液相色谱测定单糖与二糖和低聚半乳糖的方法研究
实验二十五细胞中糖类化合物的提取及成分鉴定
实验二十五 细胞中糖类化合物的提取及成分鉴定糖类是一类多羟基的醛或酮及其缩合物或衍生物的总称，可分为单糖、寡糖、多糖、复合糖及糖的衍生物如糖胺、糖酸等。
糖类是生物界分布极广，含量十分丰富的一类有机化合物，几乎所有的动物、植物、微生物体内都含有糖类，其功能也是多样的。
过去认为糖类在生物体内的作用主要是作为能量来源及结构物质，但近20年以来发现糖的复合物在细胞识别、细胞间物质的运输和免疫调节等方面有重要的作用。
糖复合物的信息量非常大，是生物的另一类重要生物大分子化合物。
因此糖的分离、纯化、结构测定、结构与功能的研究也受到科学家广泛的关注。
糖的提取分离方法很多，主要是依据不同糖分子的物理化学性质、溶解度的差异进行 分离提取。
近年也发展了许多新的分离、纯化方法，如薄层层析法、各种柱层析法、气相色 谱及高效液相色谱法等。
糖的定量分析方法也很多，有化学计量法如次亚碘酸法和非化学计量法如铜试剂法、 硝基试剂法等方法可供选择。
本实验主要介绍单糖、蔗糖及淀粉的分离提取、鉴定和测定的一般原理和方法。
实验原理1．单糖及多糖的提取单糖：凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。
单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。
由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。
而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。
因此单糖和双糖一般可用热水或乙醇将之提取出来。
多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。
在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有更复杂的生理功能，在动植物的生理活动中起重要作用。
多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。
因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。
样品中的蛋白质、色素等杂质可通过加入醋酸铅、氢氧化钡、铁氰化钾等清洁剂将之除去。
高效液相色谱法测定枣中糖类物质
２
ｔ
河北农业大学硕士论文
枣中含有三萜类化合物，据报道三萜类化合物对癌的抑制作用超过抗癌药物５．氟嘧啶。 枣中含有的三萜类化合物有山楂酸等‘’“，
大枣中含有达玛烷型皂甙，有抗疲劳的作用，能增强人的耐力。大枣中的黄酮类化合物 有镇静、催眠和降血压作用。大枣中的乙基－Ｄ．呋喃葡萄糖甙衍生物对５．羟色胺和组织胺有
河北农业大学 硕士学位论文 高效液相色谱法测定枣中糖类物质 姓名：赵仁邦 申请学位级别：硕士 专业：农产品加工及贮藏工程 指导教师：崔同
2003.5.1
河北农业大学硕士论文
摘要
研究了快速测定枣中糖类物质高效液相色谱法。枣样品经过烘干和粉碎后，用９５％的乙 醇提取，分为寡糖（含单糖）和多糖，寡糖直接进色谱柱测定，多糖经水解、中和、浓缩和 定容后，再进色谱柱测定。色谱泵为Ｐ２００ＩＩ高压恒流泵，检测器为Ｗａｔｅｒｓ ４５０示差折光检 测器，色谱柱为大连伊利特ＨＹＤＥＲＳＩＲ．ＮＨ２，柱温３５。Ｃ，检测池温度３５℃，流动相为乙腈： 乙酸乙酯：水＝６０：２５：１５，流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ，进样体积１０ ｕ Ｌ。结果表明，此方法测定各种 单糖的稳定性用相对标准偏差ＲＳＤ来表示，半乳糖３．１９％，果糖０．７５％，鼠李糖５．１３％，木 糖Ｏ．８９７％，阿拉伯糖１．７４％葡萄糖２．２１％蔗糖２．３４％，甘露糖４．１１％。测定各种单糖的 回收率为鼠李糖９６．２％，木糖９９．３％，阿拉伯糖９７．０％，果糖１１０％，甘露糖９７．５％，葡萄糖 ９７ ｏ％，半乳糖１１０％，蔗糖１１０％。用此方法测定的各种单糖的线性方程，鼠李糖 仁．３ ８７Ｅ．４＋７．５７Ｅ．５Ｘ，相关系数０．９９５，木糖ｒ＿１．４０Ｅ．５ ４－８．６７Ｅ．５Ｘ，相关系数０．９９６，阿拉 伯糖怍．１．２４Ｅ．５＋１．２３Ｅ．４ｘ，相关系数０．９９１，果糖ｒ－．２．７８Ｅ．４＋７．２０Ｅ．５Ｘ，相关系数０．９９７， 甘露糖ｙ＿－．１．９８Ｅ．４＋９．７７Ｅ．５儿相关系数Ｏ．９９９，葡萄糖ｐ．１ ７５Ｅ．４＋６．１５ Ｅ－５Ｘ，相关系数Ｏ．９９９， 半乳糖Ｙ－－Ｉ．９１Ｅ．４＋４．１０Ｅ．５Ｘ，相关系数Ｏ，９９９，蔗糖ｙ＿－５．６ＩＥ－５＋６．６０Ｅ一５Ｘ，相关系数０．９９９。 用此方法测定半红期的冬枣中各种单糖和双糖含量，鼠李糖：７．５５ｍｇ／ｇ；阿拉伯糖：９ ０９ｍｇ／ｇ： 果糖：２１２ｍｇ幢；葡萄糖：３６．３ｒａｇ／ｇ；半乳糖：２８．０３ｍｇ／ｇ；双糖（用蔗糖算）：２８５ｍｇ／ｇ。测 定组成多糖的单糖含量，鼠李糖为：１１．１ｍｇ／ｇ；阿拉伯糖：７．６５ｍｇ／ｇ；果糖：３６．６１ｍｇ／ｇ；甘 露糖：７．１４ｍｇ／ｇ；葡萄糖：１９．９ｍｇ／ｇ；半乳糖：２２ ２ｍｇ／ｇ。用此方法对不同发育阶段冬枣和 小枣的糖类的变化进行动态分析，发现糖的含量随着生长期而变化，在幼果期、白熟期、半 红期和全红期的各种糖的变化比较明显。在幼果期，果糖、葡萄糖和半乳糖含量比较高，自 熟期以后寡糖含量增高，而果糖、葡萄糖和半乳糖的含量先减少，再升高。
低聚果糖分析方法及其检测标准的探讨
低聚果糖分析方法及其检测标准的探讨低聚果糖（fructo-oligosacchrides，FOS）又名蔗果低聚糖、寡果糖或蔗果三糖族低聚糖。
近年研究发现，低聚果糖具有双向调节人体肠道微生态的功能，既能增加肠道内双歧杆菌的数量，又能同时抑制其他有害菌的生长[1-4]。
而且低聚果糖很难被人体消化吸收，是一种低能量的糖，不会引起肥胖[5]。
因此，低聚果糖成为近年来功能食品的研发热点之一。
目前检测低聚果糖含量的方法主要有纸色谱分离法、气相色谱法和高效液相色谱法[6]，其中，高效液相色谱法最为简便和准确。
但该法在实际使用中，包括国标规定的方法中，仍存在某些值得商榷的定性定量问题。
本文拟根据我们的研究结果与经验就这些问题进行初步的探讨。
1 材料与方法1.1 试剂与仪器乙腈（色谱纯），美国天地公司；果糖、葡萄糖、蔗糖，纯度≥98%，美国Sigma公司；低聚果糖样品、超纯水实验室制备。
FA1104电子天平，上海精天电子仪器厂；Waters 600 高效液相色谱仪，配Waters 2414示差折光检测器，美国Waters 公司；Waters synapt UPLC-Q-TOF质谱仪，美国Waters公司。
1.2 色谱条件色谱柱：Waters NH2 分析柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈/水=70/30；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。
1.3 UPLC-Q-TOF串联质谱条件(1) UPLC条件：色谱柱：Waters NH2 分析柱（4.6mm×200mm，3μm）；流动相：乙腈/水=70/30；流速：0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL。
(2) Q-TOF MS条件：质谱采用电喷雾电离源(ESI)，TOF离子飞行方式采用V模式。
四极杆质量扫描范围m/z 150~2000，一次扫描时间为0.1s，离子源温度100℃，脱溶剂氮气流速400 L/h。
低聚木糖的测定(高效液相色谱测定方法)
五．低聚木糖的测定(高效液相色谱测定方法)本方法适合食品中低聚木糖的含量的测定本方法检测限：食品中低聚木糖为0.10%。
（一）方法提要试样中的低聚木糖经提取后在氨基色谱柱上分离，根据保留时间定性，用蒸发光散射检测器测定低聚木糖的含量。
（二）仪器1. 高效液相色谱仪带SEDEX 75蒸发光散射检测器。
2. 超声清洗仪。
3. 天平（精确到0.001g和0.0001g）。
4. 微孔滤膜（PVDF 0.45 μm）。
（三）试剂1. 色谱用水（Millipore纯水器制备）。
2. 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸,加水溶解至100mL。
3. 亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。
4.木二糖对照品，Wako公司(纯度≥90%)。
5. 木二糖标准溶液（10.0mg/mL）：精确称取50mg木二糖用蒸馏水定容至5mL 容量瓶中，即得木二糖标准溶液。
（四）测定步骤1. 样品处理：①固体样品：取均匀样品1.0g(精确到0.1mg)于150ml锥形瓶中，加水30ml，超声20min，再加入乙酸锌溶液，亚铁氰化钾溶液各2ml，摇匀后，经滤纸过滤到50ml 容量瓶中，用水定容到刻度。
取此滤液通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
②液体样品：取均匀试样10mL(精确到0.1mL)置于150ml锥形瓶中，加水20ml，超声20min，再加入乙酸锌溶液，亚铁氰化钾溶液各2ml，摇匀后，经滤纸过滤到50ml容量瓶中，用水定容到刻度。
取此滤液通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
2. 标准工作曲线制作。
精密吸取木二糖标准溶液1.0 ml，5.0 ml，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，摇匀。
分别取10μL标准工作系列溶液进样分析，以测得的木二糖的峰面积，分别对木二糖的浓度绘制标准曲线。
3．色谱条件①色谱柱：Cosmosil Sugar D 氨基液相色谱柱 250 mm i.d.×4.60mm, 5µm ； ②流动相：色谱用水＋乙腈=22+78(V+V)；③流速：1.0mL/min ；④柱温：35℃；⑤蒸发光散射检测器：蒸发温度35℃，压力 3.5Bar ；4. 样品测定。
高效液相色谱法测定烟草底料中低聚糖的含量
Ｓ ｇ ｒＰ ｋ ６ ５ｍｍ ０ ｕ ａ ａ ｌ（ ． ３ ０ｍｍ，５ ｍ）ｗｉｈ １ ０ ｍＩ／ ｎ ｐ ｒ ｔｒａ ｈ ｂ ｌ ｈ ｓ ， ｏ ｕ ｔ ． ｍｉ ｕ ｅｗａ ｅ ｓｔ ｅ ｍｏ ｉ ｐ ａ ｅ ｃ ｌ ｍｎ ｅ
ｔ ｍｐｅ ａ ｕ ｅ ａ ｅ ｒ ｔ ｒ ｔ８５℃ ａ ｄ Ｒｅ ｒ ｃ ｉ ｅ Ｉ ｅ ｔ ｃ ｏｒ Ｔｈｅ ｑｕ ｎｔｆｅ ｎａ ｙ ｉ ｆｅ ｅ ｎａ ｔ ｄ ｒ ｎ ｆ ａ ｔｖ ｎｄ ｘ Ｄｅ ｅ ｔ ． ａ ｉｉｄ ａ ｌ ｓｓ ｏ ｘｔ ｒ ｌｓａｎ ａ ｄ ｃ ｌｂｒ ｔｏ ｕｒ ｅ ｓ ｕ ｅ ． Ｔｈｅ ｅ ｗｅ ｅ ｇ ｏ ｉ ｅ ｒ ｃ ｒ ｌ ｔｏｎ ｂ ｔ ｅ ｈ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔｏｎ ｆ ａｉ ａ ｉ ｎ ｃ ｖ ｓ ｗａ ｓ ｄ ｒ ｒ ｏ ｄ ｌｎ ａ ｏｒ ｅ ａ ｉ ｓ ｅ ｗｅ ｎ ｔ ｅ ｃ ｎ ｅ ｔ ａ ｉ ｓ ｏ ｔ ｒ ｅ ｓ ｇａ ｓ ａ ｄ ｔ ｅ ｒｃ ｒ ｈ ｅ ｕ ｒ ｎ ｈ ｉ ｈ ｏｍａ ｏｇ ａ ｉ ｅ ｋ ａ ｅ ｓ ａ ｄ ｔ ｅ ｃ ｒ ｅ ａ ｉ ｏ ｆｉ ｉｎｔ ｒ ．９ ９ — ｔ ｒ ｐｈ ｃ ｐ ａ ｒ ａ ｎ ｈ ｏ ｒ ｌ ｔｏｎ ｃ ｅ ｆｃｅ ｓ ｗｅ ｅ ０ ９ １—
关 键 词 ：高 效 液 相 色 谱 ； 草 底 料 ； 聚 糖 烟 低 中 图 分 类 号 ： Ｓ４ ２ １ Ｔ ５ ． 文 献标识 码 ： Ａ
蔗糖乳糖测定实验报告
一、实验目的1. 掌握乳糖和蔗糖的提取和分离方法。
2. 熟悉使用高效液相色谱法（HPLC）测定蔗糖和乳糖含量的原理和操作步骤。
3. 分析乳制品中蔗糖和乳糖的含量，了解其与食品质量的关系。
二、实验原理蔗糖和乳糖均为二糖，可以通过水解反应生成单糖，然后利用高效液相色谱法（HPLC）对其进行定量分析。
本实验采用酸水解法将蔗糖和乳糖水解成单糖，然后使用HPLC进行分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 乳制品样品- 蔗糖标准品- 乳糖标准品- 硫酸- 乙腈- 超纯水2. 实验仪器：- 高效液相色谱仪（HPLC）- 超纯水系统- 真空旋蒸仪- 电子天平- 恒温水浴锅- 移液器四、实验步骤1. 样品预处理- 称取一定量的乳制品样品，加入适量的超纯水，搅拌均匀。
- 将混合液过滤，收集滤液。
2. 水解反应- 向滤液中加入适量的硫酸，搅拌均匀。
- 将混合液转移至锥形瓶中，置于恒温水浴锅中，在60℃下水解一定时间。
3. 离心分离- 将水解后的混合液在离心机上离心分离，收集上清液。
4. 蒸发浓缩- 将上清液转移至真空旋蒸仪中，在50℃下蒸发浓缩至近干。
5. 定容- 向浓缩后的残渣中加入适量的乙腈，定容至一定体积。
6. HPLC分析- 根据仪器操作手册，设置HPLC分析条件。
- 将样品溶液注入HPLC仪，分析蔗糖和乳糖的含量。
五、结果与分析1. 标准曲线绘制- 根据实验结果，绘制蔗糖和乳糖的标准曲线，相关系数R²均大于0.99。
2. 乳制品中蔗糖和乳糖含量测定- 根据标准曲线，计算乳制品中蔗糖和乳糖的含量。
3. 结果讨论- 分析乳制品中蔗糖和乳糖的含量与食品质量的关系，探讨其在食品加工中的应用。
六、实验结论1. 本实验成功提取和分离了乳制品中的蔗糖和乳糖。
2. 通过HPLC法，准确测定了乳制品中蔗糖和乳糖的含量。
3. 本实验为乳制品中蔗糖和乳糖的检测提供了参考方法。
七、注意事项1. 实验过程中应注意安全操作，防止硫酸等腐蚀性试剂对人体造成伤害。
低聚糖质量要求 低聚木糖-最新国标
低聚糖质量要求第3部分低聚木糖1 范围本文件界定了低聚木糖的定义，规定了低聚木糖的技术要求、检验规则和标志、包装、运输和贮存要求，描述了相应试验方法，给出了分子式、结构式、符号的信息和产品分类。
本文件适用于以玉米芯、玉米秸秆为原料，采用蒸汽爆破法或高压蒸煮法，经酶解精制而成的低聚木糖的生产、检验和销售。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 191 包装储运图示标志GB 5009.3 食品安全国家标准食品中水分的测定GB 5009.4 食品安全国家标准食品中灰分的测定GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 7718 食品安全国家标准预包装食品标签通则GB/T 20882.2 淀粉糖质量要求第2部分：葡萄糖浆（粉）QB/T 2492 低聚糖通用技术规则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
低聚木糖xylo-oligosacchari de，XOS以木糖为主，由2～9个糖单元以β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖混合物。
4 结构式、分子式结构式分子式C5n H8n+2O4n+1，2≤n≤95 符号下列符号适用于本文件。
符号代表物名称XOS 低聚木糖XOS2-4木二糖、木三糖、木四糖之和 X2木二糖X3木三糖X4木四糖X5木五糖X6木六糖X7 木七糖、木八糖、木九糖6 产品分类按产品形态分：糖浆(L型)和糖粉(P型)。
按XOS含量分：XOS-95型、XOS-70型和XOS-35型。
7 技术要求原辅料要求原辅料应符合相应的标准和有关规定。
感官要求应符合表1的规定。
表1 感官要求理化指标应符合表2 的规定。
表2 理化指标8 试验方法本试验方法中，所有试剂除特殊注明外均为分析纯；用水应符合GB/T 6682中三级(含三级）以上的水规格。
超高效液相色谱-质谱法测定母乳中12种低聚糖
摘 要：建立母乳中12 种低聚糖超高液相色谱-串联三重四极杆质谱的定性及定量测定方法。母乳样品脱脂除 蛋白后经液相分离，通过质谱检测，最优梯度洗脱条件为：流动相A为10 mmol/L的甲酸铵溶液，流动相B为乙 腈；流速0.3 mL/min；柱温50 ℃；0～10 min，95%～75% B；10～15 min，75% B；15～20 min，75%～65% B； 20～21 min，65%～10% B；21～24 min，10% B；24～25 min，10%～95% B；25～35 min，95% B。12 种低聚糖 标准品标准曲线在设定质量浓度范围内线性良好（R2＞0.98），加标回收率在80.00%～120.00%之间，重复性和仪 器精密度（均用相对标准偏差表示）均小于10%。 关键词：低聚糖；母乳；超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱
80.00% and 120.00%. The repeatability and instrumental precision (expressed as elative standard deviations) were less than 10%.
Keywords: oligosaccharides; human milk; ultra-performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass
乳寡糖是母乳中主要营养成分之一，成熟乳中低聚 糖的质量浓度为7～12 g/L，初乳中的质量浓度更高，约 为24 g/L[1]。低聚糖又称寡糖，由2～10 个单糖通过糖苷 键连接而成，构成母乳的单糖主要有葡萄糖（glucose，
Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、岩藻糖（fucose， Fuc）、N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine， GlcNAc）和N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic， NeuAc）5 种，且母乳低聚糖均存在1 个由半乳糖和
糖类的研究方法
糖类的研究方法糖类的研究方法涵盖了多个层面，包括糖的结构分析、定量测定、生物学功能等。
以下是糖类研究的一些常见方法：1.红外光谱分析：通过红外光谱仪，可以对糖的分子结构进行分析。
不同的糖类在红外光谱上会显示出特定的峰，帮助确定其结构。
2.质谱分析：质谱分析可用于确定糖的分子量、分子结构和组成。
质谱仪能够将样品中的分子分解成离子，并测定这些离子的质量。
3.核磁共振（NMR）：NMR是一种用于确定分子结构的强大技术，可以提供高分辨率的信息。
在糖类研究中，常用于分析糖的立体化学和构象。
4.色谱法：气相色谱（GC）和液相色谱（HPLC）可用于分离和定量测定糖。
结合不同的检测器，如折光指数检测器（RI）、荧光检测器等，可以实现对糖的高灵敏度检测。
5.糖的定量测定：通过比色法、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法等，可以对糖的含量进行定量测定。
这对于食品、生物学和医学等领域的研究具有重要意义。
6.酶法：使用特定的酶对糖进行酶解，生成可测定的产物。
这种方法常用于测定血糖、葡萄糖等。
7.生物学功能研究：研究糖在生物学系统中的功能，包括糖对细胞信号传导、免疫系统、疾病等的影响。
这可能涉及细胞培养、动物实验等多种方法。
8.糖基化修饰研究：研究糖基化修饰对蛋白质结构和功能的影响。
这包括糖蛋白和糖核酸的研究方法。
9.生物信息学方法：利用生物信息学工具，分析和预测糖的生物学功能、代谢途径等。
糖类的研究方法通常需要结合多个技术手段，以全面了解糖的性质和功能。
研究的具体方法取决于研究者的研究目的和领域。
糖分析中TSK-GEL色谱柱的实际应用(中文)100805
Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.
15
食品中低聚乳果糖的样品前处理方法
无需脱脂、除蛋白类的样品（如：乳酸饮料、酸奶等）
1）液状样品 用10ml的容量瓶取5ml样品，通过乙醇定容至10ml。如果存在不溶物，离心后 取上清液作为样品。 2）半流动状或固体样品 ①取5g样品并加入15ml温水，超声水浴样品溶解后转移至25ml的容量瓶中并定 量。 ②离心后，取5ml上清液至10ml的容量瓶中，用乙醇定容至10ml 。如果存在不 溶物，离心后取上清液作为样品。
柱 温：60℃
进样量：20μl
检测器：RI
Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.
10
饮料中的单糖、二糖的分析实例（IEC法）
600
600
桃子饮料
蔬菜饮料
500
500
Glucose
Signal Int. (mV)
Sucrose Fructose
Sucrose
Signal Int. (mV)
IEC（离子交换）
Oapak, SCX(H), SCX(Na), SAX
500,000 1,000,000
G-Oligo-PW(for nonionic saccharide) G2500PWXL(for ionic saccharide)
SEC（分子尺寸排阻）
G3000PWXL G4000 PWXL G5000 PWXL G6000 PWXL, G-DNA-PW
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含有低聚乳果糖的食品分析实例（SEC法）
然后用阳离子交换预装小柱处理。 配制溶液：水/乙腈=15/85。
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液相色谱测定单糖与二糖和低聚半乳糖的方法研究
作者：车永进岳子贺戚克进
来源：《科技资讯》2017年第20期
摘要：目前有多种方法可以测定低聚糖中各种组分的含量，包括毛细管电泳定量分析、气相色谱法、薄层层析法]和高压液相色谱法，其中高压液相色谱法因操作方便、分析速度快而被广泛应用。
高压液相色谱法又根据检测器的不同分为：紫外可见光二极管阵列检测器检测（UV-DAD）、脉冲安培检测器定量分析、和示差折光检测器检测[等。
该研究采用高压液相色谱分析，示差折光检测器检测，尝试采用Zorbax Carbohydrate柱、Aichrom-NH2和Sugar Pak Ι三种色谱柱同时检测样品中的葡萄糖、乳糖和低聚半乳糖中三糖、四糖和五糖，确定最佳的色谱分析柱和色谱操作条件。
关键词：液相色谱测定单糖二糖低聚半乳糖
中图分类号：TH86 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）07（b）-0108-02
由于人体肠道内不具备分解消化低聚半乳糖的酶系统，因而低聚半乳糖在体内不能被胃酸和胃酶降解，故不能被消化吸收，而是直接进入小肠内被有益菌尤其是双歧杆菌利用，对人体发挥独特的生理功能，因此被定义为“益生元”，它能有效促进体内双歧杆菌的生长繁殖，改善脂质代谢，促进钙的吸收和维生素的合成，具有分解致癌物质、提高人体免疫力等功能。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
仪器：高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；电子天平AR3130（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；液相色谱柱分别为Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美国安捷伦科技有限公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美国Abel工业有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美国Waters公司）。
材料：葡萄糖、乳糖由美国sigam公司提供，低聚半乳糖（其中含半乳三糖、四糖和五塘）由烟台华海生物制品有限提供。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱柱的选择
各种糖组分的含量分析采用高效液相色谱法。
色谱系统为美国安捷伦公司提供的Agilent 1200，色谱柱分别为Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美国安捷伦公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美国Abel工业有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美国Waters公司）。
如果没有特别说明，则色谱条件为：G1362A 示差折光检测器，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温25 ℃，前面两种柱子采用乙腈与水的混合液为流动相，调整流动相组成使其达到最佳分离效果；Sugar PakⅠ的流动相为双蒸蒸馏水。
1.2.2 流动相组成的选择
流动相为乙腈与水的混合物，体积比分别为65∶35、70∶30和75：25，比较不同流动相组成对分离效果的影响。
1.2.3 洗脱流速的选择
洗脱流速分别为0.5、1和1.5 mL/min，比较不同的洗脱流速对分离效果的影响。
2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择
Zorbax Carbohydrate、Aichrom-NgH2、Sugar Pak Ι中的三种色谱柱都能够有效地分离低聚半乳糖中的各种组分，进行定性或定量测定。
但Sugar Pak Ι柱在使用一段时间后，柱效很快降低，可能是因为Sugar Pak Ι中的固定相为钙型阳离子交换树脂，低聚半乳糖样品中存在的少量阳离子（原料生产时缓冲溶液中的少量离子，或用少量NaOH调整 pH值时带入的钠离子）很容易将固定相树脂中的钙离子置换下来，不但严重影响测定结果的重现性，而且大大降低色谱柱的使用寿命，并且Sugar Pak Ι的价格约是另外两种柱子的3倍，因此，该研究中糖溶液不适宜用Sugar Pak Ι进行分析。
氨基柱Zorbax Carbohydrate 和Aichrom-NgH2价格相当，实验条件下分析低聚半乳糖混合物，Zorbax Carbohydrate柱比Aichrom-NH2出峰快，分析时间短，色谱柱的理论塔板数高。
虽然两种柱子对各种糖组分的选择性相差不大，但前者分离各种糖组分的分离度明显高于后者；采用Aichrom-NH2柱分析，只对葡萄糖和乳糖的分离度超过了1.5，其他各种糖组分之间的分离度都小于1.5。
因此氨基柱Zorbax Carbohydrate的分离效果更好，故该研究后面的实验都采用Zorbax Carbohydrate柱对低聚半乳糖进行定性和定量分析测定。
2.2 流动相组成的确定
色谱条件：Zorbax-Carbohydrate色谱柱（4.6×150 mm），柱温25 ℃，G1362A示差检测器，流动相流速1 mL/min，进样量20 μL，流动相为乙腈与水的混合物，体积比分别为
65∶35、70∶30和 75∶25，得到不同流动相组成对低聚半乳糖的分离效果。
随着流动相中乙腈含量的增加，流动相的非极性增强，各种糖组分在柱中的保留时间增加，分离度增大。
乙腈与水的比例为65∶35时，分析一个样品只需要7 min，流动相比例为75∶25时，分析一个样品需17 min。
但从上述结果可以看出，流动相比例为65∶35的选择性和分离度也最小，只有葡萄糖和乳糖之间的分离度大于1.5，其他各种糖组分之间的分离度都小于1.5，而流动相比例为70∶30和75∶25的分离度都远远大于1.5，并且分离度和选择性相差不大，而前者比后者出峰时间早，分析一个样品可以节约5 min，故确定最佳的流动相比例为70∶30。
2.3 流动相流速的确定
流动相的流速影响塔板高度，从而影响分离效果。
流动相流速太快，柱效降低，但流速太慢，又会因增加扩散而降低分离度。
该研究分别考察了流动相流速分别为0.5、1.0和1.5 mL / min的分离效果。
可以看出：流动相的流速越大，出峰越快，色谱峰越窄，分离的理论塔板数越多，同时选择性越小，分离度也越小。
但3个流速下的分离度均大于1.5，这表明各种糖组分都已完全分离。
相比之下，流速为1.0和0.5 mL/min时，其分离度和选择性均优于1.5 mL/min，而且柱压较低。
1.0和0.5 mL/min的分离度和选择性相差不大，而1.0 mL/min的出峰速度快，分析一个样品比后者要节约10 min，故取1.0 mL/min为最佳洗脱流速。
3 结语
根据色谱柱同时分离单糖、二糖和低聚半乳糖组分的分离度和选择性，以及色谱柱的价格和使用寿命，确定安捷伦公司的Zorbax Carbohydrate 柱可以很好地定性分析和定量测定单糖、二糖和低聚半乳糖混合物中各种组分的含量。
最佳的色谱分离条件为：采用示差折光检测器检测，流动相为乙腈与水的混合物，体积比70∶30；洗脱流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 μL。
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