牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立
Taqman三重实时PCR快速检测原料乳中致泻性大肠埃希氏菌
张红宇 ，孟祥晨 ，姜 博 ，张伟钦
（ 乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，哈尔滨 １０ ３ ５０ ０）
摘
要：建 立可对原料乳 中致 泻性 大肠埃希 氏茵（ 包括肠致病性大肠埃希 氏茵 、肠侵袭性大肠埃希 氏茵和肠
产毒性 大肠埃希 氏茵） 同时进行快速检测的 Ｔｑ ａ ａｍ ｎ三重 实时 Ｐ Ｒ方 法。以致 病菌 中常见 的 ｅ 、ｉａ Ｃ ｐ ｎ和 Ｉ基 因 ｔ
ｐｏ ｕ ｉｉ ｆ ｈ ａ ｍａ ｒ ｌ ａ－ｍｅＰ ｓ ａ ｓｗｅｅｓｕ ｉｄ ａ ｄｄａｒｅ ｃ ｌ ｉ ８ｒｗ ｍｉ ｒｄ ｃ ｌ ｏ ｅＴ ｑ ｎｔｉ ｅ ｒ ｌｉ ＣＲ ａ ｓ ｙ ｒ ｔｄｅ ． ｎ ｉｒ ａ Ｅ ｏｉ ｎ３ ａ ｌ ｂｉ ｙ ｔ ｔ ｐｘｅ ｔ ｈ ｋ
为 目的 片段 ，选择 ３种 特 异 性 引 物 和 Ｔ ｑ ａ 针 进 行 三 重 实 时 Ｐ Ｒ 扩 增 ，研 究反 应 的 特 异 性 、 检 测 限和 重 复 ａｍ ｎ探 Ｃ
性 ，并用所建立的方法对 ３ 份 原料 乳进行检 测。结果表 明 ，扩 增曲线形 态 良好 ，对原料 乳 中其他常见致病菌无 ８
Ｚ Ａ Ｇ Ｗｅｑｎ（ｅ ａ ｏａ ｒ ｆＤ ｉ ｃ ｎ ｅ Ｍｉｓｒ ｆＥ ｕ ａｉ ， ｏ ｄＣ ｌｇ ， ｏｔｅ ｓ Ｈ Ｎ ｉ Ｋ ｙＬ ｂ ｒｔ ｙｏ ａｒ Ｓ ｉ ｃ ， ｎ ｔ ｏ ｄ ｃ ｔ ｎ Ｆ ｏ ｏｌ ｅ Ｎ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｙ ｅ ｉｙ ｏ ｅ ｈ Ａ ｒ ｕ ｕａ Ｕ ｉ ｒｉ， ａｂｎ１ ０ ３ ， ｈｎ ） ｇｉ ｌ ｒｌ ｎ ｅｓｙ Ｈ ｒｉ ０ ０ Ｃ ｉ ｃｔ ｖ ｔ ５ ａ
交叉 反 应 ，对含 致 病 菌 为 １ｃ ・ 的 乳 样 经 ２ｈ增 菌 处 理 后检 测 结 果 呈 阳 性 ，对 原 料 乳 样 重 复 性 检 测 的 Ｃ ｆ ｍＬ ｕ Ｖ值 均小于 ５ ％。 完成 全部 检 测 过 程 只 需 大 约 ６ｈ 该 方 法 快 速 准 确 ，可应 用 于原 料 乳 中致 泻 性 大 肠 埃 希 氏 菌 的 快 速 。
环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展
１／２—１／３。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度 进行判断是否发生反应。ＬＡＭＰ技术具有高特异性、 高效率和便捷等特点１４１。 １．２引物设计ＬＡＭＰ引物的设计比常规ＰＣＲ要 复杂。一个反应至少包括４条引物，包括一对内引物 （ＦＩＰ和ＢＩＰ）和一对外引物（Ｆ３和Ｂ３）；外部引物限 定了扩增片段的大小范围，同时也为内部引物提供 了模板，如果再增加一对环引物（１００ｐ ｐｒｉｍｅｒ），会明 显加快等温扩增的速度，大大提高检测效率，检测率 比没有加环引物的高７个数量级１５，６１。国外已建立
６１
要的食源性致病菌，感染导致肠炎疾病，发病率呈逐 年上升趋势。副溶血性弧菌致病因子是其携带的ｔｄｈ 和ｔｄｌ编码毒力基因，采用常规检测方法无法解决风 险监测和评估。徐芊等“７首次报道了利用ＬＡＭＰ技 术检测副溶血性弧菌，针对副溶血性弧菌不耐热溶 血素基因（ｔｌＩＩ）设计４条特异引物进行ＬＡＭＰ扩增， 对扩增反应进行优化，最佳反应时间为６０ｍｉｎ，反应 温度为６０℃，特异性为１００％，且副溶血性弧菌基因 组ＤＮＡ和纯培养物的检测灵敏度分别为９０ｆｇ和 ２４ｃｆｕ／ｍＬ，对模拟样品检测，检测限为８９ｃｆｕ／ｇ，整个 过程ｌ小时能完成检测。 ２．５阪崎肠杆菌检测２００２年国际食品微生物标 准化委员会（ＩＣＭＳＦ）把阪崎肠杆菌列为“严重危害 特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影 响”致病菌［１８１，该菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌 血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗留严重的神经 系统后遗症，死亡率２０％一５０％Ｉｔ９ Ｊｏ贺楠等∞参照 阪崎肠杆菌标准株（ＡＴＣＣ５１３２９）１６ＳｒＲＮＡ基因设计 ４条特异性引物。方法最低检测限可达到 ０．３ｐｇＤＮＡ，当稀释度１０５时才检测不到扩增产物，而 ＰＣＲ方法稀释度１０２时就检测不到扩增物。而胡莲 霞ｍ１则以１６Ｓ。２３Ｓ ｒＲＮＡ间区序列作为靶序列，采 用带有２条环引物（ＬＦ和ＬＢ）的改良ＬＡＭＰ方法检 测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，灵敏度为 ０．１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉 的检出限为１．１ｅｆｕ／ｇ，而对照ＰＣＲ方法检测阪崎肠 杆菌的灵敏度为１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的 婴儿配方奶粉的检出限为１ １００ ｃｆｕ／ｇ，改良ＬＡＭＰ 方法比较ＰＣＲ方法，其灵敏度提高了ｌ ０００倍，检测 耗时仅为ｌ～３ｈ。 ２．６金黄色葡萄球菌检测 金黄色葡萄球菌是一 种常见的致病菌，导致感染性疾病是其产生的肠毒 素造成的，且耐药性金黄色葡萄球越来越广泛。申 建维等勉荆用多重ＬＡＭＰ法同时扩增金黄色葡萄球 菌耐药基因ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ，在反应过程中，两种分子 信标荧光探针分别与ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ基因的扩增产物 序列互补结合，最后检测反应管中的两种荧光值。 结果显示该方法的检测下限为１０ｃｆｕ／ｍＬ，与传统的 Ｍ２Ｈ培养基苯唑西林药敏实验结果比较，灵敏度为 ９９．９％，特异度为９０．９％。适用于直接快速检测临 床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 ２．７单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李 斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致 病菌，ＷＨＯ已将其列为２０世纪９０年代食品中四大
多种食源性致病菌快速检测方法
多种食源性致病菌快速检测方法作者：刘晓来源：《食品界》2016年第08期食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，每年向卫生部上报的食物中毒人数逐年递增，且大部分是由食源性致病菌引起的。
据世界卫生组织估计，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。
由此可见，食源性疾病与食品污染问题已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题。
因此，建立科学、准确、全面的食源性致病菌检测体系，是保障食品安全的重要手段，对预防和控制微生物性食物中毒事件起着重要的作用。
目前对这些食源性致病菌的检测，主要依靠常规的细菌学培养方法，一般需4～7d，操作繁琐，费时耗力，检验的准确度不高，在检测速度、敏感性与特异性等方面也有局限性。
随着微生物学的快速发展，食品微生物学检验中引入了越来越多的新技术，有关食源性致病菌检测的免疫磁性分离法、酶联免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛的应用其中以高通量、灵敏、特异、适用范围广和低成本为特点的快速检测方法受到越来越多的关注，而在这些方法中又以DNA检测为基础的各种分子生物学方法应用尤为广泛。
同时，常规培养检测方法、基于免疫反应的检测方法等检测手段也在进一步地完善和改进。
本文通过探讨目前常用食源性致病菌检测方法，对不同方法的优缺点进行阐述和分析。
常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，食品中致病菌的常规培养检测方法灵敏、稳定、准确，并且检测结束后可获得目标致病菌，供后续研究，例如通过对从污染食品中检出的致病菌和从临床病人中分离的致病菌进行分析比较，并结合流行病学调查，可以揭示污染食品和病人之间是否存在关联，即是否是由于食用了污染食品而导致的临床病例的出现，从而为食品安全预警提供实验室的支持。
正是由于这些优点，所以截至到目前，世界上很多国家仍将常规培养检测方法列为食品微生物检测的金标准，例如我国的国家标准GB4789食品微生物检测系列，美国食品药品管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）的细菌分析手册（BacteriologicalAnalyticalManual，BAM）等等。
3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立
3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。
选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。
通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。
用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。
关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。
该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。
许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。
常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。
有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。
另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。
因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。
为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。
随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。
PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。
生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制
生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制生牛奶是一种营养丰富的饮品，但是由于其含有丰富的营养物质和水分，使得它成为微生物生长和繁殖的理想介质。
必须采取有效的方法来控制生牛奶中的微生物，以确保其安全性和质量。
本文将介绍生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制措施。
1. 细菌生牛奶中的细菌可分为好氧菌、厌氧菌和嗜冷菌。
好氧菌包括乳酸菌、酵母菌和霉菌等，它们在常温下就能生长繁殖，对牛奶的质量有直接影响；厌氧菌会在贮藏和加热过程中大量繁殖，造成牛奶变质；嗜冷菌则在低温下能够生长，甚至在冷藏条件下也难以被彻底消灭。
2. 病原微生物生牛奶中可能存在的病原微生物包括沙门氏菌、霍乱弧菌、变形杆菌等，它们会对人体健康造成危害。
1. 好氧菌总数检测好氧菌总数是评价牛奶卫生质量的一个重要指标，通常采用平板计数法进行检测。
具体操作步骤如下：- 取少量样品，加入平板计数培养基中，均匀涂抹在培养基表面。
- 将培养皿倒置，放入恒温箱中，培养时间为24-48小时。
- 经培养后，统计菌落的数量，计算出好氧菌总数。
2. 乳酸菌检测乳酸菌是一种益生菌，但也有一些乳酸菌会引起牛奶变质，因此需要进行检测。
目前常用的方法包括PCR法、荧光显微镜法和光学显微镜法等。
病原微生物的检测通常需要专业实验室进行，采用培养法、PCR法等技术进行检测。
1. 严格控制生产和加工环节生产和加工过程是控制牛奶微生物的关键环节，必须严格遵守相关的卫生标准和操作规程，保持生产设施和设备的清洁卫生，确保原料的卫生质量。
2. 严格控制储存和运输条件牛奶在储存和运输过程中，应保持适宜的温度和湿度，避免微生物的生长和繁殖。
在运输中，应采取措施避免交叉污染。
3. 采用适当的杀菌技术在生产过程中，应采用适当的杀菌技术对牛奶进行处理，如加热灭菌、紫外线辐照和过滤等，以确保牛奶的安全性和卫生质量。
4. 严格控制产品质量生产企业应建立健全的质量管理体系，制定严格的产品标准和质量控制程序，严格把关生产环节，确保产品的卫生安全。
电阻抗法快速检测鲜牛奶中细菌总数
"
引
言
检验工作的要求。 同传统平板计数法相比，电阻抗法检测细菌总 数是根据微生物生长代谢将培养基中蛋白质和碳水 化合物转变为氨基酸及乳酸等，引起培养基电阻抗 微弱的变化，通过仪器记录阻抗改变的 Z, 时间 ) Z, 为致死时间 + 来测定微生物的存在及计数 [ # \ 。采用阻 抗法快速检测鲜牛奶中细菌总数，经近 ! 年的实践 证明，不仅可大大缩短检验周期，保证对鲜牛奶的 卫生监控，而且操作简便，结果准确可靠。
参 考 文 献 ：
M&N M(N 刘以贤 5 大食品检验中微生物快速检测法与国家标准方法对比 实验 M Q N 5 工业微生物系统介绍 （ 第 ( 版），<+ B <7D 戴金华，张长泉 5 以阻抗法快速检测食盒餐中之生菌数及大肠 杆菌群 M R N 5 食品科学，&77> ，(( （ + ）：@>7 B @+>5
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结果与讨论
电 阻抗法检 测鲜牛 奶中细 菌总数 标准曲 线的 建立 以 ,$-"#./"/0 仪 检 测 &>6 个 不 同 细 菌 浓 度 的 鲜
*
结
论
奶 样 9: 值 ，与 传统 平 板计 数细 菌 总数 的对 数 值对 应，从而得到细菌数对数值与 9: 时间的标准曲线如 图 & 所示。
收稿日期：!""# ’ "% ’ !( 作者简介：易敏英 ) #$*$ ’ + ，女，助理工程师，从事食品微生物 检测方法的研究。
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#/ #Βιβλιοθήκη 材料与方法材料与仪器
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总第 #&! 期） !""# 年第 !$ 卷第 % 期 （
TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌
TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌艾鹏飞;王珊;高辉明;王雁伟;庞艳荣;张萌【期刊名称】《中国食品学报》【年(卷),期】2024(24)5【摘要】建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。
依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。
结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。
本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。
【总页数】8页(P373-380)【作者】艾鹏飞;王珊;高辉明;王雁伟;庞艳荣;张萌【作者单位】河北科技大学食品与生物学院【正文语种】中文【中图分类】J62【相关文献】1.水产品中食源性病原菌多重PCR快速检测方法的建立2.生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立3.多重荧光定量PCR快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌4.3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立5.4种常见食源性病原菌多重PCR检测技术研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验四 液态奶中几种常见食源性病原菌的多重PCR检001
实验二液态奶中几种常见食源性病原菌的多重PCR检测一、实验目的掌握多重PCR反应的基本原理，以及应用多重PCR同时检测食品中沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见食源性病原菌的方法。
二、实验原理多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段的方法。
采用本技术可同时检测多种病原微生物。
在实验过程中，首先可以采用选择性增殖、离心沉淀、滤膜过滤等方法同时富集目标微生物，然后提取它们的DNA，再添加多对引物，同时扩增目标菌靶DNA的特异性序列，并用电泳法检测扩增结果。
本实验以食品中常见的沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为检测对象，选择沙门菌inv A基因(编码侵染上皮细胞表面蛋白)、大肠杆菌户pho A基因(大肠杆菌的持家基因)和金黄色葡萄球菌nuc基因(编码耐热核酸酶)为PCR靶基因，采用多重PCR对这些基因进行同时扩增，以实现对这些微生物的同时检测。
三、仪器与试材1．仪器与器材PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、台式离心机、微量移液器。
2．阳性菌种、培养基、引物(1)阳性菌种：沙门菌CMCC50051、大肠杆菌HZFS2001和金黄色葡萄球菌ATCC6538。
(2)培养基：乳糖肉汤。
(3)多重PCR引物：选择沙门菌衙inv A基因(编码侵染上皮细胞表面蛋白)、大肠杆菌pho A基因(大肠杆菌的持家基因)和金黄色葡萄球菌nuc基因(编码耐热核酸酶)为PCR靶基因。
3．溶剂与试剂PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、正向和反向引物、Taq DNA聚合酶、TE缓冲液(pH=8．0)、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、DNA Marker、10％SDS、蛋白酶K、氯仿一异戊醇(24：1)、酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)、无水乙醇、营养肉汤。
4．实验材料3～4种液体奶，各50mL。
四、实验步骤1．增菌取10mL样品，加入90mL营养肉汤中，于37℃摇床(150r／min)培养16h。
2．DNA提取(1)取上述增菌液10mL，以10000r／min离心5min，弃上清液后，加入565μL TE 缓冲液，用吸管反复吹打沉淀，使之重新悬浮。
牛奶中微生物的检测
牛奶中微生物的检测一．目的和原理本试验采用标准平板计菌法及显微镜下直接计菌法对不同品质的牛奶中细菌总数进行检测。
与此同时，还采用选择性很强的鉴别培养基去氧胆酸盐琼脂平板对牛奶中可能存在的粪便污染指示菌大肠菌群进行检测。
这种培养基可抑制绝大多数非大肠菌群细菌的生长，大肠菌群细菌还可发酵培养基中的乳糖产酸，在培养基内指示剂的作用下菌落呈红色，而不发酵乳糖的其它细菌则呈白色，因此很容易加以鉴别并作计数。
牛奶中的微生物，在贮存过程中可不断增殖，同时降低了溶解氧浓度，使氧化还原电位大大下降。
我们可用美蓝还原酶试验来检测这一变化，当牛奶因微生物大量增殖而处于厌氧还原环境时，氧化还原指示剂美蓝即被脱色。
通过测定牛奶样品中美蓝被还原脱色的速度，即可得知所测牛奶的质量。
二、材料与器皿(一)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基去氧胆酸盐琼脂培养基培养基配制1.去氧胆酸盐琼脂培养基蛋白胨10.0g 乳糖10.0g 去氧胆酸钠1.0gNaCl 5.0g K2HP04 2.0g 柠檬酸铁1.0g柠檬酸钠1.0 g 中性红(1％溶液3ml) 0.03g琼脂20.0g pH 7.32.肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏0.3g 蛋白胨1g 氯化钠0.5g琼脂2g 自来水100mLpH 7.0～7.2 灭菌1.05kg/cm2，22min(二)不同质量的生乳各10ml，(三)显微镜、试管架、水浴锅、铁丝架，(四)灭菌移液管、灭菌9ml稀释水试管、载玻片、血球计数移液管、载玻片、无菌带塞试管，(五)试剂-二甲苯、95％酒精、1：25，000美蓝溶液。
三、方法与步骤(一)牛奶巴斯德消毒法取生乳5ml装试管内，放在61.7℃的水浴锅内加热30分钟，水平面必须高于牛奶的平面。
注意处理时间必须准确，水浴温度要始终一致，并不时摇动试管，使管内牛奶均匀受热。
(二)标准平板计菌法1、取未经消毒的生奶，充分摇混，使样品呈均匀状态。
以十倍稀释法，将生奶稀释成10-1、10-2、lO-3、lO-4、10-5系列，2、从最大稀释度开始，各取lmll0-3、10-4、10-5的生奶稀释液，分别放入已标记好的培养皿内：将肉膏蛋白胨琼脂培养基融化，待冷至45℃左右时，在火焰旁倒入培养皿内，迅速盖好，放在桌面上轻轻摇转，使稀释的样品与培养基均匀混合，待平板冷却固化后，倒置，于30℃培养2天。
奶制品加工中致病菌的检测及预防策略研究
奶制品加工中致病菌的检测及预防策略研究引言：一、奶制品加工中常见的致病菌分类常见的奶制品中致病菌主要包括致病性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等。
这些菌种在适宜的环境条件下能够繁殖并产生毒素，对人体健康造成危害。
二、奶制品加工中致病菌的检测方法1.常规生化方法：通过对培养基中菌落的生长情况、形态特征、生物学性状进行观察，利用生化反应来鉴定致病菌。
2.分子生物学方法：包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、基因测序等，可对致病菌进行灵敏、快速、精确的检测和鉴定。
3.免疫学方法：主要利用免疫学原理和方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹法等，对致病菌进行检测和鉴定。
三、奶制品加工中致病菌的预防策略1.严格控制原料质量：选择优质、新鲜的奶源，注意防止受污染的奶进入加工环节。
2.消毒和清洗措施：加工设备、容器和工作人员的消毒和清洗工作要到位，保持操作环境的卫生。
3.合理的加工工艺控制：控制加工过程中的温度、时间和压力等参数，有效杀死和抑制致病菌的繁殖。
4.强化环境监测：定期对加工车间进行微生物监测，及时发现和处理潜在的细菌污染源。
5.严格质量检验：对于成品奶制品，要进行严格的检验，确保产品的安全性和符合相关标准。
6.培训和教育工作：加强员工健康教育培训，提高其对食品安全和卫生的重视程度，培养良好的操作习惯。
结论：奶制品加工中致病菌的检测及预防措施对于确保产品质量和食品安全具有重要的意义。
通过合理选择检测方法和预防策略，能够有效地防止致病菌的污染和繁殖，保障公众健康。
同时，加强监管、推行国家标准和行业规范，也是确保奶制品安全的关键措施之一。
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牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立
食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微
生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引
起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。
在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至
达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏
菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,
且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有:
奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特
菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。
志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,
该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常
见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导
等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重
HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门
氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守
序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。
进一步经过引物筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓
度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。对多重LAMP反应体系进行
特异性和灵敏度检测。
在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生
特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。在灵敏度检测中单增李斯特菌
的灵敏度为23fg/μl,沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度为250fg/μl,相较PCR灵敏
度提高了一个数量级。
将三种致病菌菌液稀释成不同浓度,并污染牛奶样品,煮沸法提取基因组
DNA,进行多重LAMP检测。单增李斯特菌的最低检出限为9.47×101 CFU/ml,沙
门氏菌的最低检出限为4.1×102 CFU/ml,志贺氏菌的最低检出限为5.33×101
CFU/ml。
2.针对单增李斯特菌hly基因、沙门氏菌fim基因和志贺氏菌ipaH序列的
高度保守序列设计引物,根据扩增产物的溶解温度选择引物,经引物浓度和温度
优化,建立针对三种食源性致病菌的多重HAND-HRM反应体系。对多重HAND-HRM
反应体系进行特异性、灵敏度和稳定性检测。
在特异性检测中含有目标菌的模板出现熔解曲线峰,空白对照和非目标菌均
未出现熔解曲线峰,判断该多重HAND-HRM反应体系特异性强。在灵敏度检测中单
种致病菌检测灵敏度分别为:单增李斯特菌和沙门氏菌的灵敏度为10fg/μl,志
贺氏菌的灵敏度为1OOfg/μl。
三种致病菌在同一体系中检测的灵敏度为:三种致病菌均为100fg/μl。在
稳定性评价中,Tm值的组内CV值分别为:单增李斯特菌0.10%-0.25%,沙门氏菌
0.04%-0.22%,志贺氏菌0.18%-0.69%。
Tm值的组间CV值分别为:单增李斯特菌0.16%-0.34%,沙门氏菌
0.27%-0.38%,志贺氏菌0.41%-1.18%。三种致病菌检测的组内和组间CV值较小,
说明该多重HAND-HRM体系的稳定性较强。
当三种致病菌模板浓度比例不同时,对多重HAND-HRM体系检测结果的影响
进行评价的结果表明,模板浓度都处于较低水平且相差过大时,高浓度模板对低
浓度模板的扩增有一定抑制作用,但通过增菌培养可以消除这种抑制。将单增李
斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌菌液稀释成不同浓度,污染牛奶样品,建立模拟污染
牛奶模型,煮沸法提取基因组DNA,进行多重HAND-HRM检测。
单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌的最低检出限为102 CFU/ml。在73份
实际样品检测中,多重LAMP检测体系检测灵敏度与国标法一致,多重HAND-HRM
体系的灵敏度甚至高于国标法。
在实际应用尤其是大量样本检测中,可先利用多重LAMP体系进行初筛确定
是否含有致病菌,再通过多重HAND-HRM体系确定含有何种致病菌。本研究建立的
快速检测体系特异性强、灵敏度高,稳定性强且成本低、易于操作,具有较强的应
用价值。