淋巴细胞的分离方法
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的分离与活力检测
实验原理：
将血液组分与分离液一起离心时，不同比重的血液组分
会分布于相应密度梯度的分离液中，从而将血液各组分分 开，收集到淋巴细胞。 活性T淋巴细胞表面CD2分子可与绵羊红细胞（SRBC）表 面糖肽受体结合，形成玫瑰花环，计数总T细胞中玫瑰花环 数，可检测活性T细胞比例。
实验方法：
1. 小鼠摘眼球取血1 ml，滴入装有1 ml肝素的试管A内摇匀，
Hank’s液对倍稀释。
2. 保沿管壁流下的血液与分离液形成明显的界面。 3. 配平试管A、B，2５00 rpm离心15 min，小心取出。 4. 小心吸取B试管内中间区域的白色雾状薄层，移入试管C。
5. Hank’s液洗1-3次(加Hank’s液对倍稀释,2000 rpm离心10
min）。 6. 洗完后留下管底0.1ml液体，即为淋巴细胞悬液。
7. 加入0.1 ml SRBC，(37度孵育5 min)500 rpm离心5 min。
8. 小心吸去上清，留0.1 ml，轻轻吹匀，加0.8%戊二醛2滴固
定2-3 min。 9. 取1 滴涂片，晾干后加瑞氏染液1 ml，1 min左右，加等量 缓冲液，10 min左右，漂洗掉多余液体，擦干玻片周缘水 渍，镜检。
1. T细胞
2. SRBC
外周血淋巴细胞分离方法
实验 18 外周血淋巴细胞分离方法目的了解密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理及其操作过程。
原理淋巴细胞分离掖是由60%的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。
它具有分子量大、无化学活性、20℃时比重为1.077士0.001的特性。
血液中各种细胞的比重不同，淋巴细胞与单核细胞的比重约为1.070，而粒细胞和红细胞的比重为1.092左右。
将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布，从而将淋巴细胞与其它血细胞分离开。
材料1. 淋巴细胞分离液(比重1.077土0.001)。
2. 肝素。
3. 无Ca2+、Mg2+的Hanks溶液，pH7.2～7.6。
4. RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)。
5. 其它:注射器、吸管、滴管（均为无菌）,血球计数板，水平离心机，显微镜等。
方法1. 无菌抽取静脉血2ml，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释，混匀。
2. 用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。
3. 经水平式离心2000r/min×20min，小心取出试管。
4. 用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500r/min ×10min。
5. 弃上清，加RPMI-1640培养液1ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。
（1）细胞计数: 取1滴细胞悬液置血球计数板上，静置片刻，显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数（见图15），按下列公式计算出细胞总数。
四个大方格细胞总数×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104细胞总数= 4（2）台盼蓝拒染法测定细胞活力: 取4份0.2%台盼蓝与1份4.25%生理盐水混合，将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合，在3分钟之内压片，在光学显微镜下计数未染色的细胞（为活细胞）与染色细胞（染成兰色,为死细胞），计算活细胞占细胞总数的百分数。
T淋巴细胞的分离技术
T淋巴细胞的分离技术T淋巴细胞的分离技术（一）原理混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。
（二）材料及试剂1．尼龙毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
3．装填尼龙毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。
（三）操作方法1．尼龙毛的清洗与干燥（1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1包或2包，每包35g)放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。
(2)冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。
（3）重复(1）、(2）步骤6次。
（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内.2．装尼龙毛柱（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。
（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠,以适应注射器的直径，填入注射器内，约20ml的体积.(3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。
3．细胞分离（1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛,关上阀门。
(2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞／ml。
(3）将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。
盖上注射器，37℃温育45min至1h。
（4）打开下口，缓慢放流(1滴／min)，收集于离心管中。
（5）离心,即获所需的T淋巴细胞。
(6）关闭注射器下口，于注射器内加入0。
85％冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。
分离牛脏器组织淋巴细胞的方法
分离牛脏器组织淋巴细胞的心得体会一、分离方法说明及图例A．取组织匀浆单细胞悬液（细胞浓度为2×108-1×109个/ml，具体制备方法参照“二、组织单细胞悬液的制备”）2ml，小心加于2ml细胞分离液（这次实验使用的是天津灏洋的分离液）之液面上；B．以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；第二层细胞放入含4-5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。
重复洗涤2次即得所需细胞。
注：提取率大于90%。
B. 全过程及所需试剂要求无菌环境。
二、组织单细胞悬液的制备注：A.本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同，请各实验室自行选择进行试验。
B. 全过程及所需试剂要求无菌环境。
剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液及20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5ml组织匀浆液及20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用100目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内；离心沉淀1500转/分×3min，再用细胞洗涤液清洗3次，每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以200目不锈钢滤网（另购）过滤去细胞团块。
作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。
常温下放置,待测细胞的活力。
分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-1×109个/ml的单细胞悬液备用。
匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70ml组织研磨器内，加入2ml组织匀浆液及20%胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用5ml组织匀浆液及20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经200目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀800rpm×2min，再用细胞洗涤液洗3次，离心沉淀。
作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。
脾脏淋巴细胞分离方法[精华]
![脾脏淋巴细胞分离方法[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/120f10c029ea81c758f5f61fb7360b4c2e3f2af0.png)
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法000000需要提前准备的材料：0000000提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，0000000除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
0000000红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
00000001、配制的percoll工作液：配制15 ml0000000100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
0 000002、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml000000070%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000 20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用0000000找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
0000003、小鼠脾脏细胞分离00000000（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min0000000（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
人外周血淋巴细胞分离液tbd 步骤
人外周血淋巴细胞分离液tbd 步骤人外周血淋巴细胞（Peripheral Blood Lymphocytes，PBL）是指存在于人体外周血液循环中的一类免疫细胞，具有重要的免疫功能。
为了进一步研究这些细胞的结构和功能，需要将其分离和纯化出来。
TBD法（T-Lymphocyte and B-Lymphocyte Discrimination method）是一种常用的人外周血淋巴细胞分离液的制备方法，本文将详细介绍其步骤。
TBD法的具体步骤如下：1.收集外周血样本：首先，需要通过合适的方法收集新鲜的人外周血样本。
最常用的方法是使用静脉血采集针和试管，并采用适当的抗凝剂，如肝素、EDTA等，以阻止血液凝固。
2.稀释血样：将采集到的外周血样本用适量的PBS（磷酸盐缓冲液）或RPMI 1640（常用的培养基）稀释，在混合均匀后使血液与稀释液的比例约为1:1。
3.密度梯度离心：将稀释后的血样缓慢倒入离心管中，并加入缓冲液最上层和下层，形成密度梯度。
最常用的密度梯度制备方法是将无菌的Ficoll-Hypaque溶液（密度为1.077 g/mL）加入离心管底部。
然后，将离心管安置在离心机中，进行高速离心。
4.洗涤淋巴细胞：经过离心后，管中细胞会在密度梯度上不同的位置形成分层，外周血单核细胞和淋巴细胞富集在上清液中。
使用无菌技术，小心地从上清液中采集单个细胞初浆液（称为淋巴细胞悬液），放入离心管中。
5.离心洗涤：离心洗涤的目的是去除细胞残留的Ficoll-Hypaque和其他有害物质，同时收集干净的淋巴细胞悬液。
将采集到的淋巴细胞悬液加入无菌PBS或RPMI 1640中，混匀后进行低速离心。
将上清液丢弃，保留沉淀。
6.细胞复苏：在离心洗涤过程中，细胞可能会受到机械力的破坏，需要进行适当的细胞复苏。
加入培养基到离心管中，轻轻混匀，使细胞中的膜完全复苏，维持其正常的形态和功能。
7.细胞计数和监测：使用显微镜和倒置显微镜，对分离得到的淋巴细胞进行直接观察和计数。
封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程
封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程一、引言淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，它在免疫系统中扮演着重要的角色。
提取到高纯度的淋巴细胞可以为免疫学研究和临床治疗提供重要的实验材料。
而抗体阴性淋巴细胞提取流程就是一种常用的方法，它可以通过分离抗体阴性的淋巴细胞，得到高纯度的淋巴细胞。
本文将介绍抗体阴性淋巴细胞提取的流程和注意事项，以期为相关研究和实验提供参考。
二、实验前准备1.实验仪器和试剂准备：离心机、细胞计数板、PBS、离心管、灭菌操作台等。
2.实验安全：本实验需要在无菌条件下进行，操作者需要佩戴手套和口罩，以免污染细胞。
3.细胞来源准备：从外周血、脾脏或淋巴结中获得淋巴细胞。
三、操作流程1.细胞分离将外周血、脾脏或淋巴结组织样本放入含有PBS的离心管中，并轻轻摇动，使细胞均匀分散在PBS中。
然后使用离心机将离心管进行离心，沉淀下的细胞上清液去除。
2.红细胞裂解将红细胞裂解液加入离心管中，轻轻摇动混匀，放置室温静置5-10分钟。
3.淋巴细胞分离使用离心机将混合物进行离心，上清液去除，洗涤一次，然后将细胞沉淀上清液去除。
然后向细胞沉淀中加入PBS，并通过过滤网筛选出淋巴细胞。
4.抗体阴性淋巴细胞筛选使用细胞计数板对细胞进行计数，然后使用抗体标记的磁珠或流式细胞术进行抗体阴性淋巴细胞的筛选和提取。
四、注意事项1.操作无菌：实验中需要保持操作台面及工具无菌，以免细胞受到污染。
2.用量准确：在制备实验液和添加试剂的过程中，需要严格按照配方和用量进行操作，避免影响细胞的提取和分离。
3.避免细胞损伤：在实验过程中需要轻柔处理细胞，避免细胞受到机械或化学损伤。
五、总结抗体阴性淋巴细胞提取流程是一种常用的方法，可以用于得到高纯度的淋巴细胞。
在操作过程中需要严格遵守无菌操作和用量准确的原则，以确保实验顺利进行。
通过本文的介绍，相信读者对抗体阴性淋巴细胞提取流程有了更清晰的认识，并在相关研究和实验中能够更好地应用这一方法。
淋巴细胞培养与分离
抗CD3磁球 磁球
2．羰基铁粉吞噬法
原理： 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的 能力， 能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞 密度增大。 密度增大。 方法一： 聚蔗糖-泛影葡胺分层液密 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密 度梯度离心后， 度梯度离心后，则单核细胞沉积于 管底而被去除 而被去除。 管底而被去除。 方法二： 磁铁将细胞吸至管底 将细胞吸至管底， 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上 层液中即含较纯的淋巴细胞。 层液中即含较纯的淋巴细胞。
(三)单核细胞和粒细胞的去除
1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子 存在条件下能主动粘附在玻璃 塑料、 玻璃、 存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、 尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。 尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集 的非粘附细胞即为淋巴细胞。 的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点： 细胞也有较弱的粘附能力， 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有 部分B细胞丢失。 部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95% 95%的单个核细 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细 胞为淋巴细胞，活性大于95% 95%。 胞为淋巴细胞，活性大于95%。
（3）流式细胞术
• 又叫荧光激活细胞分离仪 (nuorescence sorter, activated cell sorter, FACS )法 原理： 原理： 细胞经荧光染色 荧光染色后 通过高速流动 细胞经荧光染色后，通过高速流动 单行， 系统，细胞排成单行 系统，细胞排成单行，逐个流经检测区 进行测定。 进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出 超声振荡动液流， 时，超声振荡动液流，使液流断裂成一 连串的均匀小滴(4000 /s)， (4000个 连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内 最多含一个细胞， 最多含一个细胞，细胞经激光束照射产 生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分 转换成脉冲信号，数据经电脑处理， 辨细胞的类型。 辨细胞的类型。
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1、淋巴细胞的来源：
人淋巴细胞的方便来源是外周血
分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。
根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离
心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
2、密度梯度离心法：
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，
使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度
离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
3、实验方法：
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2）
2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
3、20℃，1500r/min，离心30min
从上一次至下
稀释的血浆、血小板
PBMC
Ficoll
红细胞、粒细胞
4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。
6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。
7.适量的培养基重悬细胞 ，计数。
分离单个核细胞纯度为95%
淋巴细胞约占90%～95%
4、淋巴细胞高纯度化
(一)红细胞的去除
一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。
(二)血小板的去除
将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。
在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法
去除PBMC中混杂的血小板。
（三）单核细胞和粒细胞的去除
1．粘附去除法
原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙
毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。
优点：简便易行，对细胞损伤极少。
缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。
该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
2．羰基铁粉吞噬法
原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。
方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。
方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。
3．苯丙氨酸甲酯去除法
原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基
酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。
用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多
数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。
该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
5、淋巴细胞亚群的分离
原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
常用方法：
（1）E花环分离法
（2）尼龙纤维分离法
（3）流式细胞术
（4）磁珠分离术
（5）亲和板结合分离法