(完整word版)Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）
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Western操作步骤
（一）蛋白样品制备
(1）单层贴壁细胞总蛋白的提取:
1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0。01M pH7.2～7。3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液.将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3。按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）
4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1。5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）
6。于4℃下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷)
7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液,按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的.本人是先用预冷的PBS（一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强)
（2）组织中总蛋白的提取:
1。将少量组织块置于1～2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎.
4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1。5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0。5ml 离心管中并置于—20℃保存。
（3)加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按(一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min.
2. 弃上清，加入4ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm 离心5min。弃上清后用PBS 重复洗涤一次。
3。用枪吸干上清后,加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4。将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存.
(二）蛋白含量的测定
（1)制作标准曲线
1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后,备用。
2。取18 个1。5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5。0μg ，10。0μg ，20。0μg ，40。0μg.
3。按下表在各管中加入各种试剂.
4。混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。
（2）检测样品蛋白含量
1。取足量的1。5ml 离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min 后即可用于测蛋白。
2。取一管考马斯亮蓝加0。15mol/L NaCl 溶液100 μl，混匀放置2 分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank 测空白样品。
3。弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2 次（每次0.5ml）,再用无菌水洗一次。
4. 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0。15mol/L NaCl溶液和5μl 待测蛋白样品，混匀后静置2min,倒入扣干的比色杯中按sample 键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2 次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
（上述方法只是一家之言,可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）
(三）SDS-PAGE 电泳
（1）清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
(2）灌胶与上样
1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶.（可以用1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）
2. 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶.灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶
沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可.然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度.操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）
3。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干.
4. 按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶.将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中.灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生.插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1~2 次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出.
5. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中.（冲洗的话个人感觉可以使用5ml 的针筒,当然操作不能太粗暴了）
6。测完蛋白含量后，计算含20—50μg 蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP 管中,加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl 样品)（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话50μl也是问题不大的)上样前要将样品于沸水中煮5～10min 使蛋白变性。（本人心得：可以使用PCR 仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了,同时在水中煮蛋白样品有下面弊端:1.EP管容易炸开，样品丢失；2。容易进水,使样品体积增加,超过电泳最大上样量) 7。加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡.将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染)（3）电泳：
电泳时间一般4~5 h，电压为40V 较好,也可用60V。（本人为了加快速度，浓缩胶时用80—100V 跑，到分离胶以后用150—200跑，结果也不错，总时间2h 左右)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas 的0441 和0671比较好,就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3 比较好，不要局限于此说明)。
(四）转膜
（1）转一张膜需准备6 张7。0～8。3cm 的滤纸和1 张7。3~8。6cm 的PVDF膜.切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜置于水上浸2 h 才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水)（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok 了,没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好)
（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起再垫于垫子上,注：个人感觉就垫1 张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心,胶很易裂，要用巧劲)除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破.小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡.膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。（转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通）(最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）
（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在
槽的一边放一块冰来降温。一般用60V 转移2 h 或40V 转移3 h。（1。实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块PVDF膜,以免转膜过头,因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了,第二张膜上还有蛋白质可以进行检测;对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点,一般80—100V,时间也要延长一点,开始最好也用两块膜, 特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的,最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4 度下12V 转膜过夜)（2.PVDF膜建议使用0.22μm 的小孔径膜,不容易转膜过头)（3。不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置,最好再摸个条件）（4. 转膜时电极方向注意是膜正胶负）
(6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用.（一般不需要做这步）
(五）免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体)
（1)将膜用TBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h.
（2）将一抗用TBST 稀释至适当浓度（在1。5ml 离心管中）;撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育1～2h 后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;再用TBS 洗一次，10min。
(3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h 后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min；再用TBS 洗一次，10min，进行化学发光反应。
（六)化学发光，显影，定影
（1）将A 和B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后,将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X—光片夹中.
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X—片, 用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm)；打开X—光片夹,把X—光片放在膜上，一旦放上，便不能移动,关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min 或5min，也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，
即刻终止显影。显影时间一般为1~2min(20～25℃），温度过低时(低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。（如果使用柯达的显影定影液，时间很快的,显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子，然后再放到定影液中进行定影，这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液)应注意的是:显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七)凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。Western—Blot 操作流程及个人心得体会(一）
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Western Blot原理
Western Blot是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。使用的探针是抗体,它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。Western的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器
高压锅、玻璃匀浆器、低温高速离心机、ASP—3700紫外光/可见光微量分光光度计、—20℃低温冰箱、稳压稳流电流仪、垂直式电泳槽、JY—系列半干式转移电泳槽、电热恒温培养箱、多用脱色摇床、杂交袋封口机、分析天平、pH值调节器、暗室红灯、压片暗盒、0.1~2。5µl /100µl/200µl/1000µl移液器
杂品与耗材
10µl/200µl/1000µl吸头；200µl/1000µl离心管;各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；0.22umPVDF 膜；3mm滤纸；吸水纸;乳胶手套；杂交袋;保鲜膜；搪瓷盘(〉20×20cm)；柯达X—OMAT BT胶片；玻璃棒;计时器；ddH2O
试剂
单去污剂裂解液、0。01mol/LPBS(pH7。3)、10％分离胶、4%浓缩胶、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl 溶液、2×（5×)SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10×丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
试剂配制
（一)母液
溶解后，用浓盐酸调pH 至所需点(见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存.
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
溶解后，分装于1。5ml 离心管中，-20℃保存。
溶解后,高压灭菌，室温保存。
溶解后，高压灭菌，室温保存。
50℃水浴下溶解，室温保存.如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后，仍可使用。
溶解后，4℃保存,保存时间为1 周.
(可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中,一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
溶解后，用浓盐酸调pH 至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
溶解后，用浓盐酸调pH 至6。8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。
溶解后4℃保存.使用时恢复至室温且无沉淀.
混匀后4℃保存。
（二)使用液
单去污剂裂解液（50mM Tris-HCl pH8。0、150mM NaCl、1％Triton X-100、100ug/ml PMSF）
混匀后4℃保存.使用时,加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml 裂解液加入1。74mg/ml
PMSF50μl）。
（一般实际用的比较多的其实是RIPA 裂解配方：50 mM Tris—HCl pH 7。4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1％Triton x—100、1％脱氧胆酸钠、0。1％SDS）
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为1 mM PMSF（1ml 裂解液加入1。74mg/ml PMSF100μl）。
(如果用TBST 进行洗膜的话，其实PBS 用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS 浓缩液即可，500ml 的浓缩液不到50 元，很方便）
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
高温灭菌后，室温保存。
溶解后-20℃保存.制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl 进行100 倍稀释成1mg/ml,—20℃保存. 10％分离胶和4％浓缩胶
加TEMED 后，立即混匀即可灌胶。
（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED 量加大，一般加至原来的2-3 倍,根据实验当时的温度适当调整）
还原型5×SDS 上样缓冲液(0。25 mol/L Tris•HCl（pH6.8），0。5mol/L二硫叔糖醇,10％SDS,0.5％溴酚蓝,50%甘油)
混匀后，分装于1。5ml 离心管中，4℃保存。
溶解后室温保存,此溶液可重复使用3~5 次。
(电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
(可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10 倍使用)
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3~5 次（此溶液最好保存在4 度冰箱,最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和SDS,然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和SDS等比较困难)
(可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用)
使用时将其稀释10 倍.
（可以配制成10×TBS 缓冲液进行保存，稀释10 倍使用)
混匀后即可使用，最好现用现配。
最好现用现配。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2—Mercaptoethanol，2％SDS，62。5mmol/L Tris•HCl pH6。8)
配制时,在通风厨内进行.4℃保存。可重复使用1 次.
配制时,上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存.使用时用自来水稀释至1 倍。(不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）
室温保存
（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液,上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右)
抗体
用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋(小商品市场购买，很便宜，可以多买一点，但是务必注意质量，千万不能漏,不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）.
化学发光试剂
分A 和B 两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce 或者Santa Cruz 的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤 一、蛋白样品制备 （1）细胞总蛋白的提取： 1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬 浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。 2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰 上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。（整个操作尽量在冰上进行，保持 低温。） 3、4℃下12000rpm离心15min。（提前开离心机预冷） 4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。 （2）组织总蛋白的提取： 1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织 尽量碾碎至无明显组织碎块。 3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保 存。 二、蛋白含量的测定 1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成 25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。 2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。 3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。 4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。 5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。 6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。 7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。 三、SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易 损伤玻璃板）。两面擦洗过后用蒸馏水冲洗干净，立于筐中晾干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在模具上准备灌胶。
Western_Blot操作步骤
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
western blot 操作步骤
Western blot protocol 一. sample preparation: 1．收细胞: 将4?c 离心机首先预冷至4?c ，10cm盘用15ml管，15cm盘用50ml 管，1000rpmx5min,弃细胞medium，以少量预冷PBS洗去残留medium，加入相应体积的PBS, 分两次刮下细胞 (optional: 此时细胞可以置于-80?c store); 2．2000rpmx5min，4?c； 3．去上清，每个样品加入裂解液500-600ul（10cm盘）裂解液（lysis buffer 同western blot, -20?c store, add protein inhibitor freshly），transfer到1.5ml的EP管中，冰上30min； 4． 12000rpm，15min，4?c； 5．收集上清，测浓度： 在Cuvett 中加入4ul样品+1ml protein assay solution（5×，用水稀释成1×），OD595nm测蛋白浓度， 二. SDS-PAGE制胶及电泳（1st day） 将大小玻璃板洗净，并用70% ethanol喷淋，以彻底洗净油渍； 将2块玻璃板擦净后，之间放置塑胶垫片，底部对齐，安装于固定架上，并将固定螺丝对称扭紧（越紧越好，这样胶才不会漏）； 将固定好的玻板架置于底座，下方放置垫片，并将两侧固定旋钮卡紧； 适当倾斜玻板架，以100% ethanol 注入2块玻板间，观察5-10分钟，是否漏胶； 确定不漏后，开始配制10%分离胶，其他浓度见分子克隆： 10%分离胶1块胶2块胶 H2O 11.9 23.8 30% Acrydelamide 10 20 pH 8.8 Tris-cl 7.5 15 10% SDS 0.3 0.6 10%AP(-20°c) 0.3 0.6 TEMED 0.012 0.024
完整word版,Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Western blot 一、实验目的 western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。 二、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、操作步骤
（一）样品处理 1培养的细胞： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 或收取细胞于EP管中加入适量的1×SDS，吹匀，100度5min,重复一次。1200rpm ,10min.取上清定量。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。 1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。 对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。) （二）配胶
WB步骤
Western blot 的详细操作步骤 一．蛋白样品的提取 1.先从-80°冰箱内取出sham 1d/3d组，SAH+PBS 1d/3d组，SAH+SP 1d/3d组， SAH+Tregs 1d/3d组脑组织样品(区分脑皮层，海马区)，并对这四种样品进行编号样品1,2,3,4,等脑组织在室温下复温后，用预冷的PBS将脑组织表面的血性物质冲洗掉，并用吸水纸吸掉组织表面多余的水分，然后分别把样品1,2,3,4放到预冷的培养皿1,2,3,4中，分别用眼科剪刀1,2,3,4将脑组织分别剪成一个大块以及几个小块。然后分别将样品1,2,3,4称重，每个脑组织样品秤取500mg(可变化)并分别装入2ml的预冷的EP管中，同时把匀浆器（编上编号）置于冰盒内预冷。 2.按照每250mg脑组织加入1ml的RIPA的比例加入对应量的RIPA于盛有脑组织的 EP管1,2,3,4中，同时按照裂解液：cocktail=1:500的体积比加入cocktail(我们有现成的试剂)（一种蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶降解蛋白），然后用眼科剪刀（注意：不同的样品用不同的剪刀，提前把剪刀编上号1,2,3,4）将脑组织剪碎，尽量剪的碎一点以利于下一步的匀浆。 注意：这一步的处理过程要在冰盒中进行以抑制蛋白质的降解。 3将已经剪碎的EP管1,2,3,4中的脑组织倒入对应序号的匀浆器1,2,3,4中，在冰上匀浆脑组织，直至匀浆液变得无颗粒（大致用30min，最少是1次/分钟，尽量多匀浆几次）。 4.匀浆结束后，用1ml的移液枪将匀浆好的脑组织匀浆液从匀浆器中转移到对应序号的 预冷的EP管1,2,3,4（提前将要用的EP管编上号1,2,3,4并置于冰上预冷）中.每个样品转移2ml样品匀浆液。 5. 先将盛有脑组织匀浆液的EP管配平(移液枪吸取等量)后，将其放入离心机内，4℃ 离心，18000 rpm 20min。 6. 用移液枪从分层后的液体中抽取上清液(大约吸取0.5-1ml)，并转移到在冰盒中预冷的另外4个EP管1,2,3,4中，保存上清于-80度冰箱内直至使用。 二，Western blot之蛋白定量（蛋白浓度测定） 采用96孔板法 （1.）试剂如下表配置 注意：样品BSA栏中加入稀释后的样品25ul，根据样品稀释倍数来决定PBS与原液的比例，最后保证加入的样品总体积达到25ul。
(完整word版)Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二） from 生物问问我的生物博客 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 (1）单层贴壁细胞总蛋白的提取: 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0。01M pH7.2～7。3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液.将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3。按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1。5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6。于4℃下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷) 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液,按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的.本人是先用预冷的PBS（一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强) （2）组织中总蛋白的提取:
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。 Western blot实验技术全攻略 第一步：制备样品 Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。 第二步：电泳分离蛋白质 将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。 第三步：转移蛋白质
将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。 第四步：阻断和孵育 将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。 第五步：检测和成像 将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。 下面是Western blot实验的详细操作步骤：
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤 蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。Western Blot基本步骤如下： 1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。前处理样本并测定蛋白质浓度。准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。 2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。 3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。使用电转印或半干转印设备进行转移。 4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。 5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。 7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。孵育时间需要优化。 8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。重复步骤6的清洗方法。 9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。等待信号产生并记录结果。测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。 10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。 以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。在实际操作过程中，需根据个别情况进行调整。
WesternBlot实验步骤
WesternBlot实验步骤 Western Blot实验步骤 Western Blot 操作步骤： （一）蛋白样品制备 选TRIZOL 法 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 g，2.5 g，5.0 g ，10.0 g ， 20.0 g ，40.0 g。 4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff） 上比色分析。 5、 （2）检测样品蛋白含量 1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置 30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 l，混匀放置2分钟可做为空白 样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。 3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。 4、取一管考马斯亮蓝加95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5 l待测蛋白样品，混 匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample检测样品。 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 l样品含的蛋白量。 （1）清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要 使两玻璃对齐，以免漏胶。） 2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时
western blotting的基本操作过程
western blotting的基本操作过 程 Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。 一、材料准备 在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。 此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。 二、电泳分离
Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。 将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。 三、转膜 将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。 加入转移缓冲液、荷载样品和过硫酸铵，启动转移。转膜电源把电流传递到电极板上，导致电子从内极板流向外极板。这个过程产生的电流足以推动带电粒子（即蛋白质）从凝胶中转移到聚氟乙烯膜上。由于膜具有不吸水的特性，其吸附的蛋白质能够保持原来的位置和形式。借助荧光染料可以对蛋白质进行原位成像，并进一步进行分析。 四、免疫分析
Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。
Western blot操作步骤及技巧
Western blot操作步骤及技巧 实验器材： 电泳及转膜设备、PVDF膜（0.2μM） 实验试剂： SDS凝胶配制试剂盒（碧云天）、SDS电泳缓冲液、转膜液（分干转及湿转）、蛋白Loading buffer、预染蛋白Marker、甲醇、PBST/TBST、脱脂奶粉、一抗抗体、二抗抗体、碱性磷酸酶显影液或ECL化学发光显影液、BSA、PMSF、细胞蛋白裂解液 实验步骤： 一、配胶（具体浓度选择根据所需检测蛋白分子量大小而定，常用10%） 1.将玻璃板洗净、用ddH2O冲洗、晾干； 2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP及TEMED使用前加入），避光存放于4℃， 可至少存放1个月，临用前取出室温平衡； 3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，可以使用ddH2O或者异丙醇封胶， 也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用ddH2O冲洗干净; 4.灌好浓缩胶插入梳子，待胶凝固拔除梳子。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两 遍以去除残胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 二、样品处理 1.悬浮细胞： a) 1.5 ml EP管或离心管收集细胞，2000rpm、3min去培养液后用温的PBS 洗1遍； b)离心尽量去除PBS，加入适量细胞裂解液（裂解液使用前按100-200：1 加入PMSF），冰上裂解30min,期间不间断振荡EP管，使细胞裂解充分； c)4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；
Westernblot操作步骤
Western blot 操作步骤 实验原理： Western blot，也称Western blotting、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 内参: WB过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照. 1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下）,那么这个体系就是存在问题的； 2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准； 内参名称分子量大小适用范围 beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞
GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒体 COXIV 16kDa 线粒体 TBP 38kDa 细胞核 实验步骤 一、蛋白样品制备(组织中总蛋白的提取） 第一步: 法（1）敲取0.07-0。1g组织+400—500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。 法(2)实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。 注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。 第二步：取出的样品放置冰上1—2h(中间混匀5—6次）直至裂解完全。 第三步：样品离心×2,取上清于新的EP管中。 (离心条件：13000rpm,4℃，30min）
Western Blot操作步骤
一、细胞蛋白的抽提 6孔细胞培养板中细胞培养液弃去，加入80ul 1×loading buffer，置冰上用刮刀刮匀，吸入EP管煮沸5min。冷却后12000rpm低温离心5min，上清分装冻存（27ul/支）。 二、Western blot 试剂配方 （一）母液 1、1 mol/L Tris.HCl pH HCl ml Tris 30.29g 7.4 17 水200ml * 7.5 16 浓盐酸调pH，完后加H2O定容至250ml. 7.6 15 8.0 10 2、10% SDS SDS 10g 水100ml 50℃水浴溶解 3、10% 过硫酸胺（AP） 过硫酸胺0.1g 水 1.0ml 4.℃保存,1周内使用. 4、1.5mol/L Tris.HCl（pH 8.8） Tris 45.43g 水200ml 浓盐酸调pH.至8.8，完后加H2O定容至250ml. 5、1.0mol/L Tris.HCl（pH 6.8） Tris 30.29g 水200ml 浓盐酸调pH.至6.8，完后加H2O定容至250ml. 6、30%聚丙烯酰胺 丙烯酰胺14.55g 甲叉双丙烯酰胺0.45g 水20ml 搅拌后加水到50ml 、棕色瓶４℃保存（１个月／更久）
7、20%Tween 20 Tween 20 20ml 加水至100ml，４℃保存. 8、TEMED 直接取用 9、G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg 95%乙醇50ml 磷酸100ml 加水至1000ml 注：乙醇先溶解，再加磷酸、水，混匀后过滤，４℃保存。 （二）胶的配制（现配） 10% 12%（常用） 分离胶（μl）5% 浓缩胶（μl） 水4000 3300 2700 30%丙烯烯酰胺3300 4000 670 1.5M Tris.HCl（pH 8.8）2500 1M Tris.HCl（pH 6.8）500 10% SDS 100 40 10% AP（最后加）100 40 TEMED（最后加） 4 4 步骤： 1、分离胶灌胶至离梳子下缘1cm左右，上覆水100~200μl，30~60min聚合； 2、用滤纸吸去水，配浓缩胶，灌入，插入梳子，注意赶净气泡，约30min聚合； 3、放入电泳液中，拔去梳子。 （三）上样缓冲液 2×loading buffer（2×SDS上样缓冲液）：0. 1mol/L Tris.HCl PH 6.8, 0. 2mol/L二 硫苏糖醇，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油 0. 5mol/L Tris.HCl PH 6.8（1. 0mol/L Tris.HCl pH 6.8对倍稀释） 1.0ml 二硫苏糖醇（DTT: MW 154.5）0.156g SDS 0.2g 溴酚蓝0.01g
(完整word版)western blotting实验操作步骤讲解
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A第一部分：蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项： 1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提 取方法或选择不同的试剂盒产品）； 2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂 等的选择）； 3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋 白酶和磷酸酶抑制剂）； 4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策 略）； 5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 方法的选择 ◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取； ◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。
Example 1： 实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下： 1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）； 2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需 的量，临用临配）； 3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分 裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。 4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。 注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。 5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。 具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。 6.分装并存于-80℃，避免反复冻融。 B 第二部分： 相关试剂的配制： 1.10%的SDS（戴口罩称取）： 称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。 2. 1.5M Tris/HCL（pH8.8） Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，室温下保存。
Western操作步骤
Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中
放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液