蝴蝶兰的组织培养

蝴蝶兰的组织培养 蝴蝶兰[phalaenopsis ]为兰科蝴蝶兰属植物,它是一种热带气生兰,俗称“洋兰”。蝴蝶兰花型似蝴蝶,形态美妙、色彩丰富、花期长,在热带兰中素有“兰花皇后”之美称,。蝴蝶兰种类丰富,分布广,东起菲律宾、新几内亚,南达澳大利亚北部,西苏门答腊,北到我国台湾、云南、四川西部均有原种(野生的蝴蝶兰) 存在,约有50 多种,其中我国有7 种,全部为附生兰。蝴蝶兰商品化大规模栽培十分成功，是近年来在国际花卉市场上最受欢迎的洋兰。从离体器官诱导产生类原球茎，通过类原球茎的增殖培养，得到大量幼苗，为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础。类原球茎是一类呈珠粒状的幼嫩器官（种子萌发时先是胚的膨大,种皮破裂,一定时间后发育成肉眼可见浅黄色的原胚呈球状,称为原球茎，由其它外植体诱导产生的称类原球茎），在兰科植物中多以这种器官发育、增殖和分化。蝴蝶兰的组培快繁有胚培养、叶片培养和腋芽培养,腋芽培养形成试管苗,再以丛生芽的方式增殖快繁,可以有效地保持母本的优良性状,变异率最低。 1 材料与方法 （1）材料 取已过盛花期带休眠芽的花梗作为外植体材料。 （2）材料消毒与接种 切下其带芽茎段,长约2 - 3cm ,用自来水清洗干净,在饱和漂白粉上清液中浸泡15 min ,浸泡时不断搅动,浸泡后的茎段用流水冲洗干净,置于超净工作台上,先用75 %的酒精消毒30 s ,无菌水清洗1 次,再用0. 1 %的升汞浸泡10 min ,经无菌水冲洗数次,将带芽茎段接种到经设计的不同激素组合的诱导培养基上,重复3 。 （3）培养基的配制 花梗腋芽诱导培养基为1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L 。 增殖培养基为1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %。 生根培养基为1/ 2MS + BA1. 5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L 香蕉泥 以上培养基p H 均为5. 5 2 结果 在培养条件每天光照12 h ,光强1 600Lx ,温度25 ±2 ℃获得以下效果。 （1）诱导培养效果：蝴蝶兰花梗接种到不同激素浓度的培养基上,生长1 周后在花梗的基部有褐色物质产生,腋芽开始萌动,1 月后腋芽可以长到1. 5 cm 高，出芽率可达50％。 （2）增殖培养效果：将长出的芽选取约1. 5cm 的苗，取出后切去叶片和基部褐化部分,转接到增殖培养基中,40 d 后，增殖倍数可达到3倍以上。 （3）生根培养效果：将高约2. 0 cm 的蝴蝶兰试管苗接种到生根培养基中, 50 d 后，全部生根，平均生根3.5条，长2.5cm。 （4）壮苗培养与驯化移栽：壮苗。生根组培苗壮苗培养基1/2MS+ 蔗糖10g/L+ 琼脂粉3.5 g/L+ 活性炭1.5 g/L ，pH5.4，温度( 25±2) ℃, 光照强度2000Lx, 光照时间14h/d。培养15d 后移栽。驯化：室内开瓶炼苗3d＋室外炼苗3d。 移栽基质：最适合的栽培基质为水苔，椰糠也是良好的移栽基质。 3 讨论 （1）蝴蝶兰和其他兰科植物一样,在组培快繁生产中存在着易褐化死亡的问题,因此如何克服褐变成了组培快繁生产成功与否的关键，活性炭2 g/L ,或PVP 1 g/L效果显著；适时切除培养物的褐化部分并及时更换新鲜培养基，能有效抑制外植体褐变死亡；培养基中加入10%椰子水，也能促进原球茎的生长，减少原球茎增殖过程中的褐变；蝴蝶兰的群体效应很明显，单芽容易褐化死亡，且增殖较慢，因此，刚诱导出的原球茎状体不能过早切割转移，在继代阶段接种时，应尽量避免切成单芽，增殖时切块也不宜过小，否则容易褐化死亡；添加香蕉汁对蝴蝶兰原球茎形成及幼苗生长具有明显的促进作用。 （2）另有报道：①蝴蝶兰原球茎的诱导主要受外植体、培养基和培养条件等因素的共同影响,其中,外植体最难以控制,这与外植体本身的生长发育和生理生化状态有关。因此,对外植体的筛选是组培中较关键的技术。蝴蝶兰组织培养过程中,采用同样培养基处理时,茎尖比叶片、花梗侧芽作为外植体效果较好。②)在激素浓度相同条件下, 1 /2MS、MS、White、B5 作为基本培养基均能诱导出原球茎,但MS效果最好,且诱导的原球茎数量多,密度大。③以MS作为基本培养基对蝴蝶兰原球茎进行增殖培养,附加NAA 1. 00 mg/L和6－BA 2. 00 mg/L时,增殖效果最好。④蝴蝶兰生根过程中,在1 /2MS培养基上根生长最快,生根率可达94. 42%,根长可达0. 86 cm,长势最粗壮,数量最多,说明低浓度的盐分有利于侧根发生。⑤基本培养基中添加蔗糖浓度为3%,琼脂为6. 00 g/L,活性炭为1. 00 g/L; pH值为5. 60 ～5. 80;培养温度为( 25 ±1) ℃;光照时间为13h /d;光照强度为1 500～2 000 lx。 （3）组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的有效途径，主要通过两条途径：一是利用种子无菌发芽，二是从离体器官诱导产生原球茎，通过原球茎的增殖培养，得到大量幼苗。早在1949 年，Potor利用无菌培养技术成功地促使蝴蝶兰花梗上的休眠芽发育成完整植株，该方法经过其他研究人员改进后，曾一度成为蝴蝶兰的主要无性繁殖方式。1974 年，Intuwong等利用蝴蝶兰茎尖诱导产生了原球茎状体，再由原球茎分化成植株，为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础。蝴蝶兰的组织培养中有几个关键的时期：原球茎的诱导、原球茎的继代增殖、壮苗的培育。蝴蝶兰组培的快繁技术，包括外植体的选择、不同基本培养基、激素、添加物对其增殖与分化的影响、外植体褐变的防治以及生根壮苗的方法等。 外植体的选择：诱导蝴蝶兰原球茎采用的外植体主要有根段、花梗苗根尖、花梗腋芽、茎尖、叶片、胚、花葶节间（花葶：地上无茎植物从地表，通常自基生莲座抽出的无叶花序梗）、花梗节或花梗节间切段、种子等。蝴蝶兰不同外植体的成活率有差异，其中花梗侧芽的成活率最高，其次为花梗，叶片和根尖最差。针对不同外植体，取材方法也不同，通常取花梗节之间1～2cm 长的幼嫩部分，切取长2～3mm 的切段作为外植体。如利用2～3cm 长的根尖段，将其切成0.5～0.8cm，接种2 周后根端切口处开始膨大，产生淡绿色瘤状愈伤组织；采用无菌种子苗茎尖作为外植体时，培养30d 后基部出现愈伤组织，出愈率达85%以上；而利用正在培养的花梗苗生长旺盛的根尖进行培养，20d 左右外植体膨大且表面颜色明显加深；用花梗腋芽为起始材料诱导花葶，由花葶节间切片可以高频率诱导分化不定芽。 基本培养基的选择：蝴蝶兰组织培养所采用的基本培养基包括 MS、1/2MS、VW、B5、KC、花宝及其改良型等。但由于蝴蝶兰品种差异及外植体来源不同对最适培养基的选择是不同的：以红花品种为试材，以改良KC 的效果最好，1/2MS 次之，MS 最差；蝴蝶兰的原球茎增殖培养以较低的无机盐浓度为好，大量元素对原球茎增殖有很大影响，1/2MS 对原球茎增殖最有利。在花梗节间切段诱导原球茎的实验过程中对培养基进行筛选，也发现1/2MS 或改良MS 较MS 效果好，减少MS 中大量元素和部分微量元素及有机成分，适当增加少量的叶酸和生物素有利于原球茎的增殖生长；但MS 培养基最适合蝴蝶兰种子的萌发。也有报道B5 培养基更有利于蝴蝶兰根段原球茎的诱导和增殖。 植物生长调节剂对蝴蝶兰原球茎增殖与分化的影响：蝴蝶兰组织培养中常用的细胞分裂素为6-BA，较高浓度（1～8mg/L）的6-BA 能促进蝴蝶兰原球茎增殖，较低浓度（0.1～0.5mg/L）的6-BA 则能促进原球茎分化。有研究表明，低浓度6-BA有利于原球茎的增殖，而高浓度（6mg/L）的6-BA 刺激多酚氧化酶作用，使原球茎容易产生褐化。低浓度的NAA 对原球茎增殖和出苗均有促进作用，高浓度的则不利。研究表明，适宜浓度的6-BA 配合较低浓度的NAA，更有利于原球茎的增殖，2.0mg/L 6-BA 和0.3mg/L NAA 配合使用是蝴蝶兰原球茎增殖的最佳组合。高浓度的NAA 对蝴蝶兰原球茎增殖有一定的抑制作用，NAA 浓度从1mg/L 增加到3mg/L，增殖率相应从98.3%下降到38.3%；采用3.0mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA 配方，能够有效的诱导原球茎，同时还发现提高激素配比（5.0mg/L 6-BA + 0.2mg/LNAA + 活性碳1.0g/L），则有利于原球茎的增殖，提高增殖系数，且不用转接就可直接生根成苗，避免转接过程带来的污染损失，简化了培养过程，因而是一种值得推广的方法；此外，在培养基中加入1.0mg/L GA3 对原球茎分化成芽有一定的抑制效果，为获得大量原球茎而避免分化成芽，适当添加GA3 是有一定作用的。 添加物对蝴蝶兰原球茎增殖和分化的影响：一些氨基酸类添加物，也可以作为培养基中的有机氮源，例如甘氨酸能促进离体根的生长。丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药、胚状体或不定芽的分化。水解酪蛋白和水解乳蛋白对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用。而在培养基中加入一些天然有机物，如椰乳、香蕉泥、番茄汁等，也能提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等，如加入100～200mg/L 香蕉泥，具有较大的pH 缓冲作用，对幼苗发育有促进作用。水解酪蛋白对蝴蝶兰原球茎增殖有明显促进作用，而水解酪蛋白和香蕉匀浆相结合却对原球茎增殖有抑制作用，有机添加物之间的相互作用或有机添加物与培养基之间的相互作用可能对原球茎增殖有影响。许多研究也表明，添加适量的香蕉泥、椰乳或含胶质的果菜汁等均对原球茎增殖有明显促进效果。培养基中添加活性炭，低浓度（0.5～