李斯特氏菌的检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验操作规程
单核细胞增生李斯特氏菌测定1 提示1.1 注意无菌操作。
2目的用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的测定3检测依据《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌测定（GB 4789.30-2016）》。
4适用范围本法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的测定。
5试验材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1冰箱。
5.2 恒温培养箱。
5.3 均质器。
5.4 显微镜。
5.5 电子天平。
5.6 锥形瓶。
5.7 无菌吸管、微量移液器及吸头。
5.8 无菌平皿。
5.9 无菌试管。
5.10 离心管。
5.11 无菌注射器。
5.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。
5.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。
5.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。
5.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。
5.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金5.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。
5.18 小白鼠:ICR体重18g～22g。
5.19 全自动微生物生化鉴定系统。
6.培养基和试剂6.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):。
6.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):。
6.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):。
6.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:。
6.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:。
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析樊惠华，侯磊磊，方 莹，柴梅梅（榆林市食品检验检测中心，陕西榆林 719000）摘 要：为了提升食品检验检测机构对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力，提高微生物实验室外部质量控制水平。
本实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，参考参试指导书、《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）、海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪。
结果表明，参试样品编号21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，样品编号21-U887未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌，最终能力验证结果评价为满意，可见本实验室具有成熟的单核细胞增生李斯特氏菌检验能力。
关键词：乳粉；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Results and Analysis of the Proficiency Testing of ListeriaMonocytogenes in Milk PowderFAN Huihua, HOU Leilei, FANG Ying, CHAI Meimei(Yulin Food Inspection and Testing Center, Yulin 719000, China)Abstract: In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proficiency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 (2021) milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines, the GB 4789.30—2016, the complete biochemical identification tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes, and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes, which was identified as Listeria.ivanovii. The final proficiency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.Keywords: milk powder; Listeria monocytogenes; proficiency test李斯特菌属目前包括17种公认的短杆状革兰氏阳性菌，其中单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被认为是病原体[1]。
冻水产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验研究
１ 材 料 与方 法
１１ 仪器和 试剂 ．
ｂｖ Ｖｅ ａ ｄ ｓＬＭ０， ｔ ｅ ｒ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓ Ｌ． ｎ ｅ ａ． Ｌ． ｈ ｙ ｗｅ ｅ ｉ ｅ ｔｆ ｄ ａ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｗｅ ｓ ｈ ｍｅ ｉａ ｄ Ｌ．ｒ ｙ ， Ｓ ｔｉ ａ ｙ ｔ ｅ ａ ｓ ｓ— ｌｅ ｉ ｒ ｎ ｇ ａ ｉ Ｏ ｉ ｓ ｅ ｓ ｏ ｇ ｔｆ ｌｅ ｐｏ ｉ ｔｖ ｅ ｕ ｔ ｙＶｉ ａ ｉｅｒ ｓ ｌ ｂ ｄ ｓＬＭＯ ｅ ｅ ｔ ｎ ｄ ｔｃｉ ． ｏ Ｋｅ ｙｗｏ ｄ ｒｓ ｌｓｅ ｉ ｍｏ ｏ ｙｏ ｅ ｅ ｆｏ ｅ ａ ｕａｉ ｉｔ ｒａ ｎ ｃ ｔ ｇ ｎ ｓ； ｒ ｚ ｎ ｑ ｔｃ
阳 性 ， 经 鉴 定 为 李 斯 特 氏 菌 属 中 Ｌｉｎｃａ Ｌ ． ｏｕ、 ． ｎ
ｗ ｌ ｈｍｅｉ Ｌｇａｉ ｅ ｃｉ ｒ 和 ． ｙ，表 明 Ｖ ｄ ｓ ＭＯ检 测 试 剂条 ｓ ｒ ｉａ Ｌ
存 在一 定的假 阳性 率 。
关键 词
单核 细胞 增 生李斯特 氏菌 ；冻水 产 品 ；检
ａ ｕ ｔ ｒｄ ｃ ｒｍ Ｚ ａｊ ｎ ｉ ｒ ｔ Ｓ ｒｅｅ ｙ ｑ ａｉ ｐｏｕ ｔ ｆ ｈ ｎｉ ｇ ｄｓ ｃ． ｃｅｎ ｄ ｂ ｃ ｓ ｏ ａ ｔ ｉ
Ｖ Ｔ Ｋ ｉ ｍ ｎ ｉ ｎｓ ｃａｓｙｓｓ ｍ（Ｉ Ａ ） ｔｅ ＩＥ ｍ ｕ ｅｄａ ｏｔ ｓａ ｙｔ Ｖ Ｄ Ｓ， ｈ ｇ ｉ ｅ
验 ：污 染
Ａｂｓｒ ｃ Ｔｈ ｓ ｐ ｐ ｒ ｓｕ ｉ ｓｔ ｅ ｄ ｔｃ ｉｎ ｏ ｉｔｒａ ｔａｔ ｉ ａ ｅ ｔ ｄ ｅ ｈ ｅ ｅ ｔｏ ｆ Ｌ ｓｅ ｉ
ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
5.1常规原则
对于目前实验室操作，见ISO7218
注意2：因为培养基和试剂的数量较多，其经过了更可取的考虑。出于文章简洁的目的，在附录B中给出其组分和制备。
5.2 初级选择性富集培养基含降低浓度选择性试剂的Fraser培养液（半Fraser培养液）
见条款B.1
5.3含全浓度选择性试剂的选择性次级富集培养液（Fraser培养液）
见条款B.2
5.4选择性固体接种培养基
5.4.1第一个培养基：Oxford琼脂
见条款B.3
5.4.2第二个培养基：PALCAM琼脂
见条款B.4
5.5固体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂（TSYEA）
见条款B.5
5.6液体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物增菌液（TSYEB）
见条款B.6
5.7绵羊血琼脂
4.1应用含降低浓度选择性试剂的选择性富集培养液（半Fraser培养液）进行初级富集
对选择性初级富集培养液（包含1体积氯化锂和半体积吖啶黄以及萘啶酸—半Fraser培养液，也用作检验过程的稀释液）恒温培养，30℃24h；
4.2应用含全浓度选择性试剂的选择性富集培养液（Fraser培养液）进行次级富集
3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。
4.原理
在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图）
注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降低的抑制剂浓度，可以至少部分达到此目的。
8. 检样制备
单增李斯特氏菌检测详解优品文档
李斯特氏菌斜面和底层产酸，不产硫化氢。 monocytogenes
Listeria monocytogenes monocytogenes 每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。 VIDAS快速筛选（可选） 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）培养48h。 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。 菌落形态：24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环。 （设标准菌株对照）
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二 次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
鉴定
溶血试验 VIDAS快速筛选（可选）
协同溶血试验（cAMP）
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。
可代替硝酸盐还原、MR-VP、三糖铁、糖发酵、尿素酶和CAMP等试验。
英诺克李斯特氏菌 L. innocua
威尔斯李斯特氏菌 L. welshimeri
西尔李斯特氏菌 L. seeligeri
格氏李斯特氏菌 L. grayi
蓝 典 过 革 溶 动 尿 硝 MR
色型氧兰血力素酸∣
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析作者：彭怡许红玉黄厚强张曲来源：《中国食品》2024年第02期单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），简称为单增李斯特氏菌，是一种需氧兼性厌氧的食源性病原菌、革兰氏阳性短杆菌，广泛存在于自然界中。
其中，奶制品、肉制品、水产品、海产品、禽类食品、蔬菜等容易受到该菌污染，误食用含有该菌的新生儿、老年人等免疫力低者易患脑膜炎、败血症，孕妇则易发生早产或流产，致死率高达20%-30%，给食品安全造成严重威胁。
近年来，国内外关于单增李斯特氏菌的主要检测方法包括国标法、免疫学检测法、生物传感器检测法等，这些方法各有优缺点。
能力验证通过对实验室间的检验能力进行比对，评价参加者的能力，是证明实验室检验能力的重要方式之一。
资阳市食品药品检验检测中心生物检验科参加了由四川省食品检验研究院组织的“食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证”，采用国标法《GB 4789.30-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》第一法对样品进行定性检验。
一、材料与方法1.样品。
由四川省食品检验研究院提供3份单核细胞增生李斯特氏菌样品，每份样品包括一瓶白色球状西林瓶装和一袋质量约为25g的奶粉，样品编号分别为LM-029、LM-177和LM-307。
2.菌种。
单增李斯特氏菌ATCC 19115、斯氏李斯特氏菌ATCC 35967、伊氏李斯特氏菌ATCC 19119、英诺克李斯特氏菌ATCC 33090，均由广东环凯生物科技有限公司提供。
3.主要试剂。
脑心浸出液肉汤（BHI）、李氏菌增菌肉汤（LB1，LB2）基础、PALCAM 琼脂、李斯特氏菌显色培养基、SIM生化管、HBI单增李斯特氏菌生化鉴定条（GB），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；李斯特氏菌显色培养基、PALCAM琼脂、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、血平板、革兰氏染色液试剂盒、3%过氧化氢、单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒，购自北京陆桥技术股份有限公司。
李斯特氏菌检测方法介绍—科标检测
李斯特氏菌检测李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。
肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。
李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
科标检测在微生物检测领域拥有丰富的经验，可以针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析，为客户提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，保证产品质量安全，专业得到了国内、国际知名企业的广泛认可。
实验步骤1. 增菌培养将未开封的测试片贮藏在≤8℃的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。
在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。
取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。
取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。
2. 分离共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。
单增李斯特菌的检验方法
单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。
上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。
二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。
（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。
此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。
七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。
ISO李斯特菌
国标标准 ISO11290-1 1996（E）食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法1.范围2.参考标准3.定义4.原理5.培养基和试剂6.设备和玻璃器皿7.取样8.待检样品前处理9.程序10.结果表达11.检测报告附录：A.检测程序图B.培养基和试剂的组成和配制C.亨氏斜射光镜检食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法警告：为了保障实验室人员的健康，强烈推荐在适当装备、由有经验的微生物专家控制以及检测中的所有培养物得以谨慎处理的实验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是强烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的培养工作。
1.范围本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。
在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。
2.参考标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。
ISO6887：1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则ISO：1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则3.定义本部分ISO11290提供以下定义：3.1单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培养基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。
3.2单核增生李斯特氏菌的检测：依据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。
4.原理在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段（见附录A检测程序图）。
李斯特菌菌落特征
李斯特菌菌落特征引言李斯特菌（Listeria）是一类革兰氏阳性的细菌，可以引起食物中毒和严重的感染。
李斯特菌菌落特征是指李斯特菌在培养基上形成的特殊菌落，它们具有一定的形态学和生理学特征，为鉴定和检测李斯特菌提供重要依据。
本文将就李斯特菌菌落特征进行全面、详细和深入地探讨。
菌落形态特征李斯特菌菌落在培养基上呈现出多样的形态特征，可以通过观察菌落的大小、形状、色泽等特征来进行初步鉴定。
1.大小：李斯特菌菌落通常呈中等大小，一般直径为1-4毫米。
如果菌落过小或过大，可能是其他细菌的结果。
2.形状：李斯特菌菌落多呈圆形或不规则形状。
如果菌落形状呈现规则的圆形，可能是李斯特菌的迹象。
不规则形状的菌落可能是其他菌种。
3.色泽：李斯特菌菌落的色泽多样，可以是白色、黄色、灰色或淡黄色等。
如果菌落颜色发生明显变化，可能是其他细菌的结果。
菌落质地特征菌落的质地特征是指菌落在培养基上的触感和观察时的整体形态。
1.触感：李斯特菌菌落触感较软且稍湿润。
如果菌落触感硬或干燥，可能是其他菌种。
2.整体形态：李斯特菌菌落整体形态呈圆形或不规则形状，菌落边缘清晰。
如果菌落边缘模糊或呈现放射状生长，可能是其他菌种。
菌落生长特征菌落的生长特征是指菌落在培养基上的生长速度、形态变化等方面的表现。
1.生长速度：李斯特菌菌落通常具有较快的生长速度，一般在24-48小时内可以观察到明显的生长。
如果菌落生长缓慢，可能是其他菌种。
2.形态变化：李斯特菌菌落在生长过程中可能出现一些形态上的变化，如边缘的变化、凸起的变化等。
这些变化可以作为鉴定李斯特菌的辅助标志。
菌落气味特征李斯特菌菌落具有特殊的气味，这可以通过闻菌落的气味来初步判断是否为李斯特菌。
1.气味：李斯特菌菌落的气味通常被描述为霉味或放腐臭味。
如果菌落没有特殊气味，可能是其他菌种。
菌落的生理学特征菌落的生理学特征是指菌落在培养基上生长所需的特殊条件和与环境的相互作用。
1.温度要求：李斯特菌菌落能够在较宽的温度范围内生长，一般在2-45摄氏度之间。
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李斯特氏菌的检验
李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。
李斯特菌是1926年英国南
非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发觉的，为纪念近代消毒手
术之父、英国生理学家约瑟夫李斯特（1827～1912），1940年被第
三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
单核细胞增生李斯特氏
菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染
后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然
界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。
李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。
肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证明是李
斯特菌的感染源。
李斯特菌中毒严峻的可引起血液和脑组织感染，
许多国家都已经实行措施来掌握食品中的李斯特菌，并制定了相应
的标准。
其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。
单核细胞增生李斯
特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
试验步骤
1. 增菌培育
将未开封的测试片贮藏在8℃的环境下，并在包装上标示的有效
期内使用。
在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。
取回的样品应在4℃下处理、存放和运输，假如是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。
取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培育4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，连续培育20h和44h.。
2. 分别
共培育24h和48h后，取EB培育物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。
PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。
将OXA和PALCAM平板置于35℃培育24-48h，LPM平板在30℃培育24-48h。
然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照耀平板，通过目镜垂直向下观看查找可疑菌落。
李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。
用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对比。
已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。
加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。
在OXA平板上李斯特氏菌菌落四周有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。
李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相像。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别
划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。
食品检验中
在TSAYE平板上纯化是必需的，由于在PALCAM和OXA或LPM平板上
分别菌落时可能沾有不行见的受抑微生物。
挑取5个典型菌落的缘
由是一个样品中可能分别到一种以上的李斯特氏菌。
30℃TSAYE平
板培育24-48h，假如不用于动力观看，也可在35℃培育。
3. 鉴定步骤
为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。
将胶
带封好的测试片贮藏在低温干燥的地方，保持时间不超过1个月。
请勿将测试片放在温度25℃和(或)相对湿度50%的环境中。
1）观看TSAYE平板通过斜射光观看，查找呈兰灰至兰色菌落。
在TSAYE上用已知菌作对比。
2）从30℃或更低温度下培育的TSAYE平板上挑取典型菌落做成
湿玻片在油镜下观看。
湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。
假如
菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。
李斯特氏菌是细
短杆菌，可见稍微的旋转及翻滚。
与已知的李斯特氏菌的对比相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。
3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶试验，李斯特氏菌呈过氧化氢
酶阳性反应。
4）取16-24h的培育物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳
性杆菌。
但是陈旧培育物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。
在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉
菌而错判。
4. 用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。
潮湿采样设备
的液体应10 mL。
潮湿剂可以是无菌水、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和缓冲液，如Letheen肉汤或
Dey/Engley (DE)中和肉汤。
5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培育24h用做糖
类发酵和其它生化项目试验。
TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也
可反复接种。
6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂
平板上，刺种时避开触到平板底部和使琼脂裂开，同时设阳性对比（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对比（英诺
克李斯特氏菌），35℃培育48h。
单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小
的-溶血环。
7）在光明的光照下，观看经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生
李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清楚的-溶血环，英
诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显
的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反
应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。
8）硝酸盐还原试验（选做）。
用TSBYE肉汤培育物接种于硝酸
盐肉汤中，35℃培育5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试
剂B，混合，消失紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无
颜色消失，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如消失紫红色，表
明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。
只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，
因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必需进行这唯
一的试验。
本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加
入0.2mL试剂C，消失橙色表明硝酸盐已被还原。
如未消失颜色反应，也加入少量锌粉，若消失橙色表明硝酸盐未被还原。
5. 在无菌环境下在收集的样品中添加5 mL，20-30℃，灭过菌的
缓冲蛋白胨水(BPW)溶液。
不要将Petrifilm EL测试片与Vermont
培育基(UVM)、Fraser肉汤、李斯特菌增菌培育基 (LEB)或缓冲李
斯特菌增菌培育基(BLEB)共用。
9）将TSBYE培育物穿刺到SIM和MTM试管中，室温培育7天，
每日观看，李斯特氏菌呈典型伞状生长。
在MTM中伞状生长更典型。
同时，30℃的TSBYE培育物在油镜下可见细菌作翻转运动。
10）将TSAYE肉汤培育物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35℃培育7天，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气，李斯
特氏菌发酵鼠李糖和木糖的状况见下表。
全部李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。
假如在OXA、PALCAM或加七叶苷/Fe3 的LPM分别平板上菌落色素很
明显，则七叶苷试验可免做。
6. 混合，蠕动或旋转样品与BPW的混合液将近一分钟。
将样品置
于室温(20-30℃) 1h，最久不超过 1.5 h，以修复损伤的李斯特菌。
将TSBYE肉汤培育物接种到3mLTSBYE肉汤中，35℃培育24h，接
种2支TSAYE琼脂斜面，35℃培育24h。
用3mL0.01mol/l磷酸盐缓
冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min 离心30，弃去2mL上清夜，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。