逆转录病毒载体包装细胞的培养及包装过程
aav与lv过表达原理
aav与lv过表达原理AAV与LV过表达原理引言：基因治疗是一种广泛应用于疾病治疗的新兴技术。
其中，腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）和慢病毒（Lentivirus, LV）是常用的基因传递载体。
它们通过过表达目标基因来治疗遗传性疾病、肿瘤和其他疾病。
本文将深入探讨AAV和LV过表达原理。
AAV过表达原理：AAV是一种非致病性病毒，具有广泛的宿主细胞范围和长久的表达能力。
AAV的过表达原理主要包括以下几个步骤：1.包装AAV载体：AAV载体由外壳蛋白（Capsid protein）和目标基因构建的DNA片段组成。
通过体外转染或质粒共转染的方式，将目标基因导入AAV载体中。
2.感染宿主细胞：通过注射或体外培养，将AAV载体导入靶细胞中。
AAV通过与细胞表面受体结合，进入细胞内。
3.转录和转译：AAV载体进入细胞核后，目标基因被转录成mRNA，然后通过细胞的翻译机制转译成蛋白质。
这个过程通常由宿主细胞的转录和转译因子调控。
4.蛋白质表达：转译出的蛋白质在细胞内进行折叠、修饰，并执行中缺失或异常的基因功能。
5.维持和耐受性：AAV基因表达的持久性是其重要特点之一。
AAV载体不会被宿主细胞主动清除，而是稳定存在于细胞内，并持续表达目标蛋白质。
LV过表达原理：LV是一种单链RNA病毒，可以将目标基因导入宿主细胞中，实现过表达。
LV过表达原理主要包括以下几个步骤：1.包装LV载体：LV载体由外壳蛋白和目标基因构建的RNA片段组成。
通过体外转染或质粒共转染的方式，将目标基因导入LV载体中。
2.感染宿主细胞：通过注射或体外培养，将LV载体导入靶细胞中。
LV通过与细胞表面受体结合，进入细胞内。
3.逆转录和整合：LV载体进入细胞核后，RNA被逆转录成DNA。
逆转录过程由病毒编码的逆转录酶催化完成。
逆转录后的DNA与宿主细胞染色体整合，成为宿主细胞的一部分。
4.转录和转译：整合的DNA作为模板，由宿主细胞的转录和转译机制转录和转译成mRNA和蛋白质。
慢病毒包装实验步骤及注意事项
慢病毒包装实验步骤及注意事项当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。
但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。
慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。
慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。
以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
实验流程示意实验材料1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂实验步骤第一步：细胞分盘转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。
将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
第二步：病毒转染1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。
2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。
慢病毒包装
慢病毒包装．慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。
它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。
其中研究最多的是HIV-1慢病毒。
慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。
目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。
与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。
慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。
在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。
慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。
包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G 糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。
用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。
第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。
简述逆转录PCR的原理主要过程及应用
简述逆转录PCR的原理、主要过程及应用1. 原理逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称逆转录PCR）是一种能够从RNA分子中合成相应DNA序列的方法。
其原理基于逆转录酶（Reverse Transcriptase）的能力，该酶可以将RNA模板逆转录成DNA，形成RNA-DNA杂交分子，然后使用DNA聚合酶进行基因扩增。
2. 主要过程逆转录PCR主要包括逆转录反应、PCR扩增以及结果分析三个步骤。
2.1 逆转录反应逆转录PCR的第一步是将RNA模板转录成cDNA（即逆转录）。
逆转录反应涉及到以下步骤：1.提取RNA：从细胞或组织中提取RNA，并使用反式转录酶把RNA作为模板，合成cDNA链。
2.逆转录：在逆转录反应中，首先将RNA模板加热变性，然后加入随机引物和逆转录酶，随机引物可以与RNA模板中的多个位置结合，在逆转录酶的作用下，RNA模板被逆转录为cDNA链。
3.RNA消除：将RNA消除酶加入反应体系，用于消除剩余的RNA模板。
4.热灭活：将逆转录反应体系加热灭活逆转录酶。
2.2 PCR扩增逆转录PCR的第二步是对逆转录产物进行DNA扩增。
PCR扩增主要包括以下步骤：1.初始变性：将逆转录产物加热使其变性，分离双链DNA，形成单链DNA作为PCR的起始物。
2.引物结合：在逆转录产物中加入引物，引物与模板DNA特异性结合。
3.DNA聚合：加入DNA聚合酶和适当的反应缓冲液，在适当的温度下进行DNA链的延伸和复制。
4.循环扩增：通过多次重复的循环，每个循环包含三个步骤（变性、引物结合、DNA聚合），扩增目标DNA片段的数量呈指数增加。
2.3 结果分析逆转录PCR的结果分析可以通过以下几个方法进行：1.凝胶电泳：将PCR扩增产物和DNA分子量标记物一同加载到琼脂糖凝胶孔中，然后通过电泳使其在凝胶中迁移，可根据估测PCR片段长度和目标片段的大小来判断扩增是否成功。
siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选
ｃｏ ｅ ｈ ｍ ｎ ｏｒ ｔｏ ｉ ｌｖ ｃｏ Ｓ ｐ ｒ ｒ ｔ ．Ｓ ｂ ｅ ｕ ｎ ｌ ｅｐ ａ ｍｉ ｓｗ ｒ ｅ ｕ ｎ ｅ ｎ ｉｅ ｔ ｄ ｔ ｅ ｔ ｙ ｔ ｅｃ ｎ ｌ ｎ ｄ ｔ ｅ ｉｔ ｅ ｒ ｖｒ ｅ ｔｒｐ ｕ ｅ ． ｅ ｒ ａ ｏ ｕ ｓ ｑ ｅ ｔ ｔ ｌｓ ｄ ｅ ｅ ｓ ｑ ｅ ｃ ｄ ａ ｄ ｄ ｇ ｓｅ ｉ ｎ ｉ ｈ ｏ — ｙｈ ｏｄ ｆ
Ｐ Ｅ Ｉ ＨＯ ＮＸ细胞 中 ， 筛选 出分泌 Ｍ Ｆ—ｓ Ｎ Ｉ ｉ Ａ病毒的包装细胞 ， Ｒ 其分泌 的病毒可 以抑制 ＭＩ Ｆ蛋白的表 达 ， 并初步 了解
稳定沉 默 ＭＩ Ｆ细胞株的特性 。方法 ： 体外合 成含针 对 ＭＩ Ｆ特异基 因序列 的寡核苷 酸并 定 向克 隆入 ｐ ｕｅ．ｅ ｏ逆 Ｓ ｐｒｒｔ ｒ 转 录病毒载体 ， 构建 的载体 通过酶 切 、 测序 鉴定后 ， 用脂 质体 介导转 染包 装病 毒细胞 株 Ｐ Ｏ Ｎ Ｘ， 采 Ｈ Ｅ Ｉ 收获 病毒 上 清； 将其感染 Ｈ Ｌ ｅ ａ细胞株 ， 经过嘌呤霉素筛选得 到抑制 Ｍ１ 达的 Ｈ Ｌ 胞株 。Ｗｅｔ ｎｂｏ ｉｇ 定 ＭＩ 达 Ｆ表 ｅａ细 ｓ ｒ ｌｔ 鉴 ｅ ｔｎ Ｆ表 的抑制效果并通 过迁 移实验 、 软琼脂 糖克 隆形成 实验 比较 Ｈ Ｌ ｅ ａ—ｐ ｕｅ —ＭＩ Ｓ ｐｒ Ｆ和 Ｈ Ｌ ｅ ａ—ｐ ｕｅ —ｍｏｋ之 间 的特 Ｓ ｐｒ ｃ 性 。结果 ： 构建了重组逆转录病毒载体 ｐ ｕｅ — Ｆ 转染包装病毒细胞株 Ｐ Ｏ Ｎ Ｘ， Ｓ ｐｒ ＭＩ ， Ｈ Ｅ Ｉ 病毒上清感染 Ｈ Ｌ 细胞 ， ｅａ 抑 制 了 Ｈ Ｌ 细胞内源性 ＭＩ 白的表达 。沉 默 ＭＩ 白后 导致 Ｈ Ｌ ｅａ Ｆ蛋 Ｆ蛋 ｅ ａ细胞迁 移能力下 降 ， 不依赖 支持物 生长 的特
慢病毒包装原理介绍
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒 Lentivirus 载体是以 HIV-1 人类免疫缺陷 I 型病毒为基础发展起来的基因治疗载体;区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力;慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入;该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达;在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景;目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中;由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制;采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用;在所构建的 siRNA 表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾;当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3' 端形成 1~4 个U ; U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构 stem loop ;在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNAsmall hairpin RNA, shRNA,载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有 1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA ;构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法,寻找高效的 siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入 siRNA 表达载体;慢病毒载体 Lentiviral vector 较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞;慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性;慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息;慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白;为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子;二、这一系统的目的,主要是为了解决以下问题：1. 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径;2. 进行稳转细胞株的筛选；3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达;三、慢病毒载体介绍慢病毒载体 Lentiviral vector, LVs 是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因或 RNAi 导入动物和人的原代细胞或细胞系;慢病毒载体基因组是正链 RNA ,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后, DNA 整合到细胞基因组中;整合后的 DNA 转录 mRNA ,回到细胞浆中,表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰;慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂;另外,慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中;以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比,比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有鲜明的特色;大量文献研究表明,慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等;慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白,免疫原性低,在注射部位无细胞免疫反应,体液免疫反应也较低,不影响病毒载体的第 2 次注射;四、慢病毒载体的构建1. 构建原理慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除 gag、pol 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外,还包括 4 个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev ; HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的;慢病毒载体的构建原理就是将 HIV 21 基因组中的顺式作用元件如包装信号、长末端重复序列和编码反式作用蛋白的序列进行分离;载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的 HIV 21顺式作用序列;同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因;为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 RCV 的可能性,将包装成分的 5 ′ LTR 换成巨细胞病毒 CMV 立即早期启动子,3 ′ LTR 换成 SV 40 polyA 位点等;将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达 gag 和 pol、另一个表达 env ;根据这个原理,Naldini 和 Kafri 等构建了三质粒表达系统;2. 三质粒表达系统三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒;其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下,表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 V SV 2G,应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列,还保留 350 bp 的 gag 和 RRE,并在其中插入目的基因或标志基因绿色荧光蛋白 GFP ;将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少,减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性;通过三质粒共转染 293T 细胞,超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l ;3. 四质粒表达系统为了减少 HIV 21 包装结构的序列同源性,进一步减少重组成 RCV 的可能性,Dull 等人将辅助基因去除;但由于 gag2pol 的转运需要 rev,因此,在上述的三质粒系统的基础上,构建成四质粒表达系统,该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性,而且对非分裂期细胞转导效率无影响;五、慢病毒载体应用1. 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；2. 将目的基因 /RNAi 基因转入动物组织,以期获得长期表达；3. 构建稳定表达目的蛋白 /RNAi 的细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内；4. 基因治疗；5. 转基因动物；6. 基因敲除；7. 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用；8. 快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法;。
回顾慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤.docx
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
IRES逆转录病毒载体介导的外源基因在成纤维细胞表达的实验研究
墨鎏堕登奎兰苎主堕塞兰兰垡鲨苎Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｏｌｓｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｇｅｎｅｓｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓ）ｖｅｃｔｏｒｓｐｅｒｍｉｔｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｔｏｂｅｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｖｅｃｔｏｒ，ａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ－ｂｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｎｕｐｓｔｒｅａｍｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｔｗｏｏｒｍｏｒｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡ．ＴｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｏｎｅＩＲＥＳ，ａｎｄｇｅｎｅｉｓｃａｐ·ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ａｎｄｏｔｈｅｒｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅａｖｏｉｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩＲＥＳｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｓｍａｌｌｅｒｇｅｎｏｍｅ，ｈｉｇｈｅｒｖｉｒａｌｔｉｌｅｒａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｕｄｙ，ｔｗｏＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ—ｐｂＧＨｌｍｄｒａｎｄｐｈＧＭ－ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩｎｔｈｉｓＣＳＦＩｔｋｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｍｄｒｌｇｅｎｅｏｒｔｈｅＨＳＶ－ｔｋｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｓ．ＴｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｂＧＨａｎｄｈＧＭ－ＣＳＥＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｅｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｉｎｖＮｏｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＰａｒｔｈＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｌａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳＯｂｊｅｃｔ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｔｏＣＯ—ｅｘｐｒｅｓｓｄｒｕｇ．ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｍｄｒｌｇｅｎｅｗｉｔｈｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ（ｂＧＨ）ｇｅｎｅｉｎｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅＮＩＨ３Ｔ３ａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏ７基因转移到哺乳动物细胞的实验研究，为人类基因治疗提供了先导技术，通过将有意义的外源性基因转移并整合到体内特异细胞的染色体内，用于治疗某些严重感染疾病、遗传病及体细胞基因病（如癌症、家族性心脏病和爱滋病等）的基因治疗将成为２１世纪治疗学的最新手段‘。
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶III启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶HI有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA 聚合酶I遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶H依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构(stem loop)。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于RNA聚合酶I启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒包装步骤及注意事项
慢病毒包装步骤及注意事项现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。
此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。
瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。
但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。
多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。
转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。
DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug 不含内毒素的质粒进行转染。
质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。
不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。
转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。
其它方法有脂质体法和PEI法。
转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。
如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012IU/ml的慢病毒载体。
之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-800C储存。
储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。
病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107IU/ml，浓缩之后可以达到109-107IU/ml 。
含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa 试剂盒。
一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24gag。
然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。