ScF v against core protein of hepatitis C vir us(HCV-core-ScF v),and to ex press soluble HCV-core-ScF v in E.coli JM109.U sing phage display technique,the recombinant phages were panned by recombinant core antigen which was coated in a microtiter plate,and after fiv e rounds of biopanning,86 clones were identified specific to cor e antig en.750bp fr ag ment could be released from the plasmid of posit ive phage clones,and the sequence analysis indicated that we hav e obrained the ScFv DN A fragment.T hen DN A fragment was inserted into the expressive vector pCA NT AB5E,and E.coli host JM109was transfor med and induced by IPT G.T he specificity of ScFv in the cultur e medium was ev aluated by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).T he molecular weig ht of expressed HCV-core-ScFv protein is28000dalton as deter mined w ith the aid of SDS-polyacr ymide gel elec-trophoresis(PAG E).T he ex pressed HCV-cor e-ScFv protein w ill be useful in the immunohi stochemical study of liver tissue fr om patients w ith hepatit i s C and gene therapy against HCV infection.Key words HCV;core,single chain Fv ant ibody;expression丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗病毒治疗,目前除了部分病人对重组干扰素A(IFN A)具有一定的治疗反应以外,还没有更为确切的治疗方法。
基因工程抗体
基因工程抗体研究进展及其临床应用林晓虹摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体．近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力．关键词：抗体；基因工程抗体；噬菌体抗体库转基因技术迅速发展，其应用和发展的领域日益夸大。
但转基因技术的弊端日益凸现，引起众多关注的目光。
就转基因技术本身而言，社会各界对它的态度各有异同。
不同的国家不同的民族和不同的个体对转基因技术的态度大相径庭。
如何看待转基因技术？如何去应用和发展转基因技术？这些都是我们亟待解决的问题基因工程抗体介绍基因工程简介基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。
由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因此，在80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。
基因工程抗体种类基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。
1 ．嵌合抗体嵌合抗体（chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
2 ．人源性抗体是将人抗体的CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的CDR ，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。
3 ．完全人源化抗体采用基因敲除术将小鼠Ig 基因敲除，代之以人Ig 基因，然后用Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。
4 ．单链抗体是将Ig 的H 链和L 链的V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV （single chain fragment of variable region,sFv ）。
ScFv噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用
・综述・ScFv 噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用侯俊然 何蔼 詹希美 摘要 随着蛋白组学时代的到来,对目的抗体的需求量的增加,噬菌体抗体库技术获得抗体的优越性得到充分发挥。
该文主要介绍噬菌体抗体库技术的重要一种ScFv (单链抗体)噬菌体抗体库技术。
从理想ScFv 噬菌体抗体库的构建、可溶性表达、液体和固体筛选的优缺点及其在寄生虫学的应用等几个方面对此技术的研究进展作一综述。
关键词 噬菌体抗体库;可溶性表达;筛选;ScFv作者单位:510080广州,中山大学基础医学院寄生虫学教研室E 2mail :houjunran2003@ 电话:020********* 单链抗体(single 2chain antibody fragment ,ScFv ),仅为完整抗体的六分之一,相对分子质量(Mr )约为27000,由轻链可变区(vl )和重链可变区(vh )之间通过14～15个氨基酸的弹性小肽连接形成,具有许多优点:体积小,免疫原性低,不易引起人体排斥反应;无Fc 段,不易与具有Fc 受体的非靶细胞结合,成像清晰;渗透性好,能有效穿透致密的组织屏障;易于基因操作和基因工程大量生产。
在诊断和治疗方面有广泛的应用前景,将成为基因工程抗体技术的重要方法之一。
1 ScFv 噬菌体抗体库的技术流程从有关的细胞(免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞等)克隆出抗体可变区Ig G ,设计引物,利用PCR 扩增出轻链可变区(vl )和重链可变区(vh ),用一段弹性连接肽将其连接,构成单链抗体ScFv 。
重组到噬菌体表达载体中,感染宿主菌,通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把单链抗体ScFv 表达在噬菌体表面,利用特异性抗原进行筛选,并重复筛选过程,达到抗体的富集。
2 ScFv 噬菌体抗体库技术2.1 理想ScFv 噬菌体抗体库的构建Okamoto[1]认为理想ScFv 噬菌体抗体库是包含所有抗体可变区的功能位点,包含所有抗体组合形式,抗体多样性最大。
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双特异性单链抗体BiTE的研究进展周冲;于峰;韩邦兴;周阳;刘黎琼;施海峰【摘要】癌症是严重威胁人类生存的重大疾病.BiTE(bispecific T-cell engager)所代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体,能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞.BiTE由两个单链可变片段(scFv)组成,通过柔性融合接头串联连接.一个scFv 识别T细胞表面蛋白CD3ε,而另一个scFv识别特异性肿瘤细胞表面抗原.BiTE的这种结构和特异性结合蛋白能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T 细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物,诱导免疫突触形成,刺激T细胞活化,产生杀伤肿瘤的细胞因子.近年来,BiTE在抗肿瘤研究中取得了显著进展,在临床上取得了理想的治疗效果.因此,对BiTE的结构、作用机制、临床应用以及创新性运用进行阐述.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)004【总页数】5页(P76-80)【关键词】双特异性单链抗体;BiTE;免疫治疗【作者】周冲;于峰;韩邦兴;周阳;刘黎琼;施海峰【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;皖西学院生物与制药工程学院中药研究与开发工程技术研究中心,六安237012;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;深圳市南山区人民医院血液科,深圳518052;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q78癌症是严重威胁人类健康及社会发展的重大疾病。
据中国2013年癌症统计数据显示，中国新发病例368万，占世界癌症新发病例的四分之一，且发病率总体呈增长趋势[1]。
现有常规治疗方案存在的非特异性、副作用大等问题推动了特异靶向治疗癌症的新型战略发展。
近年来，以BiTE为代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体技术迅速发展。
BiTE又称双特异性T细胞接合器(bispecific T cell engager)，属于双特性单链抗体，可同时识别T细胞与表达特定的肿瘤表面抗原的靶细胞，帮助T细胞重定向到肿瘤病灶区[2]。
人体自身大量存在的T细胞被激活可大量扩增，产生强大而持久的细胞毒性反应，且具有免疫记忆的潜力，因此BiTE利用T细胞治疗癌症的显著优势可产生较好的治疗效果[3]。
1 BiTE的结构BiTE本质上是一个多肽链，结构上由短的融合柔性接头与两个具有抗原特异性的单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)组成(图1)，大小约为55～60 ku，长度约为11 nm[4-6]。
其中两个scFv分别来自两个单克隆抗体，一个靶向识别选定的肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)，另一个靶向识别T细胞表面的CD3ε，其中CD3ε是T细胞受体中CD3复合物亚基，是T细胞信号传导的稳定组成部分。
小的无免疫原性的融合接头连接一个重链与轻链组成scFv，同时串联两个scFv并允许它们能够自由旋转，一般由3个或更多个SGGGG柔性重复结构组成(S代表丝氨酸，G代表甘氨酸)，甘氨酸分子量小、侧链短可增加侧链的柔韧性，丝氨酸较强的亲水性可增加肽链的亲水性[7-8]。
优化重复结构的数目不仅帮助单链可变片段中的轻链与重链以正确构象缔合，并可通过影响两个scFv之间的距离以促进T细胞和靶细胞在免疫突触中的最佳交互作用[9]。
图1 BiTE的结构与功能示意图Fig 1 The diagram of structure and functionalof BiTEA：BiTE结构示意图，BiTE(bispecific T cell engager)由抗T细胞CD3接头肽与抗TAA的两个特异性单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)串联组成；B：BiTE在肿瘤细胞和T细胞之间“桥梁“作用示意图，BiTE特异性识别与桥接T细胞与靶细胞，形成T细胞-BiTE-靶细胞复合物2 BiTE的作用机制BiTE与其他抗体介导的免疫疗法相似，选择的靶标抗原主要是肿瘤细胞膜上高表达但在正常组织上较低表达的蛋白[10]。
该策略最大限度地减少了非预期的靶向肿瘤外反应的可能性，同时优化了对肿瘤的特异靶向性。
目前BiTE的完整作用机制尚未完全清楚，但可以确定的是BiTE的两个抗原识别结构域桥接T细胞与肿瘤细胞，形成T细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物，诱导细胞毒性免疫突触形成，促进T细胞活化和细胞毒性分子、细胞因子的产生，进而使T细胞免疫激活并裂解靶细胞(图2)[11]。
BiTE的作用机制以抗原依赖性为基础，且具有双重结合依赖性，即BiTE必须同时结合T细胞与表达相关抗原的肿瘤细胞，才能产生T细胞介导的细胞毒性，在BiTE单臂结合T细胞而无靶细胞存在或靶细胞不表达选定靶向抗原的情况下，这种作用机制不发生。
研究表明，当BiTE同时结合T细胞和肿瘤细胞时，可诱导T细胞的活化标志物CD69与CD25以及细胞因子的表达上调，包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等，T细胞被激活而迅速增殖，效应细胞总数增加，杀伤效率进一步增强[12-13]。
而BiTE单侧结合CD3并不能激活T细胞或者产生这种诱导能力。
这种抗原依赖式的效应机制规避了预期外的T细胞活化与非特异性毒性产生，预示BiTE靶向抗原的严格特异性优点。
图2 BiTE作用机制示意图Fig 2 The diagram of BiTE mechanismBiTE通过两个scFv在肿瘤细胞和T细胞之间形成免疫突触复合体；免疫突触包括由PKCθ(protein kinase C θ，蛋白激酶θ)、Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)等组成的中心超分子活化簇以及由黏附分子LFA1(lymphocyte function-associated antigen-1，淋巴细胞功能相关抗原-1激酶)等组成的外周超分子激活簇；T细胞活化、增殖，通过胞吐颗粒作用于靶细胞；在Ca2+存在情况下，穿孔素在靶细胞膜上形成跨膜通道，介导T细胞释放的颗粒酶B进入靶细胞，诱导靶细胞发生死亡级联反应，靶细胞裂解BiTE诱导的细胞毒性免疫突触的结构在组成、尺寸、亚结构与溶解突触的空间排列上与经典的细胞毒性T细胞识别诱导的突触基本相同[14]。
免疫突触由含有重要信号分子的“中心超分子活化簇”(cSMAC)组成，而cSMAC被称作“外周超分子激活簇”(pSMAC)的细胞黏附分子作用域所包围。
在BiTE诱导下，CD8+T细胞和表达选定TAA的靶细胞之间形成cSMAC与pSMAC，包括穿孔素(perforin)、PKC θ(protein kinase C θ)、Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)、CD3的中心定位以及LFA1(lymphocyte function-associated antigen-1)的外周定位[15]。
这种免疫突触的形成主要与BiTE介导的T细胞脱粒有关，其形成频率受TAA表达水平和BiTE浓度影响。
这种免疫突触不依赖于靶细胞上的MHC I类分子，例如靶向EpCAM的BiTE对于高表达EpCAM但MHC I分子缺失的K562肿瘤细胞亦可介导形成免疫突触并发生细胞毒性作用。
BiTE主要结合CD8+细胞毒性T细胞、记忆CD4+辅助T细胞和TREG细胞，天然T细胞需经过CD3/CD28处理才能产生细胞毒性[16]。
BiTE结合的细胞毒性T 细胞可通过胞吐释放颗粒作用于靶细胞，包括穿孔素与颗粒酶B(granzyme B)。
穿孔素以单体形式被分泌至免疫突触中，通过钙依赖的C2结构域快速结合靶细胞膜，在钙离子存在下，多个穿孔素单体(约24个)聚集在靶细胞膜上并形成直径约18 nm的跨膜孔道，靶细胞膜发生去极化，同时颗粒酶B被转运至靶细胞内，并激活胞内凋亡级联反应(如胱天蛋白酶3/7)，切割靶细胞内多种死亡底物，包括DNA断裂因子(DFF)、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、核纤层蛋白等，最终致使肿瘤细胞死亡[17-19]。
使用钙螯合剂EGTA可保护表达抗原的靶细胞免受BiTE介导的细胞毒性证明了穿孔素机制的参与。
另外尚未有研究表明FasL-Fas受体系统参与BiTE介导下的杀伤作用，尽管其在正常细胞的凋亡中发挥重要作用。
此外，BiTE赋予结合的T细胞抗原特异性，这个过程不依赖于T细胞本身的抗原特异性以及共刺激信号，这样可克服肿瘤免疫逃避机制中MHC I类分子和共刺激分子的丧失或下调、以及肽抗原加工和表面递送的缺陷[20]。
目前BiTE不需要共刺激即可诱导T细胞毒性产生的原因尚未清楚，有研究者认为较少刺激即可活化的记忆T细胞是主要效应细胞。
印证这点的是BiTE抗体 Blinatumomab可诱导CD8+/CD45RO+记忆T细胞产生细胞毒性，但是对CD8+/CD45RA+无作用[21]。
3 BiTE的临床应用目前多种靶向不同的肿瘤抗原BiTE抗体已经被报道有较高的抗肿瘤活性，包括CD19、EpCAM、HER2、EGFR、CEA、CD33、EphA2和MCSP(或HMW-MAA)等[22-25]。
由于BiTE抗体分子量小于一般抗体类药物，所以BiTE抗体具有较好的组织渗透性，在各种异种移植瘤模型中显示较高的抗肿瘤活性，且已在临床上运用(表1)。
表1 BiTE的临床运用Table 1 The BiTE in clinical名称(Name)靶点(Target)治疗疾病(Target disease)临床试验阶段(Clinical status)Blinatumomab (MT-103/MEDI-538)CD19急性淋巴白血病(Acute lymphoblastic leukemia)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma)临床I期(NCT00274742)临床II期(NCT01207388)临床II期(NCT01209286)临床I期(NCT02568553)临床II期(NCT02143414)临床III期(NCT02003222)AMG 330CD33急性髓细胞白血病(Acute myeloid leuke-mia)临床I期(NCT02520427)MT110/SolitomabEpCAM 上皮样癌症(Epithelioidsarcoma)临床I期(NCT00635596)MEDI-565(MT111)CEA胃肠道癌(GI adenocarcinoma)临床I期(NCT01284231)AMG 212/MT112PSMA前列腺癌(Prostatic carcinoma)临床I期(NCT01723475)AMG 420BCMA多发性骨髓瘤(Multiple myeloma)临床I期(NCT02514239)3.1 BlinatumomabBlinatumomab(MT103)是靶向CD19/CD3的BiTE，对B细胞衍生的急性淋巴白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)显示出一定疗效与安全性 [26]。