(完整word版)Western操作步骤
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。
Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。
前处理样本并测定蛋白质浓度。
准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。
2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。
接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。
开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。
3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。
使用电转印或半干转印设备进行转移。
4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。
一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。
5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。
根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。
通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。
7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。
封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。
孵育时间需要优化。
8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。
重复步骤6的清洗方法。
9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。
等待信号产生并记录结果。
测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。
10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。
以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。
整理)Western Blot 操作步骤
Western Blot目录Western Blot (1)一、所需试剂 (2)1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (2)2、电泳液（可回收使用2次）:配方见三 (2)3、电转液：配方见三 (2)4、TBST（4℃避光保存）：配方见三 (2)5、4X Laemmli样品缓冲液（-20℃保存） (2)6、10-180kda 蛋白marker（-20℃保存1年，4℃3个月） (2)7、转印 (2)8、封闭和孵育（均可用5%脱脂牛奶） (2)9、HRP发光液： (2)10、抗体： (2)11、蛋白印迹膜再生液 (2)12、其他： (2)二、具体步骤 (2)第一天： (2)1、灌胶 (2)2、配制电泳液、电转液各2L，配制TBST 1L（Tween 在需要使用时加入） (3)3、6孔板培养处理细胞（按处理细胞所需时间提前准备），提取蛋白 (3)第二天 (3)1、对蛋白样品进行定量以及配制上样量（包括marker直接20μl），将一抗复温。
(3)2、安装跑胶装置，去除梳子，上样，设置参数（根据目的蛋白大小确定）： (3)3、电转膜： (3)4、免疫杂交反应 (3)第三天： (3)5、显影（1cm2膜使用0.1mlHPR发光液） (3)三、各种配方及注意事项 (4)1、不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围： (4)2、不同浓度分离胶配方（其他见说明书）： (4)3、浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)配方： (5)4、电泳缓冲液配方： (5)5、电转缓冲液配方 (5)6、TBST配方 (5)7、试剂使用注意事项： (5)8、发光液的原理： (5)9、再生液注意事项 (5)一、所需试剂1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（1）30% Acr-Bis (29:1)（4℃避光保存）：Acr丙烯酰胺；Bis亚甲基双丙烯酰胺，两者人工聚合成聚丙烯酰胺。
（2）1M Tris-HCl, pH8.8（室温保存）：缓冲溶液，Cl-可作为前导界面，用于配制分离胶（3）10% SDS（室温保存）：十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，可以使蛋白非共价键打开，并结合在蛋白质分子上掩盖蛋白间的电荷差异（4）Ammonium persulfate (过硫酸铵AP)（配成10%溶液分装20℃保存）：该系统的引发剂，可以释放硫酸根自由基，使丙烯酰胺单体等断裂聚合城聚丙烯酰胺（5）四甲基乙二胺（TEMED）（4℃避光保存）：该系统的加速剂，在光照下裂解成自由基，加速聚合。
western实验步骤
WESTERN BLOT操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶：注意：Acrylamide（聚丙烯酰胺）剧毒，需戴手套操作。
1、将玻璃板用清洗剂洗干净后，自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗三遍（勿用酸泡）。
2、固定好玻璃板，配置分离胶溶液(10ml两板，一板可以减半配制)根据分子量选择相应浓度的分离胶。
3、用1000µl移液器吸取分离胶溶液，缓缓灌入夹缝中，勿产生气泡，每板大约4.5ml，灌完后再胶顶部加无水乙醇封闭。
4、待分离胶凝固（约40min）倒掉无水乙醇，用超纯水清洗三次，用滤纸洗掉多余水分。
5、配制浓缩胶溶液（10ml-四板量，两板可减半配置）。
6、灌浓缩胶，并插梳子。
7、室温聚合30-45min，将玻璃板固定于电泳槽内，倒入适量的1×电泳缓冲液，拔出梳子。
上样，电泳上样：20µl移液器逐个加样，（第一道加5×RSB小于4µl和Matker 4µl,空泳道加5×RSB 5µl）。
加适量1×电泳缓冲液，接好正负电极。
开始设置为90V恒压，观察marker的移动情况，尽量拉长自己感兴趣的区域，适时终止电泳。
转膜。
电泳：1、将建勇后的胶取出浸入转膜液，（注意胶方向，做好标记）摇床缓慢摇30min。
戴手套裁取PVDF膜(8.3×5.2cm)，甲醇浸透，倒掉甲醇，浸入转膜液中，至少5min。
将取下胶的玻璃板清洗干净2、用转膜液润湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层电极版上，将PVDF膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于PVDF膜上，不留气泡。
3、润湿另一张厚滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡。
4、盖上顶层电极板、接通正负极电源，15V(不超过25V )转印20min。
5、配封闭液。
◆杂交1、取出PVDF膜，和胶相邻面向上浸入封闭液置于摇床缓慢摇1hr以上。
2、倒掉封闭液，用洗膜液略洗一下，取15ml离心管，加入5ml杂交液。
Western操作步骤
Western-Blot 操作流程（一）组织中总蛋白的提取用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min,段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，）20-30s,每隔5min后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。
（二）BCA法蛋白含量的测定(1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
(3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。
(4)酶标仪测定OD值。
(5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。
（三）稀释蛋白及蛋白变性如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。
（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。
（四）制作SDS电泳胶⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。
⑵配置10%的分离胶配方：H2O2 4.0ml30%丙烯酰胺液 3.3ml1.5mol/l Tris （ PH8.8）2.5ml10%SDS 100ul10%过硫酸胺 100ulTEMED 4ul⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。
⑷制备5%的浓缩胶配方；H2O2 3.4ml30%丙烯酰胺液 0.83ml1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml10%SDS 50ul10%过硫酸胺 50ulTEMED 5ul(5)将所剩余空间加满浓缩胶，迅速将梳子插入浓缩胶中，室温放置约10min，待浓缩胶凝固后，轻轻将梳子拔出。
Western Blotting操作指南
Western Blot 操作指导一：蛋白提取1、组织蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5ml EP管（最好高温高压处理）、一个大冰盒、一个1.5ml EP管盒、手套、眼科剪（最好高温高压处理）、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、两套研磨棒（最好高温高压处理）、掌上离心机、滤纸、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、2×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、震荡器、泡沫板。
2）操作步骤：a.制冰机制冰；b.标记笔将两套EP管做好标记；c.将大冰盒、EP管盒装上冰，一套标记笔做好标记的EP管放置于大冰盒中，另一套标记笔做好标记的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，带上EP管盒、眼科剪剪取黄豆大小（约100mg）新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织；d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1ml PBS，眼科剪剪碎组织（动作快），掌上离心，弃上清，再往EP管中滴加1ml PBS，研磨棒研磨，3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体，估算EP管中沉淀物体积，以上步骤尽可能在冰上操作；e.从4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍体积的三去污裂解液（一般为5倍）,再加入PMSF （二者比例为94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分钟），以上步骤均需在进行；f.离心机预冷，将充分裂解后的组织液4 ℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好2×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，将离心后的上清液用移液枪定量吸至另一套EP管中（勿吸掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i. 将泡沫板用镊子取出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。
Westernblot实验操作步骤
Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
3.37度，温箱中孵育30min。
western操作详细程序
Western blot详细步骤一、电泳1、Marker点0.8微升，72KD显红色，其它显蓝色2、100V,恒压——140V恒压，1.5h, 15%的胶，将溴酚蓝跑到外面，让带分开点。
3、转膜： PVDF膜从下到上依次是：黑板、海绵垫，两层滤纸，胶，PVDF 膜，两层滤纸，海绵垫，白板4、根据Marker把多出来的胶切掉节省。
留下14—72之间，将海绵垫与板用水洗，泡于Western转膜buffer中，剪取和脚大小合适的滤纸和膜，膜剪好后放在无水甲醇中浸泡2分钟，将滤纸润湿，两层滤纸放于海绵垫上，赶尽气泡，再铺两层滤纸，压紧夹子。
放于电转膜槽中，加冰盒，将wenstern转膜buffer倒入槽中，加满，放入4度冰箱中，100V1h, western转膜buffer可重复使用5次。
5、将膜放入封闭液中（5%脱脂奶粉，用PBS缓冲液配置）45min摇。
6、用PBST液洗膜2次，每次2min，摇（将500微升吐温20加到1000微升PBS 溶液中）将脱脂奶粉中的蛋白洗掉。
7、加一抗 Anti-His（我做的是抗His，要根据自己的蛋白选择）根据抗体说明书配置抗体稀释液，用PBS稀释，用塑料膜封膜加抗体缓冲液，封袋1.5小时反应，摇。
PBS一般PH为7.2，一抗可多次使用，直到有异味产生，可持续一个月，使用3、4次，因为比较贵，为得到较好效果，可向旧抗体缓冲液不加新液，为长久保存，可加叠氮钠，但使抗体不易结合。
脱脂奶粉可多次使用，一般为两天。
8、洗膜，4次，每次两分钟，PBST.9、加二抗，（羊抗鼠）封于小袋中摇45分钟，（二抗用辣跟过氧化物酶标记）10、PBST洗脱4次，摇11、在桌子上铺保鲜膜，将PVDF膜防御保鲜膜上，向膜上加A,B混合底物，反应1-2min，吸干底物，用保鲜膜将PVDF膜包好，放入曝光版中。
12、进入暗室操作，将胶压在膜上曝光2min（如果不行，加长曝光时间2-30min）将胶片放入显影液中2min-3min,用水漂洗一下，放入定影液2-3min（手套操作）定影液都是商品粉剂，后调配而成。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）人工肝实验室学习姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。
2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。
共洗三次，每次十分钟。
3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。
4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。
（可不做）5、4℃，12000转离心10min。
6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。
（2）组织中总蛋白的提取：1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。
冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。
3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。
2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。
3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。
4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。
5、37℃水浴30min。
6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。
7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。
（三）SDS-PAGE电泳：（1）清洗玻璃板（2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
Western 步骤
Western blot规范化操作步骤1、主要试剂配制2、操作步骤（1）细胞总蛋白提取1）收集细胞，冰预冷PBS洗两遍2）加入适量细胞裂解液（50-100uL），涡旋混匀冰上放置5min3）超声破碎细胞（程序化）4）超声后，在4℃，12000rpm离心10min。
收集上清，即为总蛋白裂解物（2）检测蛋白浓度1）使用BCA法检测蛋白浓度2）调整样品浓度一致3）加入蛋白4×loading buffer，煮沸20min，冷却后-20℃保存（3）SDS-PAGE电泳根据目的蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶（根据图1确定分离胶浓度），5%的浓缩胶，蛋白上样量一般为25-40ug（根据目的蛋白表达水平调整上样量）。
电泳以恒压进行，浓缩胶电压80V（约30min），待蛋白进入分离胶后，改变电压至120V。
待溴酚蓝行进至分离胶下缘时停止电泳（1-1.5h）。
（4）湿式转膜1）电泳结束前准备合适大小的PVDF膜（甲醇浸泡2-3min，活化正电基团，肉眼观察膜表面无白色点状或块状区域存在后，置于电转缓冲液至少15min待用）或硝酸纤维素膜（NC膜，浸泡于蒸馏水10min，平衡离子强度）。
准备适合大小的滤纸浸泡于电转缓冲液备用。
电泳结束后，小心撬开玻璃板，用切胶器将上层浓缩胶剥去，将凝胶转移至电转缓冲液中。
2）在电转缓冲液中按照以下顺序制作三明治:海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵（厚海绵，压缩滤纸上下各一块或薄滤纸上下各3层，电转板白色部分在下方），对齐，用玻璃棒赶走气泡。
3）将电转板放入电转槽中(黑色对着黑色面)，浸泡在电转缓冲液中，冰浴中以200mA恒流电转2h（分子量较大的可以延长转移时间）。
电转结束后，将PVDF 膜（或NC膜）放在丽春红染液中染色3-5min，观察蛋白转移情况后，根据蛋白大小在合适位置剪膜（在一抗孵育前，勿把膜完全分离），然后用TBST缓冲液将染料洗去。
（5）封闭将PVDF膜（或NC膜）置于封闭液中（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液），室温晃动1h（85rpm。
Western Blot 操作步骤(优化后)
Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
用前用酒精干燥。
2灌胶与上样：(1)、玻璃板对齐，放好胶条，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）(2)、配分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用枪吸取胶沿玻璃注入，待胶面升到中间线偏高时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）(3)、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（约30min）。
胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)、配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部，以去除未聚合的丙烯酰胺，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板。
）(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5ml离心管中，加入一份4×SDS和3份蛋白样品。
上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
（在缓冲液中加样。
）(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。
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Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）from 生物问问我的生物博客Western操作步骤（一）蛋白样品制备(1）单层贴壁细胞总蛋白的提取:1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0。
01M pH7.2～7。
3)。
平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。
重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液.将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3。
按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5。
裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1。
5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6。
于4℃下12000rpm 离心5min。
(提前开离心机预冷)7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液,按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的.本人是先用预冷的PBS（一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强)（2）组织中总蛋白的提取:1。
将少量组织块置于1～2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。
然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎.4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1。
5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0。
5ml 离心管中并置于—20℃保存。
（3)加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按(一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min.2. 弃上清，加入4ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm 离心5min。
弃上清后用PBS 重复洗涤一次。
3。
用枪吸干上清后,加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4。
将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存.(二）蛋白含量的测定（1)制作标准曲线1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后,备用。
2。
取18 个1。
5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5。
0μg ，10。
0μg ，20。
0μg ，40。
0μg.3。
按下表在各管中加入各种试剂.4。
混匀后，室温放置2min。
在生物分光光度计上比色分析。
（2）检测样品蛋白含量1。
取足量的1。
5ml 离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min 后即可用于测蛋白。
2。
取一管考马斯亮蓝加0。
15mol/L NaCl 溶液100 μl，混匀放置2 分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank 测空白样品。
3。
弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2 次（每次0.5ml）,再用无菌水洗一次。
4. 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0。
15mol/L NaCl溶液和5μl 待测蛋白样品，混匀后静置2min,倒入扣干的比色杯中按sample 键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2 次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
（上述方法只是一家之言,可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）(三）SDS-PAGE 电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
(2）灌胶与上样1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶.（可以用1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）2. 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶.灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可.然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度.操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。
）3。
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干.4. 按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶.将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中.灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生.插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1~2 次就行了，不补胶问题也不大）。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出.5. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中.（冲洗的话个人感觉可以使用5ml 的针筒,当然操作不能太粗暴了）6。
测完蛋白含量后，计算含20—50μg 蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至200μl的EP 管中,加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl 样品)（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话50μl也是问题不大的)上样前要将样品于沸水中煮5～10min 使蛋白变性。
（本人心得：可以使用PCR 仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了,同时在水中煮蛋白样品有下面弊端:1.EP管容易炸开，样品丢失；2。
容易进水,使样品体积增加,超过电泳最大上样量) 7。
加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡.将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染)（3）电泳：电泳时间一般4~5 h，电压为40V 较好,也可用60V。
（本人为了加快速度，浓缩胶时用80—100V 跑，到分离胶以后用150—200跑，结果也不错，总时间2h 左右)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas 的0441 和0671比较好,就是有点贵。
一般要让目的条带跑过分离胶的1/3 比较好，不要局限于此说明)。
(四）转膜（1）转一张膜需准备6 张7。
0～8。
3cm 的滤纸和1 张7。
3~8。
6cm 的PVDF膜.切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的PVDF膜置于水上浸2 h 才可使用。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水)（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok 了,没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好)（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3)将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起再垫于垫子上,注：个人感觉就垫1 张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
（撬时一定要小心,胶很易裂，要用巧劲)除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破.小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡.膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
（转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通）(最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60V 转移2 h 或40V 转移3 h。
（1。
实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块PVDF膜,以免转膜过头,因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了,第二张膜上还有蛋白质可以进行检测;对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点,一般80—100V,时间也要延长一点,开始最好也用两块膜, 特别是务必注意加强降温措施。
当然转膜是要摸条件的,最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。
如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4 度下12V 转膜过夜)（2.PVDF膜建议使用0.22μm 的小孔径膜,不容易转膜过头)（3。
不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置,最好再摸个条件）（4. 转膜时电极方向注意是膜正胶负）(6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用.（一般不需要做这步）(五）免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体)（1)将膜用TBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h.（2）将一抗用TBST 稀释至适当浓度（在1。
5ml 离心管中）;撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育1～2h 后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;再用TBS 洗一次，10min。