高中生物选修三导学案002 DNA重组技术的基本步骤
简述dna体外重组的基本过程
简述dna体外重组的基本过程DNA体外重组是一种重要的生物技术方法，用于合成、克隆和改造DNA分子。
它的基本过程包括：DNA提取、DNA片段切割、DNA片段连接、DNA转化和筛选。
进行DNA提取。
DNA提取是从生物样品中分离出DNA分子的过程。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐水法和商用DNA提取试剂盒。
通过这些方法，可以从细胞或组织中提取纯净的DNA。
接下来，进行DNA片段切割。
DNA片段切割是将DNA分子切割成特定长度的过程，常用的切割酶包括限制性内切酶和脱氧核苷酸转移酶。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在识别位点上切割DNA，产生特定长度的DNA片段。
然后，进行DNA片段连接。
DNA片段连接是将两个或多个DNA 片段通过连接酶连接在一起的过程。
连接酶能够将DNA片段的末端粘性的碱基序列连接起来，形成连续的DNA分子。
连接酶还可以用于连接不同来源的DNA片段，实现重组DNA的构建。
接着，进行DNA转化。
DNA转化是将重组的DNA分子导入到宿主细胞中的过程。
转化方法有多种，常用的方法包括热冲击法、电穿孔法和化学法。
通过转化，重组的DNA可以进入宿主细胞，并在细胞内进行复制和表达。
进行筛选。
筛选是为了筛选出带有所需基因的转化细胞。
常用的筛选方法包括抗生素筛选和荧光筛选。
抗生素筛选是利用转化细胞对特定抗生素的抗性来筛选带有目标基因的细胞。
荧光筛选是利用基因工程技术将目标基因与荧光标记基因连在一起，然后通过观察细胞是否发出荧光来筛选带有目标基因的细胞。
总的来说，DNA体外重组是通过将DNA提取、切割、连接、转化和筛选等一系列操作步骤，将不同来源的DNA片段进行组合和改造，从而获得具有特定功能的重组DNA分子。
这项技术在基因工程、生物医学研究和生物制药等领域发挥着重要作用。
通过不断的改进和创新，DNA体外重组技术将为人类带来更多的科学发展和应用前景。
DNA重组的主要步骤
DNA重组的主要步骤
DNA重组是指通过分离、移植和修饰DNA序列来改变基因组的过程。
主要步骤如下:
1.DNA分离: 通过酶切、洗脱或电泳等方法将所需
的DNA片段从基因组中分离出来。
2.DNA连接: 使用酶如连接酶或DNA连接酶将所
需的DNA片段连接在一起。
3.DNA克隆: 将连接好的DNA片段插入到载体中，
如质粒或菌系，进行DNA克隆。
4.DNA纯化: 从质粒或菌系中纯化出重组DNA。
5.DNA检测: 通过测序、质粒分析或其他方法检测
重组DNA的纯度和完整性。
6.DNA应用: 将重组DNA应用于基因疗法、基因
工程、药物研发等领域。
重组技术是基因工程的基础，广泛应用于生物医药、农业等领域。
在这个过程中，需要使用高纯度DNA质粒和严格的操作条件来保证重组DNA的质量。
7.DNA转化：将重组DNA转化为目标细胞，使之
能够生长和繁殖。
8.筛选：筛选出含有目标基因的细胞。
9.验证：使用多种方法（如Southern南方杂交、PCR
聚合酶链反应等）来验证重组DNA的纯度和完整性。
10.应用：将重组DNA应用于基因疗法、基因工程、
药物研发等领域。
DNA重组技术是一种高精度的分子生物学技术，可以通过改变基因组结构来改变生物体的性状。
这项技术在基因疗法、基因工程、药物研发、农业等领域都有着重要应用。
在进行DNA重组时，需要严格遵循实验流程和操作规范，避免误操作。
DNA重组和鉴定-基本步骤
缺口
1）一定数量的载体自身环化分子，产生较高的 假阳性在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体 的5’磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。 2）用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连 接时插入片段可以两个方向插入载体中。 3）片段的多拷贝插入 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插 入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体 摩尔数为3：1
磷酸钙与 DNA形成共 沉淀，附着 细胞表面
DNA
+ + ++ + 脂质体 + + + ++ + — — —— — — — — — 细 胞 — — — — — — — — — —
-
重组子的筛选和鉴定
（一）根据载体的性状变化进行筛选
1 根据载体的抗药性标记进行筛选
载体上的抗药基因： 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因
DNA Ligase
克隆载体具备的特征：
1 载体必须具有自我复制和表达的能力 2 载体不能过大 3 载体与宿主细胞容易分离和纯化 4 具有两个以上的遗传选择标记，便于区
别阳性和阴性克隆
特征 在宿主细胞内稳定 能控制自身复制 大小较小 存在限制性内切酶单一 酶切位点 不能通过接合转移 易于检测的特性，具有 两个以上的检测位点 容易从细胞中分离 允许复制
抗卡那霉素基因等
凡是转入了载体的细胞都获得了这种
抗药性，可以在平板上生长菌落。
当带有完整抗药性基因的载体转化无
抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得
了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板
上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不
能生长。只带有一种抗药基因的载体组成
的重组DNA，在琼脂平板上生长成菌落是不
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤
重组DNA技术，顾名思义就是利用先进的分子生物学技术，通过可重组DNA来改变生命体的基因组成，从而达到一定的治疗或者研究目的。
具体来说，重组DNA技术主要包括以下几个步骤：
1. DNA片段的制备
首先，需要从不同来源中提取目标DNA，包括人、动物、植物、细菌等等。
一般来说，利用DNA电泳和酶切等技术可将DNA分离和切割成不同大小的片段。
2. DNA片段的连接
将不同来源的DNA片段进行互相连接，使新的DNA构建成为完整的基因，这个过程中需要用到DNA连接酶。
3.外源DNA的插入
在DNA连接完成后，需要将新的DNA插入到宿主细胞中，一般采用电转化或者病毒载体等方法。
这样，就可以让宿主细胞在分裂生长中
继承新的基因组成。
4.筛选和鉴定
完成DNA插入后，需要对宿主细胞进行筛选和鉴定，以确认是否达到预期，例如涉及到治疗目的的，需要保证插入的新基因没有负面的作
用和反应，同时还需要对新基因的表达和功能进行一定的检测和评估。
总之，重组DNA技术是目前分子生物学领域中的一项重要技术，在治疗癌症、传染病等方面有着广泛的应用前景。
虽然存在着一定的道德
和伦理问题，但只要合理使用和监管，相信它将会成为人类健康和生
命发展的重要基石。
简述dna重组技术的基本过程
简述dna重组技术的基本过程嘿，咱今儿就来说说这 DNA 重组技术的基本过程，这可真是个神奇的玩意儿呢！你想啊，DNA 就像是生命的密码本，而 DNA 重组技术呢，就是能让我们去重新编排这些密码的魔法棒。
首先，得找到我们需要的基因片段。
这就好比在一个超级大的基因宝库里面寻宝，得有一双敏锐的眼睛去发现那个特别的宝贝。
然后，用一些特殊的工具把它给切下来。
接下来，再找一个合适的载体，就像是给这个基因片段找个交通工具，让它能去到该去的地方。
把基因片段和载体连接起来，这可不是简单地拼在一起哦，得严丝合缝，就像搭积木一样，要稳稳当当的。
然后呢，把这个带着基因片段的载体送进细胞里面去。
细胞就像是一个小工厂，这个基因片段就可以在里面发挥作用啦。
它可以指挥细胞生产出我们想要的东西，比如某种蛋白质啥的。
你说神奇不神奇？就这么几个步骤，就能让原本不存在的东西在细胞里出现。
这就好像你本来不会做饭，突然有人给了你一本神奇的菜谱，你按照上面做就能做出美味佳肴一样。
DNA 重组技术在好多方面都大有用处呢！比如在医学上，可以用来生产药物，治疗那些以前很难治的病。
在农业上，能让农作物变得更抗病虫害，产量更高。
想象一下，如果没有DNA 重组技术，我们的生活会变成什么样呢？可能好多病都没办法治好，我们吃的粮食也没那么丰富。
所以说啊，这 DNA 重组技术可真是个了不起的东西。
它让我们对生命的奥秘有了更深的了解，也让我们有了更多改变世界的力量。
咱可得好好感谢那些科学家们，是他们让这一切成为可能。
总之，DNA 重组技术就是这么牛，它的基本过程虽然听起来有点复杂，但就是这些步骤让它变得如此神奇和重要！。
3.3基因工程-重组DNA技术的基本过程
6
3、
加入同聚体尾连接：
TdT末端加尾的原理
7
8
4.平端连接
所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比，粘性末端连接要高 些（大于2.5倍）
9
四、将重组DNA导入宿主细胞
1. 转化（transformayion）
将质粒或胞（Competent Cell）：E-coli经Cacl2处理 （0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源 DNA的能力。 转化程序： 感受态细胞+质粒DNA 42℃、90sec
3
3、化学合成法
4.
a.a→code→DNA→化学合成nt
PCR（polymerase chailibrary）：因限制性内切酶将基因组 DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿 主细n）
感染
11
五、重组体的筛选
（1）遗传学方法 （2） 免疫学方法 （3）核酸杂交法 （4）PCR技术 （5）酶切鉴定
1.
遗传学方法
含抗性基因的质粒，转化后，细菌在 含这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细 菌即被杀死，能生长的，就是一转化的。
⑴ 筛选转化菌：
12
13
14
⑵ 筛选带有重组体的克隆 ①插入失活法（insertion inactivation） 鉴别：质粒重组体和非重组体 适用于： 具有两个或两个以上抗生素性标记的质粒。 ② -互补 （-complementation） M13噬菌体（插入了一段LacZ基因） 宿主（删除了一段LacZ基因 LacA：当M13感染空载宿主后，产生完整的LacZ产物。 -半乳糖苷酶 Xgal X（兰色）+gal（无外源DNA） B：当M13插入了外源 DNA后，其LacZ基因被破坏，不能与宿 主细胞中LacZ的互补，产生LacZ产物。 Xgal X （兰色） （含外源DNA 重组克隆） 15 C：蓝白筛选：
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2．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
请回答下列问题：
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越__________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是____________________________________________________________________。
(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止__________________________________________ ___________________________________________________________________。
(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_______酶。
(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____________________________
___________________________________________________________________。
(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在____________________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
1、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A．人工合成基因B．制备重组DNA分子
C．转化受体细胞D．目的基因的检测和表达
2、下列不属于
．．．目的基因与运载体结合过程的是（）A．用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端
B．用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端
C．将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处
D．将重组DNA导入受体细胞中进行扩增
3、在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（）A．用mRNA为模板逆转录合成DNA
四
课
后
巩
固
篇
B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
C．由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA
D．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选
4、下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核
酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
5．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在，下列说法正确的是 ( )
A．基因a只有导入到马铃薯受精卵中才能表达
B．目的基因来自细菌，可以不需要载体直接导入受体细胞
C．基因a导入成功后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径
D．目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞并表达
6．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。
据图分析，下列说法正确的是( )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
7．某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，只是其热稳定性较差，进入人体后容易失效。
现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物消化不良，最佳方案是 ( )
A．替换此酶中的少数氨基酸，以改善其功能
B．将此酶与人蛋白酶进行拼接，形成新的蛋白酶
C．重新设计与创造一种蛋白酶
D．减少此酶在片剂中的含量
8．北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。
下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是 ( )
A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序
B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白
C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达
9．下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是 ( )
A．DNA连接酶、限制酶、解旋酶 B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶C．解旋酶、限制酶、DNA连接酶 D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶10．将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。
下列叙述错误的是( )
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
二、非选择题
11．下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答问题。
(1)在基因工程中，A表示________，如果直接从苏云金芽孢杆菌中获得抗虫基因，
①过程使用的酶区别于其他酶的特点是_______________ ________，B表示______ __。
(2)B→D的过程中，若使用的棉花受体细胞为体细胞，⑤表示的生物技术是________。
要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程：____________________ ______________________________________________________________
__________________________________________________________________。
12．科学家设法将人的生长激素基因导入其他生物体(细胞)内，从而获取大量的人的生长激素，应用于侏儒症的早期治疗，如下图所示。
请据图回答下列问题。
(1)过程①采用的方法是______，过程②之前需用________处理目的基因和质粒。
(2)过程③需事先对大肠杆菌用________________处理，使其处于感受态，接着
________________，从而完成转化过程。
(3)过程④动物细胞培养中使用的工具酶是________，与植物组织培养的培养基相比，动物细胞培养液中通常需加入________。
(4)过程⑤一般先将生长激素基因导入奶牛的________，然后进行早期胚胎培养，再进行胚胎移植，生下转基因牛犊。
13．如图表示转基因抗病马铃薯的培育过程，请回答相关问题：
(1)如果用马铃薯发育的某个时期的mRNA反转录产生的__________片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做马铃薯的__________。
若要在短期内获得大量目的基因，可采用技术，该技术的主要步骤是，与目的基因体内扩增有什么不同？
（至少写两点）
(2)重组质粒中，目的基因的两端还必须有__________和终止子。
再导入马铃薯细胞时，最常用的方法是，原因是。
导入受体细胞后，采用____
_ __技术检测转基因马铃薯的_____ _____上是否插入了目的基因，同时还要采用_______ ___技术检测目的基因是否在转基因马铃薯细胞中表达。
(3)培育愈伤组织的固体培养基中，除了无机盐、有机营养物质、琼脂、卡那霉素外，还需添加的物质是__________，添加卡那霉素的作用是__________。
将植物受体细胞培养成为转基因植株，需要经过和关键环节，其理论基础是。
（4）结合本题材料谈谈基因工程具有什么优点？（至少写2点）
14．科学家通过探究DNA载体途径的RNA干扰技术抑制端粒酶的活性，从而抑制肿瘤细胞生长增殖，以寻找一种抑制肿瘤增长的新途径。
方法思路：
①构建干扰质粒___ __[插入针对人体端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)的
mRNA的干扰序列]和对照质粒PSG－CTR(插入不针对人体任何DNA序列的对照
组序列)。
②用空质粒PSG(不含目的基因)、干扰质粒PSG－AS和对照质粒分别感染肝癌细
胞。
③一段时间后观察检测细胞的________。
计算细胞凋亡率，绘制肝癌细胞生长曲
线。
结果如下图：
请回答下列问题。
(1)完成方法思路中的空格：
①________；③_____________________________________________________。
(2)在构建质粒时，要将质粒导入大肠杆菌细胞并用________培养基进行筛选鉴定，
然后再提取。
因此，在构建的表达载体质粒上必须含有________。
(3)端粒酶可以通过以自身的________为模板，________为原料来合成端粒DNA。
(4)分析DNA载体途径的RNA干扰技术能否抑制肿瘤细胞的增殖？为什么？
五
重
点
知
识
整
理
篇
我的总结与反思：要求学生作
笔记，把重点
知识整理在
这里。