硝酸甘油注射液含量检验方法验证(定量限)

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验证方案

编号：Z-V-AQ004-03硝酸甘油注射液含量检验方法验证方案

目录

1、起草、审核与批准 (2)

2、目的 (2)

3、范围 (2)

4、职责 (2)

5、概述 (3)

6、执行标准和规范 (3)

7、验证前的支持性确认 (3)

8、验证内容 (5)

9、数据分析 (9)

10、偏差 (9)

11、确认结果评定与结论 (9)

12、再验证周期 (9)

1、起草、审核与批准：

所属部门职务签名日期起草年月日

审核年月日

审核年月日

批准年月日2、目的：

硝酸甘油注射液在产品生产过程中，需用高效液相色谱法测定其含量，为确定其对含量测定检验方法的适用性，特制定本验证方案。

3、范围：

本方案适用于硝酸甘油注射液含量检验方法的验证。

4、职责：

组长

姓名职务/职称部门职责

QC主管质量检验室1.负责组织起草确认方案。

2.负责协调、组织确认工作。

成员

经理质量管理部1.负责确认方案的审核和监督。

2.负责确认方案的审核与批准。

主管质量管理部1.负责确认方案、报告的审核。

2.负责起草确认合格证书。

主管设备工程部1.负责仪器仪表均已校准合格，且在有效期内。

2.执行安装、运行和性能确认。

确认专员质量管理部

1.负责相关确认项目的测试。

2.保证测试数据的真实性。

确认专员质量管理部

1.负责相关确认项目的测试。

2.保证测试数据的真实性。

5、概述：

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)系采用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入注内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。

硝酸甘油注射液的质量标准中规定，在产品生产过程半成品和成品检验，需用高效液相色谱法测定其含量。

6、执行标准与规范：

本方案以《LC-20A高效液相色谱仪标准操作规程》、《PC-2001高效液相色谱仪标准操作规程》、《硝酸甘油注射液质量标准》为依据，制定了硝酸甘油注射液验证方案。

7、验证前的支持性确认：

仪器确认前应确认与本次确认相关联的完成情况。

7.1 文件的检查确认：

序号文件名称文件编号检查结果

1硝酸甘油注射液含量检验方法验证方案Z-V-AQ004-03 □合格□不合格2硝酸甘油注射液检验标准操作规程SOP-3505□合格□不合格3LC-20A型高效液相色谱仪标准操作规程SOP－Q6115□合格□不合格4PC-2001型高效液相色谱仪标准操作规程SOP－Q6041 □合格□不合格5高效液相色谱仪日常清洁维护与保养标准操作SOP－Q6044 □合格□不合格6玻璃仪器清洗与贮存标准操作规程SOP-Q0064 □合格□不合格7电子天平标准操作规程SOP-Q6017□合格□不合格8电子天平日常清洁维护与保养标准操作规程SOP-Q6018 □合格□不合格检查人/日期：复核人/日期：

7.2 仪器仪表的检查确认：

7.2.1 仪器仪表量程、规格必须符合测试及设计规范要求。

7.2.2 仪器仪表使用前必须经具有相应资质机构校验，且在有效期内。

7.3 公用工程系统的检查确认：

系统名称文件编号检查人检查结果

□合格□不合格

□合格□不合格

□合格□不合格7.4 相关人员的培训：

7.4.1 文件培训

文件培训表

序号文件名称文件编码检查结果

1 硝酸甘油注射液含量检验方法验证方案Z-V-AQ004-03是□否□

2 硝酸甘油注射液检验标准操作规程SOP-3505 是□否□

3 LC-20A型高效液相色谱仪标准操作规程SOP－Q6115 是□否□

4 PC-2001型高效液相色谱仪标准操作规程SOP－Q6041 是□否□

高效液相色谱仪日常清洁维护与保养标准操

5

SOP－Q6044 是□否□作规程

玻璃仪器清洗与贮存标准操作规程SOP-Q0064是□否□6

7 电子天平标准操作规程SOP-Q6017 是□否□

8 电子天平日常清洁维护与保养标准操作规程SOP-Q6018 是□否□

偏差说明/结论：

检查人日期

复核人日期

7.4.2 人员培训

人员培训表

序号姓名是否培训健康状况

1 是□ 否□ 是□ 否□

2 是□ 否□ 是□ 否□

3 是□ 否□ 是□ 否□ 4

是□ 否□

是□ 否□

偏差说明/结论： 检查人 日期 复核人

日期

8、验证内容：

8.1 硝酸甘油注射液含量测定方法

8.1.1 仪器与用具：电子天平、高效液相色谱仪、容量瓶、移液管。 8.1.2 试剂与试液： 乙腈-水（50：50）、硝酸甘油对照品。 8.1.3 条件：照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（50∶50）为流动相；检测波长为215nm 。

取硝酸甘油对照品约1.25g ，置25ml 量瓶中，加0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释至刻度，即得（每1ml 中约含0.5mg 的溶液）。置水浴中加热10分钟，放冷，用0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 值至中性，取20μl ，注入液相色谱仪中，记录色谱图，在相对保留时间约0.4处应出现两个降解产物峰（1,2-二硝酸甘油和1,3-二硝酸甘油峰），两峰之间的分离度应大于1.0。理论板数按硝酸甘油峰计算不低于2000。

样品溶液制备：精密量取本品1ml ，置50ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml 中约含硝酸甘油0.1mg 的溶液）。

对照溶液制备：取硝酸甘油对照品约0.5g ，置50ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

测定方法：精密量取样品溶液与对照溶液各20ul 注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

计算公式： 含量（％）＝％100

51/50A 1.0

C A R

R x ????? 式中： A x ------表示供试品溶液所得色谱图中主成分的峰面积；

A R ------表示对照品溶液的峰面积；

C R ------表示对照品的浓度。

判定标准：本品含硝酸甘油（C3H5N3O9）应为标示量的90.0％～110.0％。

8.2 重复性试验：

8.2.1 取同一批硝酸甘油注射液样品，按硝酸甘油注射液含量测定方法同一人共制备6份供试液测定，所得结果的相对标准偏差≤2.0％。

重复性试验记录

名称硝酸甘油注射液批号：仪器型号：对照品批号来源含量：

配制日期年月日有效期至年月日

系统性试验分离度：理论板数：

对照品称样量对1：对2：

样品取样量样品1: 1→50ml 样品2: 1→50ml

对照1峰面积平均值：

对照2峰面积平均值：

样品序号 1 2 3 4 5 6

峰面积

含量%

RSD%（应≤2.0%）

结论

检验人日期

复核人日期

8.3 中间精密度试验

8.3.1 同一批硝酸甘油注射液，由2个不同的人在不同时间不同仪器分别测定2次的结果，所得结果的相对标准偏差≤2.0％。

表1 中间精密度试验记录

对照品批号来源含量：

配制日期年月日有效期至年月日系统性试验分离度：理论板数：

对照品称样量对1：对2：

样品取样量样品1: 1→50ml 样品2: 1→50ml

对照1峰面积平均值：对照2峰面积平均值：

样品序号1-1 1-2 平均值含量1 含量2 峰面积

样品序号2-12-2平均值含量1 含量2峰面积

平均含量

RSD%（应≤2.0%）

检验人日期

复核人日期

表2 中间精密度试验记录

对照品批号来源含量：

配制日期年月日有效期至年月日系统性试验分离度：理论板数：

对照品称样量对1：对2：

样品取样量样品1: 1→50ml 样品2: 1→50ml

对照1峰面积平均值：对照2峰面积平均值：样品序号1-1 1-2 平均值含量1 含量2 峰面积

样品序号2-12-2平均值含量1 含量2峰面积

平均含量

RSD%（应≤2.0%）

检验人日期

复核人日期

表3 中间精密度验证结果（两人）

名称硝酸甘油注射液批号

含量测定结果

结果％％％％RSD% （应≤2.0%）

结论

检验人日期

复核人日期

8.4. 定量限确认

8.4.1. 定义

定量限是指样品中被测物质能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。 8.4.2. 方法

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（50∶50）为流动相；检测波长为215nm 。

取硝酸甘油对照品约1.25g ，置25ml 量瓶中，加0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释至刻度，即得（每1ml 中约含0.5mg 的溶液）。置水浴中加热10分钟，放冷，用0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 值至中性，取20μl ，注入液相色谱仪中，记录色谱图，在相对保留时间约0.4处应出现两个降解产物峰（1，2-二硝酸甘油和1，3-二硝酸甘油峰），两峰之间的分离度应大于1.0。理论板数按硝酸甘油峰计算不低于2000。

对照品溶液制备：取硝酸甘油对照品约0.5g ，置50ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液制备：精密量取硝酸甘油对照品 g ，置 ml 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml 中约含硝酸甘油0.1mg 的溶液）。

测定法：精密量取上述两种溶液各20μl ，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

计算公式： 含量（％）＝％100

51/50A 1.0

C A R

R x ????? 式中：

A x ------表示供试品溶液所得色谱图中主成分的峰面积； A R ------表示对照品溶液的峰面积； C R ------表示对照品的浓度。 8.4.3. 可接受标准

以 S / N ＝ 10 时的相应浓度作为本品含量检测的定量限。 8.4.4. 定量限确认记录见附表5。 附表5

定量限确认记录

色谱条件

使用仪器

对照品批号来源

色谱柱

型号品牌

流动相

试剂名称批号生产厂家

检测波长流速

柱温进样量

初始浓度

（mg/ml）

信噪比(X)

稀释浓度(mg/ml)

（初始浓度

*X/10）

信噪比

稀释浓度(mg/ml)

（初始浓度

*X/10）

标准要求以信噪比S / N ＝10 时的相应浓度作为本品含量检测的定量限。

结论

确认人日期

复核人日期

9、数据分析：

通过对硝酸甘油注射液含量检验方法学试验，重复性相对标准偏差≤2.0％；中间精密度相对标准偏差（RSD）≤2.0％；以上试验均应符合验证合格标准。

10、偏差：

10.1 在确认过程中有无偏差，如有偏差应找出原因，并通知被检测部门进行调查处理。

10.2 偏差调查记录应由质量管理部存档。

11、验证结果评定与结论：

质量管理部负责收集各项确认、试验结果记录，根据确认、试验结果起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对结果进行综合评审，作出确认结论，发放证书，确认硝酸甘油注射液含量检验方法的各项结果达到合格标准。并对确认结果进行评审，内容包括：

确认结果评审表

评审项目评审结果

试验是否有遗漏？□是□否□N/A

实施过程中对验证方案有无修改？□是□否□N/A

修改原因、依据以及是否经过批准？□是□否□N/A

记录是否完整？□是□否□N/A

试验结果是否符合标准要求？□是□否□N/A

偏差及对偏差的说明是否合理？□是□否□N/A

是否需要进一步补充试验？□是□否□N/A

数据是否真实可靠并且可以用来作为分析评价的依据？□是□否□N/A

评审人（验证小组组长）签名/日期

复核人（现场监控QA）签名/日期

12、再验证周期：

12.1 如硝酸甘油注射液国家标准中硝酸甘油检验方法发生变更时必须进行再验证。

12.2 检验条件发生重大变更时须进行在验证。

12.5 本仪器主要部件更换、检修后应进行验证。

12.6 仪器性能参数应用超出本验证范围。