第5章 目的基因的制备
分子诊断学新
下划线代表的是增加的重点，倾斜代表暂时可以不看的内容第一章绪论1、分子诊断学：是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子的和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据。
2、个体化医疗：是指针对可能影响患者治疗效果的的个体因素和环境因素，做出适合不同患者的最佳处理和治疗方案。
第二章基因与基因组1、基因——DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。
2、基因组：广义：一物种的全部遗传物质及其携带的遗传信息。
狭义：单倍体细胞中的全套染色体（人：22条常染色体+ X，Y + 线粒体DNA）3、断裂基因：基因的编码序列在DNA上不是连续的，而是被不编码的序列隔开。
4、重叠基因：基因组DNA中某些序列被两个或两个以上的基因所共用。
基因重叠现象在病毒基因组中普遍存在。
5、跳跃基因：即转座子，在哺乳动物体内一般含有几十万个跳跃基因DNA；6、基因家族指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因7、假基因（pseudogene): 在多基因家族中有的成员并不能表达出有功能的产物，用ψ表示。
8、SNP：单核苷酸多态性指单个核苷酸变异而形成的DNA分子多态9、质粒：细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子10、转座因子又称转座元件（transposable element），是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列11、微卫星：广泛分布在原核和真核生物基因组中，常出现在基因的非编码区和染色体末端，重复序列长度仅为1—6bp，呈串联重复排列。
12、黏性末端:对于双链DNA病毒而言，基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分，称为粘性末端13、原核生物基因组的特点1.原核生物基因组：DNA原核生物基因组DNA较小,基因数目较少原核生物基因组中只有一个DNA复制起点;2原核生物的操纵子结构;操纵子结构是原核生物基因组的功能单位, 原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上;3.原核生物的结构基因多数是单拷贝基因，只有编码rRNA和tRNA的基因有多个拷贝;4原核生物结构基因的编码顺序一般不重叠;5.具有编码同工酶的不同基因6.GC含量差异大7.非编码区内主要是一些调控序列;8.具有可移动的DNA序列14、病毒基因组的结构与功能特征:1、帽子和poly(A)结构：帽子：1）对病毒基因组正链RNA具有保护作用，可以使病毒正链RNA或mRNA免受宿主细胞中的外切核酸酶的降解；2）病毒基因组RNA的帽子结构还与感染性有关，缺少它几乎完全丧失感染性；尾；保持和提高病毒基因组RNA在宿主细胞中的稳定性；与病毒的侵染性有关2、粘性末端；3、末端正向重复序列；4、末端反向重复序列5、重叠基因6、分段基因组7、LTR第三章分子克隆1、分子克隆：按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝，此过程称为分子克隆，也称基因克隆或DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
转基因技术
乳腺生物反应器 1987年，首次小鼠乳腺中表达组织型纤溶酶原激活剂 tPA 蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例 已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白 因子Ⅷ、蛋白质C等药用蛋白。国外经济学家预期，10年 后，转基因动物生产的药物销售额超过250亿美元。
14
基因药物生产
12
病毒载体法
动物病毒载体是较理想的真核基因工程 载体。 病毒DNA序列中有很强的启动子，可使 其后方的外源基因高产量和高频率地表达。 常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗 病毒载体、逆转录病毒载体等。
13
转基因动物的应用研究
改良动物 转移单个基因改良动物性状，未见成功报道，尚需对性状 表现的生化代谢途径，有关基因相互作用及基因定位整合， 基因定量表达、组织特异性表达等进行深入研究。
转基因与转基因动物
1982年，英国《自然》杂志发 表文章：有两个美国实验小组 利用转基因技术，将大鼠生长
激素重组基因导入到小鼠受精
卵中,培育出具快速生长效应的
“转基因超级鼠”。转基因鼠
比与它同胎所生的小鼠生长速
度快2～3倍，体积大一倍。
转基因超级鼠
3
转基因动物
获取外源目的基因 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养 系统和宿主动物
转基因技术
（Transgenic technology）
1
概念
转基因：
1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因 组中表达，引起生物体性状可遗传的修饰，称之 为转基因技术。
2）利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移 到其它物种中，改造生物遗传物质，使遗传物质 得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面 向人类需要的目标转变。 转基因动物： 以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内 2 稳定整合并能遗传给后代的一类动物
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
生物技术的五大内容的名称、概念(原理)与它们之间的关系
包埋法特点：
• 此法最简单，但一般不需要与酶蛋白的氨基酸残 基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶的回收 率较高； •仅适用于小分子底物和产物的酶 ，因为只有小分子 物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩 散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和活力 的降低。 • 固定后的酶活力不高，固定酶的牢度不强。
4.终止子
给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
5.表达产物的后加工
在真核细胞中，有时会将无活性的前体蛋白质进修修饰，使之具有活性
原核基因与真核基因调控的对比
原核基因 场所
细胞质，转录与翻译偶联，连续进行
真核基因
转录（细胞核） 翻译（细胞质） 分开进行 肽链） 多种调控序列协同作用 （顺式作用元件、反式作用因子）
动物细胞工程 细胞培养
细胞工程
植物细胞工程 按 对 象 分 类 按 技 术 分 类 细胞融合 细胞拆合 胚胎工程 染色体工程
微生物细胞工程
（发酵）
细胞融合
1.细胞融合的生物学基础、方法、 常用试剂与注意事项、各种方法的 适用对象 2.细胞融合（凝集素）的原理
动物细胞培养
1.动物细胞培养的基础、步骤(胰蛋
基因工程的流程
1.获取目的基因 2.制备载体 3.将目的基因与载体相连构建 重组DNA 4.将重组DNA导入受体细胞 进行表达与繁殖 5.筛选与鉴定目的基因
基因工程工具酶
——对基因进行剪切、拼接和组合
• 限制性内切酶:概念、特点、识别结构、切割方式 • DNA连接酶：连接磷酸二酯键 • DNA聚合酶：3个功能
酶的提取:在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，
使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提，即初步纯化。
生物技术制药重点及名词解释
生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰（RNAi）药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定（原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。
基因工程
二 DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定
常用的方法有紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法。
（一）紫外分光光度计法测定DNA、RNA的浓度和纯度
分子量在1-200kb之间 。
生命科学学院
一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
超螺旋DNA最快、线形DNA次之、开环DNA最慢。
OC
SC
Lห้องสมุดไป่ตู้
生命科学学院
一、质粒载体
质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
生命科学学院
四、人工染色体及其应用
(一)酵母人工染色体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭 载体。
YAC具有自主复制序列、克隆位点 以及可在细菌和酵母菌中选择的标记 基因。可以接受350-400kb的外源DNA 片段。
生命科学学院
一、质粒表达载体
二、Klenow片段 （一）基本性质 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N 端三分之二的大肽段，即Klenow片段。
Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5` 的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶活性。
生命科学学院
载体的概念
载体（vector) • 是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一 种遗传成分；基因工程中，携带目的基因进入宿 主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。 目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，在很大程度上决定于载体 。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
生物制药复习题
第一章绪论1、生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是（）、（）、（)2、生物技术制药发展历程经历了飞速发展的四个十年，分别是（）、（）、（）、（）。
3、生物技术所含的主要技术范畴有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和（）。
4、下列哪个产品不是用生物技术生产的（）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠5、我国科学家承担了人类基因组计划（）的测序工作A 10%B 5%C 1%D 7%6、生物技术7、生物技术药物8、生物技术制药第二章基因工程制药1、基因工程药物制造的主要步骤是：（）、（）、（）、（）、（）、（）。
2、目的基因获得的主要方法是（）、（）、（）、（）。
3、基因表达的微生物宿主细胞分为2大类。
第一类为（），目前常用的主要有（）；第二类为（），常用的主要有（）。
4、基因工程药物的分离纯化一般不应超过5个步骤，包括（）、（）、（）、（）和（）。
5、在基因工程药物分离纯化过程中，基因重组蛋白的分离比较困难，可用（）、（）、（）、（）的方法，达到初步分离的目的。
6、人工化学合成DNA新形成的核苷酸链的合成方向是（），合成的DNA 5’末端是（），3’末端是（）。
7、凝胶过滤法是依赖（）来分离蛋白组分A、分子大小B、带电状态C、分子质量D、解离状态8、可用于医药目的的蛋白质和多肽药物都是由相应的（）合成的A RNAB 基因C 氨基酸D 激素9、用反转录法获得目的基因，首先必须获得（） P13cDNA文库法A tRNAB cDNAC rRNAD mRNA10、那一类细菌不属于原核细胞（）A 大肠杆菌B 枯草芽孢杆菌C 酵母D 链霉菌11、基因工程菌的生长代谢与（）无关A 碳源B RNA聚合酶C 核糖体 D产物的分子量12、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源A 葡萄糖B 蔗糖C 甘油 D甘露醇13、下列那种色谱方法是依据分子筛作用来纯化基因工程药物（）A 离子交换色谱B 亲和色谱C 凝胶色谱 D气相色谱简答:1、基因工程制药的概念？2、什么是载体？载体主要有哪几种？3、质粒载体的三种构型是什么？质粒载体的性质？用于克隆表达质粒载体的三个要素是什么？4、目的基因常用的制备方法有哪四种？这四种方法的基本步骤是什么？5、影响目的基因与载体之间的连接效率的主要因素是什么？6、重组DNA导入宿主细胞常用的四种方法是什么？7、什么是重组子？重组子删选与鉴定的5种方法是什么？8、重组蛋白的四种主要的分离技术？重组蛋白四种主要的纯化技术？9、分离纯化工艺应遵循的原则？10、基因工程药物的改造目的及改造思路是什么？11、定点突变的三种类型？12、基因工程的质量控制要点？13、蛋白质含量测定的5种方法？14、什么是蛋白质的等电点？等电聚焦法的原理？15、大肠杆菌表达系统的优缺点。